Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Характеристика микробиоты ризосферы и ризопланы растений 12
1.2. Влияние ризобактерий на жизнедеятельность растений 21
1.3. Роль бактерий рода Pseudomonas в симбиотическом сообществе ризобактерий и растений 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Объекты исследования 36
2.1.1. Культуры микроорганизмов 36
2.1.2. Культура томатов Lycopersicon esculentum Mill. 37
2.1.3. Питательные среды для культивирования и идентификации ризобактерий 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Бактериологические методы иследования микробиоценоза ризосферы и ризопланы томатов 39
2.2.2. Молекулярно-генетический метод выявления нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК и гена trpA, детерминирующего синтез L-триптофана P. pseudoalcaligenes 43
2.2.3. Показатели межвидового взаимодейсвия в бактериальном блоке ризосферы и ризопланы томатов 47
2.2.4. Методы определения биологических свойств ризобактерий P.pseudoalcaligen es 49
2.3. Методы статистического анализа данных 53
Глава 3. Бактерии ризосферы и ризопланы Lycopersicon esculentum Mill . 54
3.1. Бактериальный комплекс прикорневой зоны Lycopersicon esculentum Mill. 54
3.2. Биологические свойства ризобактерий прикорневой зоны томатов 57
3.3. Численность ризобактерий в различные вегетационные периоды томатов 64
3.4. Частота встречаемости ризобактерий в различные вегетационные периоды томатов 71
3.5. ПЦР идентификация ризобактерий вида P.pseudoalcaligenes 73
Глава 4. Моделирование межвидового взаимодействия в бактериальном блоке ризосферы и ризопланы томатов в различные вегетационные периоды 80
4.1. Результаты определения показателя постоянства микроорганизмов 81
4.2. Характеристика видового разнообразия 84
4.3. Изменения индекса флористической значимости ризобактерий 86
4.4. Динамика индекса контагиозности ризобактерий 88
Глава 5. Особенности биологических свойств ризобактериальных штаммов P.pseudoalcaligenes 92
5.1. Поверхностные и колонизационно-адгезивные свойства ризобактериальных штаммов P. pseudoalcaligenes 92
5.2. Выявление гена, детерминирующего синтез L-триптофана P.pseudoalcaligenes 102
5.3. Антагонистические свойства P. pseudoalcaligenes по отношению к бактериальным фитопатогенам 109
Заключение 114
Список литературы 125
- Влияние ризобактерий на жизнедеятельность растений
- Биологические свойства ризобактерий прикорневой зоны томатов
- Динамика индекса контагиозности ризобактерий
- Выявление гена, детерминирующего синтез L-триптофана P.pseudoalcaligenes
Влияние ризобактерий на жизнедеятельность растений
Многие авторы отмечают высокую ризобактериальную эффективность флуоресцентныхпсевдомонад и ряда бацилл. Для данных ризобактерий показана высокая колонизирующая активность, способность к синтезу метаболитов-стимуляторов роста растения, что способствует достоверному увеличению урожайности сельскохозяйственных культур (Khalid et al., 2004). При инокуляции ризобактериями рода Bacillus лиственных культур выявилиускорение роста черенков на 42% (Erturk et al., 2010). Значительное увеличение урожайности яблонь отмечали при инокуляции штаммами Bacillus M3 и Microbacterium FS01(Karlidag et al., 2007).
Несмотря на важность микробиоты ризосферы и ризопланы для жизнедеятельности растений они могут участвовать в некоторых нежелательных процессах. В частности, поглощать питательные вещества, вносимые с удобрениями, что приводит к их повышенному расходу. Так, установлено, что на содержание ризосферных микроорганизмов растения тратят 30-50% продуктов фотосинтеза (Умаров, 2007).
Известны различные механизмы положительного влияния ризобактерий на растения. В настоящее время их делят на две группы – прямые и опосредованные (Моргун, 2009). К прямым способам воздействия на растения относят: ассоциативную азотфиксацию,образование ростстимулирующих веществ и легкоусвояемых форм железа, фосфора, что способствует их поглощению из почвы и доставку в растения, а также формирование специфических трофических связей и уменьшение уровня этилена. К непрямым способам относят предотвращение или уменьшение роста фитопатогенных почвенных микроорганизмов за счет выделения бактерицидных и антифунгальных метаболитов (Боронин, 2000; Штерншис и др., 2000; Benizri et al., 2001; Figueiredo et al., 2010).
Одним из наиболее изученных механизмов положительного влияния ризобактерий на растения является ассоциативная азотфиксация. Ранее функция азотфиксации приписывалась лишь некоторым бактериям, таким как – Azotobacter, Clostridium, Azospirillum, Beijeriпckia, Derxia. В настоящее время доказано, что способностью к фиксации азота из атмосферы отмечаются 80-90% всех известных бактерий (Фунг, 2015). К диазотрофам в настоящий момент относят представителей родов Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Pseudomonas, Enterobacter, Кlebsiella, Burkholderia, Flavobacterium, Campylobacter, Bacillus, Klebsiella, Erwinia, Clostridium, Escherichia, Citrobacter и другие (Егоров, 2003; Алексина, 2010; Chelins et al., 2000; Arkhipova et аl., 2004).
Почвенные микроорганизмы способны к фиксации азота и без ассоциации с растениями, однако доказано, что нитрогеназная активность в таком случае значительно ниже. Показано, что в прикорневой зоне проростков риса азотфиксация происходит в 50 раз активнее, по сравнению с данным бактериальным процессом без ассоциации с растениями (Фунг, 2015).
В.С. Юргина (2010), в то же время, утверждает, что для повышения продуктивности растений с помощью ассоциативных азотфиксаторов большое значение имеет первоначальная обеспеченность растений минеральным азотом. Автор предполагает, что дефицит минерального азота в почве приводит к снижению листовой поверхности растения и его фотосинтетической активности, что ведет за собой снижение экзометаболической активности корневой системы, необходимой для питания бактерий ассоциантов.
Г.А. Воробейников с соавторами (2011) также считают важным условием успешной растительно-бактериальной ассоциации обеспечение достаточного минерального питания и оптимальной дозой азота в почве с низким содержанием гумуса по их мнению является 60 кг N/га.
Многочисленные работы посвящены ассоциации азотфиксирующих микроорганизмов с различными представителями злаковых растений (Воробейников, 2011; Кириченко, 2011).
Для бактерий рода Azospirillum доказана азотфиксирующая роль в ассоциации с такими растениями как, кукуруза, рис, сахарный тростник, сорго и кормовые травы (Фунг, 2015). Из ризосферы ржи изолировали различные диазотрофы с высоким потенциалом азотфиксации: Azospirillum, Enterobacter, Bacillus, Azotobacter, Pseudomonas, Arthrobacter, в том числе Agrobacterium (Волкогон, 2001). Аэробные азотфиксаторы семейства Azotobacteriaceae -Azotobacter и Beijerinckia были обнаружены в прикорневой зоне кукурузы, овса, сои и сахарного тростника (Кириченко, Коць, 2011).
К важнейшим механизмам эффективного растительно-микробного симбиоза относится синтез ризобактериями фитогормонов. Доказана способность ризобактерий синтезировать фитогормональные вещества, способствующие регулированию роста и развития растения, а также установлению связей растения с почвенными микроорганизмами (Моргун, 2009). Известны основные группы фитогормонов, синтезируемые ризобактериями – ауксины, гибберелины, цитокинины, абсцизовая кислота и другие (Кудоярова, 2011).
Типичным ауксином является индолил-3-уксусная кислота (ИУК), котораяоказывает влияние на корневую систему растения, а именно удлинение главного корня, развитие боковых корней и корневых волосков, сопровождающеесяизменением морфологии корней – их изгибанием, скручиванием и ветвлением (Casson et al., 2003; Khalid et al., 2004; Wittenmayer et al., 2005). Кроме того, синтез ауксинов инициирует деление клеток, их дифференциацию и растяжение. Это может иметь значение для ускоренного роста, потребления питательных элементов и устойчивости растения к стрессам (Цавкелова и др., 2005).
Существуют данные, что продукция ризобактериальными штаммами ауксинов повышает вероятность образования растительно-бактериальной ассоциации, тем самым помогая растению пережить неблагоприятные стрессовые условия (Олюнина, 2004).
Ризобактерии способны синтезировать ИУК из L-триптофаза через такие продукты как, индолил-3-ПВК, индолил-3-уксусный альдегид и другие (Koul, 2015). Известны некоторые почвенные микроорганизмы, способные к синтезу ауксинов из триптофана, их относят к родам Azotobacter, Azospirillum, Enterobacter, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas и др. (Моргун, Кириченко, 2009).
Многие авторы показывают влияние данного фитогормона на различные ростовые характеристики растений и их урожайность. Для ризобактерий рода Bacillus отмечают способность к синтезу ИУК и влияние на различные растения. Стимуляция корнеобразования и влияние на прорастание семян ризобактерий данного рода с помощью синтеза фитогормона ауксина показано для орхидных (Шеховцова, 2011).
Стимуляция роста корневой системы и стебля, а такжеувеличение количества молодых побегов отмечали при инокуляции ризобактериями рода Bacillus ямса (Dioscorea rotundata L.), при этом объясняли данное влияние продукцией ИУК (Swain et al., 2007). Увеличение урожайности различных сельскохозяйственных культур установлено при использовании микробиологического удобрения «Экстрасол» на основе Bacillus subtilis, который способен к синтезу ИУК (Чеботарь с соавт., 2007).
Ризобактерии рода Azotobacter показаны как активные продуценты фитогормона ауксина, влияющие на длину корня пшеницы и массу проростка (Ahmad 2005; Khalid et al., 2004). Достоверное увеличении веса корневой системы и надземной части, а также лучшее цветение различных сельскохозяйственных растений отмечали при инокуляции ризобактериями рода Azospirillum (Dobbelaere et al., 2001).
В.В. Моргун (2009) с соавт. доказали, что инокуляция проростков пшеницы ризобактериями оказывала стимулирующее действие на рост корней, а также массу сухого вещества и удлинение проростков, отмечая корреляционную зависимость между увеличением ростовых характеристик растения и синтезом ауксинов ризобактериями in vitro. Н.П. Ковалевская (2015) также отмечала выраженное комплексное влияние ризобактерий Pantoea на развитие корней и побегов пшеницы, что совпадало с максимумом синтеза бактериями ИУК.
Установлено, что при низком содержании триптофана в среде микроорганизмы характеризуются низкой синтезирующей активностью ИУК, а при экзогенном введении триптофана продукция данного фитогормона увеличивается в десятки раз (Цавелкова, 2006, Моргун, 2009). Так было отмечено повышение ауксинобразующей активности в 14 раз при обогащении среды триптофаном (Моргун, 2009). Изучена способность Klebsiella planticola ТСХА-91 синтезировать индолил-3-уксусную кислоту из триптофана. Отмечали увеличение роста и количества корней фасоли (Блинков, 2013).
Несмотря на то, что большое количество авторов отмечают влияние ауксинов на стимуляцию удлинения и роста корней, увеличение урожайности растений, известно, что синтетические экзогенные ауксины тормозят рост корней в длину (Stepanova et al., 2007; Teale et al., 2005). Л.Н. Олюнина с соавт. (2004) отмечают, что при высокой концентрации экзогенной ИУК ауксиновый метаболизм сдвигается в сторону распада и снижения уровня эндогенной формы фитогормона. Также известно, что суперпродуцентами индолил-3-уксусной кислоты являются фитопатогены, которые оказывают ингибирующее действие на растения (Duca D., 2014).
Биологические свойства ризобактерий прикорневой зоны томатов
A.calcoaceticus обладал подвижностью, вид. A. iowffii не имел способности к движению. Были не требовательны к питательным средам (МПА). На питательных средах образовывали непигментированные или желто-бежевого цвета колонии маслянистой консистенции, выпуклые, блестящие с ровным краем, на среде Эндо образовывали лактозонегативные колонии (рис. 3б).
На кровяном агаре давали выпуклые серовато-белые колонии с зоной -гемолиза. Представители данного рода обладали типичными биохимическими свойствами неферментирующих бактерий (табл. 6).
Семейство Alcaligenaceae, представленное одним видом A.faecalis – по морфологическим свойствам представляли собойкороткие одиночные грамотрицательные палочки (рис.4). Проба Шукевича на подвижность положительная, рост бактерий по поверхности скошенного агара. На питательных средах давали рост в виде непигментированных колоний. На кровяном агаре образовывали прозрачные мелкие колонии. Данный вид обладал типичными биохимическими свойствами (табл. 6).
Семейство Shewanellaceae включало один вид S. putrefaciens на МПА данные микроорганизмы давали рост в виде полупрозрачных слизистых выпуклых колоний, размером 2,3±1,4 мм. На агаре Мак Конки образовывали колонии желто-коричневого цвета. Бактерии обладали подвижностью. По граму окрашивались отрицательно, имели палочковидную форму. Микроорганизмы обладали типичными биохимическими свойствами.
Семейство Micrococcaceae было представлено в ризосфере и ризоплане томатов одним видом A. globiformis. Данные бактерии имели вид грамположительных кокковидных клеток не способных к образованию эндоспор. На плотных питательных средах образуют бесцветные круглые гладкие колонии, с ровным краем, диаметром 1,5 - 2,0 мм (табл.6).
Виды семейства Pseudomonadaceae - P. pseudoalcaligenes и P. fluorescens имели вид неспоробразующих прямых или изогнутых грамотрицательных. Изучение культуральных свойств показало, что данные микроорганизмы на среде Эндо образовывали кремовые лактозонегативные колонии (рис.5), на кровяном агаре отмечали рост в виде серо-белых колоний,обладали подвижностью.
Для видовой идентификации бактерий рода Pseudomonas определяли флюоресценцию в УФ свете и биохимические тесты (табл.7).
Семейство Burkholderiaceae представлено видом B.mallei. Имели вид грамотрицательных тонких, слегка изогнутых палочек с закругленными концами.
Не обладали подвижностью и способностью образовывать споры. На питательных средах отмечали рост в виде серых гладких прозрачных колоний. По биохимическим свойствам не разжижали желатин, не ферментировали мочевину, давали отрицательную пробу на лизиндегидролазу, оксидазоотрицательные.
Семейство Enterobacteriaceae было представлено двумя родами Enterobacter и Klebsiella.
Представители рода Enterobacter – имели видпрямых мелких грамотрицательных неспорообразующих палочек. Посев по методу Шукевича давал рост по всей поверхности агара, что характерно для обладающих подвижностью микроорганизмов. При посеве на среду Эндо дают рост в виде малиновых лактозопозитивных колоний (рис.6а).
K.mobillis – были представлены прямыми,крупными неподвижными палочками, расположенными одиночно,в парах или в коротких цепочках. Обладали способностью к капсулообразованию. Изучение культуральных свойств показало способность данного вида расти на простых питательных средах, на среде Эндо образовывали лактозопозитивные колонии (рис.6б).
Для видовой идентификации E. intermedius, E. aerogenes и K. mobillis опрежеляли их биохимические свойства (табл.8).
Виды, относящиеся к семейству Bacillaceae имели вид грамположительных палочковидных подвижных микроорганизмов, способных образовывать эндоспоры.
Изучение культуральных свойств рода Bacillus показало их способность расти на простых питательных средах (МПА) с образованием серовато-белых колоний с неровным краем, на кровяном агаре образовывали белые крупные колонии без зон гемолиза (рис.7).
Следовательно, изолированные штаммы ризобактерий обладали типичными морфологическими, тинкториальными и культурально-биохимическими свойствами.
Динамика индекса контагиозности ризобактерий
Индекс контагиозности показывает равномерность распределения видов в пространстве на единицу площади (Сытник, 1989). Степень контагиозности равная единице свидетельствует о случайном распределении бактерий, выше единицы – о групповом распределении и меньше единицы - равномерном видовом распределении прикорневой зоны томатов.
Установлено, что характер распределения микроорганизмов в исследуемых биотопах разнообразен (табл.20).
Равномерное распределение характерно для следующих групп ризобактерий - Acinetobacter, Arthrobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Enterobacter и Bacillus, значение индекса контагиозности данных групп бактерий было меньше единицы. Для Alcaligenes, Shewanella и Klebsiella характерно случайное распределение в биотопе, значение их индекса контагиозности в ризосфере и в ризоплане было близко к единице.
Отмечали изменение индекса контагиозности представителей микробиоты ризосферы и ризопланы томатов в зависимости от вегетативного периода растения. В фазу всходов равномерным распределением в биотопе характеризовались группы ризобактерий - Acinetobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Enterobacter и Bacillus. В фазу бутонизации, цветения и плодоношения группы Arthrobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Enterobacter и Bacillus.
Достоверный рост индекса контагиозности ризосферы в процессе развития растения отмечали у бактерий родов - Arthrobacter, Pseudomonas, Burkholderia и Enterobacter. Показатель контагиозности ризобактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter, Burkholderia и Enterobacter в фазу плодоношения превышал данный показатель, полученный в фазу всходов, практически в 2 раза. Ризобактерии рода Bacillus имели иную динамику. Показатель индекса контагиозности в процессе вегетации томатов снижался в фазу плодоношения по сравнению с начальным периодом в 2,2 раза. Динамика уровня индекса контагиозности ризопланы аналогична с изменением данного показателя в ризосфере томатов.
Установлено, что в микробиоте ризосферы и ризопланы томатов выявлено достоверное увеличение контагиозности представителей доминантной микробиоты, что свидетельствует о равномерном участии в горизонтальной структуре микробного сообщества основных симбионтов биоценоза. Максимальные значения индекса контагиозности выявлены у ризобактерий рода Pseudomonas.
Таким образом, анализ межвидивого взаимодействия в группе бактерий ризосферы и ризопланы томатов показал, что изменения проявляются на уровне экосистемы и носят последовательный характер. В результате экологического мониторинга микробиоты ризосферы и ризопланы L. esculentum Mill. в различные периоды развития установлено, что основа исследуемой бактерийльной группы представлена видами - P.pseudoalcaligenes, P. fluorescens, A.globiformis и E.aerogenes. Виды, являющиеся доминантными в ризосфере и ризоплане томатов, характеризовались равномерным участием в горизонтальной структуре бактериальной ассоциации и ростом индекса контагиозности в процессе вегетации томатов. У ризобактерий P.pseudoalcaligenes выявлен максимальный показатель постоянства на протяжении всех периодов вегетации томатов.
Максимальные значения индекса контагиозности и флористической значимости в течение всего развития томатов выявлены у ризобактерий рода Pseudomonas. Показано, что видовое разнообразия бактериальных ассоциаций ризопланы выше данного показателя ризосферы на протяжении всего вегетативного развития томатов более чем в два раза. Кроме того, происходило снижение видового разнообразия как в ризосфере, так в ризоплане в процессе вегетации томатов.
Выявление гена, детерминирующего синтез L-триптофана P.pseudoalcaligenes
Синтез ризобактериями фитогормонов является одним из наиболее эффективных механизмов влияния на растения по (Koul V., 2015).
Ризобактерильная индолил-3-уксусная кислота (ИУК) оказывает воздействие на развитие корневой системы, что приводит к ускоренному росту растения, лучшему усвоению питательных веществ из почвы. Данный фитогормон также способствует формированию растительно-бактериальной ассоциации и устойчивости растения к неблагоприятным условиям (Олюнина, 2004).
Известно, что L-триптофан является предшественником фитогормона ИУК (Цавкелова и др., 2005). В связи с этим далее опледеляли способность синтезировать триптофан ризобактериальными штаммами P.pseudoalcaligenes. Для этого использовали метод ПЦР с детекцией результатов в режиме realime.
С помощью баз данных GeneBank (США), EMBL (Европейская молекулярно-биологическая библиотека) был изучен генетический состав ризобактерий, выделенных из прикорневой зоны томатов и найдены два гена P.pseudoalcaligenes, ответственные за синтез L-триптофана –trpA.
Исследование нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих экспрессию предшественника фитогормона ауксина – L-триптофана проводили в культуре Pseudomonas pseudoalcaligenes, выделенной из прикорневой зоны томатов (в разные фазы вегетации). В качестве контрольного микроорганизма был использован штамм Pseudomonas pseudoalcaligenes B4342, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ФГУП Гос НИИГенетика). Исследуемые нами гены не являются уникальными для вида Pseudomonas pseudoalcaligenes, поэтому был определен специфический участок данных генов доступных в базе данных GeneBank. К данным участкам были подобраны праймеры с помощью базы данных PrimerBLAST в режиме online (табл.23). В основе выбора праймеров мы руководствовались следующими требованиями:
– оптимальная длина праймера должна составлять 20–32 пары нуклеотидов;
– температура плавления праймера должна быть 60–70С;
– размер фланкируемого праймерами участка гена не менее 100 и не более 1000 п.о;
– количество GCв праймере должно составлять 40-60%;
– прймеры должны быть специфичными, для предотвращения вероятности неправильной интерпретации результатов. В случае подбора не специфичных праймеров в реакционной смеси синтезируются короткие и длинные участков неспецифической ДНК, которые могут привести к появлению нечетких полос -шмер. При подборе праймерой следует учитывать 3-конец участка праймера, так как достраивание комплементарной цепи ДНК Taq-полимеразов происходит с этого участка; разница температур плавления праймерной пары должна быть в пределах 2-4С.
Следовательно, данная праймерная система является специфичной для данного вида, что указывает на возможность ее использования для определения нуклеотидных последовательностей гена trpA.
Для проведения амплификации предварительно подготовили суспензию ДНК исследуемых бактериальных клеток, произвели очистку нуклеиновых кислот от посторонних веществ (ионов, ферментов, белков). Для очистки применяли различные методики: сорбентная с использованием гуанидинтиоционата, фенольно-хлороформная экстракция ДНК, лизис под действием температуры и осаждение клеточного детрина.
Концентрация и температура отжига праймеров были подобраны с помощью программ GeneRunnеrVersion 3.05 и PrimerBlast (ресурсы GeneBank). Выбранные пары праймеров проверялись на работоспособность и фактическую специфичность, а также производилась оптимизация режима проведения ПЦР на мyзейном штамме Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11 ( ВКПМ В-4347) (Табл. 24).
После окончания реакции производили детекцию продуктов амплификации, использовали метод горизонтального электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 2,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
Процесс электрофореза осуществлялся движением от катода(-) к аноду(+) в течении 20 минут при напряжении электрического поля 15 В/см. Визуальную регистрацию нуклеотидных последовательностей производили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм (рис.21).
Таким образом, выявлены гены ризобактериальных штамов P.pseudoalcaligenes, ответственные за синтез триптофана, который является предшественником фитогормона индолил-3-уксусной кислоты.
Для количественной оценки продуктов амплификации использовали исследование в режиме «реального времени» (PCR realime). Производили флюоресцентную детекцию искомых генов, для чего отмечали увеличение сигнала отделенного флуорофора в процессе амплификации. При этом нарастание данного сигнала прямо пропорционально концентрации синтезированных специфических продуктов ДНК-амплификации (табл.25).
Для данного исследования использовали краситель EVA Green, так как он не ингибирует работу ДНКaq-полимеразы. Детекцию продуктов амплификации выполняли по каналу Fam с максимумом поглощения-494 нм, максимумом испускания-521 нм.
Использовали протокол амплификации с детекцией на температурной полке 59С для амплификаторов с активным регулированием (по раствору в пробирке): ДТ-96 (ДТ-прайм), ДТ-322 производства "ДНК- Технология" (г. Москва).
Из таблицы 26 видно, что максимальная концентрация копий участков гена trp A наблюдалась у штаммов P.pseudoalcaligenes, выделенных из ризосферы растения в фазе плодоношения - 53 106 копий ДНК/мл. Минимальные концентрации участков искомого гена выявлялись у ризобактерий, выделенных из ризосферы томатов в фазе всходов. Данные показатели составили 0,8 104 копий ДНК/мл.