Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Методы, используемые для оценки силовых взаимодействий в биологии 12
1.1.1. Атомно-силовая микроскопия 12
1.1.2. Магнитный пинцет 13
1.1.3. Диэлектрофорез 14
1.1.4. Оптический пинцет 18
1.2. Использование оптического пинцета в биологических исследованиях 23
1.2.1. Нуклеиновые кислоты 23
1.2.2. Белки 25
1.2.3. Субклеточные структуры, органоиды 27
1.2.4. Эритроциты 27
1.2.5. Манипуляции в системе «прокариоцит – эукариоцит»
1.2.5.1. Система «прокариоцит – модель эукариоцита» 28
1.2.5.2. Система «модель прокариоцита – модель эукариоцита» 29
1.2.5.3. Система «модель прокариоцита – эукариоцит 29
1.3. Адгезины патогенных иерсиний 30
1.3.1. Установленные факторы адгезии иерсиний 31
1.3.2. Липополисахарид как возможный фактор адгезии иерсиний 33
1.3.3. Порины как возможные факторы адгезии иерсиний 36
Экспериментальные исследования 38
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Оборудование 38
2.2. Приготовление растворов 38
2.3. Определение вязкости ФБР 39
2.4. Штаммы и условия культивирования 39
2.5. Выделение ЛПС 39
2.6. Определение сухого веса 40
2.7. Определение содержания белка 40
2.8. Пробоподготовка эукариоцитов 40
2.9. Подсчёт клеток в камере Горяева
2.10. Использованные антителосодержащие препараты 40
2.11. Просвечивающая электронная микроскопия 41
2.12. Лазерный пинцет 41
2.13. Статистическая обработка полученных результатов 42
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 43
3.1. Отработка условий определения силы связи в системе «модель прокариоцита–макрофаг» методом оптической ловушки 43
3.1.1. Обоснование выбора клеточной культуры 43
3.1.2. Выбор эукариоцита в условиях эксперимента 47
3.1.3. Выбор частотного диапазона исключения при калибровке 48
3.1.4. Выбор фильтра, регулирующего интенсивность лазерного излучения 51
3.1.5. Построение калибровочных кривых 52
3.1.6. Оценка влияния макрообъекта на калибровочные коэффициенты 54
3.1.7. Калибровка на малом расстоянии от клеток 59
3.1.8. Отработка способа регистрации силы связи между микросферами и поверхностью макрофага 60
3.1.9. Критерии выбраковки первичных данных 62
3.2. Значимость поверхностных антигенов для адгезивности иерсиний, оценённая методом оптической ловушки 65
3.2.1. Оценка роли ЛПС как адгезина иерсиний 65
3.2.1.1. Сенсибилизация микросфер препаратами ЛПС 65
3.2.1.2. Обработка сенсибилизированных микросфер антителосодержащими препаратами 66
3.2.1.3. Верификация факта сенсибилизации микросфер препаратом ЛПС-10 66
3.2.1.4. Количественная оценка значимости ЛПС в адгезии иерсиний 68
3.2.2. Оценка роли порина OmpF как адгезина Y. pseudotuberculosis 78
3.2.2.1. Сенсибилизация микросфер препаратом порина OmpF 78
3.2.2.2. Верификация факта сенсибилизации микросфер препаратом порина OmpF 78
3.2.2.3. Количественная оценка значимости порина OmpF для адгезивности Y. pseudotuberculosis 81
Заключение 85
Cписок сокращений и условных обозначений 88
Список литературы
- Использование оптического пинцета в биологических исследованиях
- Штаммы и условия культивирования
- Выбор эукариоцита в условиях эксперимента
- Оценка роли порина OmpF как адгезина Y. pseudotuberculosis
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности. В настоящее время бактериальная адгезивность рассматривается как один из главных факторов реализации патогенного потенциала возбудителей инфекционных заболеваний на стадии первичного контакта с клетками организма хозяина [Cabrijan L., 2011; Bonazzi M., 2011; Hauck C.R., 2006; Hall-Stoodley L., 2004]. Изучение механизмов микробной адгезивности представляет значительный интерес для медицинской микробиологии, физиологии микроорганизмов, вакционологии, молекулярной биологии, эпидемиологии [Klinth J.E., 2012; Galy O., 2014; Lau P.C., 2009].
Род Yersinia включает три вида патогенных для человека грамотрицательных бактерий: Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis. Первые два вида являются энтеропатогенами, входными воротами для которых служит слизистая тонкого кишечника. Передаваясь алиментарным путём (с загрязнённой пищей или водой), они вызывают заболевания, протекающие с симптомами энтероколита с сопутствующими поражениями Пейеровых бляшек и регионарных лимфатических узлов, нередко переходящие в хроническую форму [Hill A., 2015; Galindo C.L., 2011]. У пациентов с иммунодефицитными состояниями отмечается генерализованная септическая форма, смертность от которой составляет около 50% для инфекции Y. enterocolitica [Cover T.L., 1989] и более 75% для псевдотуберкулёза [Deacon A.J., 2003].
Бактерии Y. pestis вызывают тяжелое системное заболевание, передаваемое либо через укус блох, либо аэрогенно. Практика специальных противоэпидемических мероприятий в отношении иерсиний имеет существенные недостатки. По-прежнему не разработаны вакцины к инфекциям, вызываемым Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, а используемая в настоящее время живая чумная вакцина EV обладает высокой реактогенностью, средства иммунохимической диагностики иерсиниозов недостаточно чувствительны и/или специфичны.
Наибольшее количество зарегистрированных случаев псевдотуберкулёза и иерсиниозного энтероколита отмечается в странах Северной, Центральной Европы, а также в Канаде [Galindo C.L., 2011]. В России, по данным Роспотребнадзора, общая заболеваемость псевдотуберкулёзом за 2014 и 2015 годы составила 0.98 и 0.77 на 100 тыс. населения, соответственно, что сопоставимо с такими инфекционными заболеваниями, как корь и менингококковая инфекция. Относительно высок показатель заболеваемости среди детей до 17 лет – 3.37 (2014 г.) и 2.79 (2015 г.) на 100 тыс. населения, соответственно.
Особую проблему представляет рост антибиотикорезистентности возбудителей инфекционных заболеваний. В связи с вышеизложенным необходимым представляется дальнейшее изучение на клеточном и субклеточном уровнях механизмов патогенеза инфекций, вызываемых бактериями рода Yersinia. Это относится прежде всего к начальной стадии заболеваний, а именно первичному контакту бактерии с клетками хозяина, значимости в этом взаимодействии поверхностных структур возбудителя.
Основным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий, покрывающим, по оценкам разных авторов, до 75% поверхности микроба, является липополисахарид (ЛПС) [Lu Q., 2011]. Такое высокое его содержание в наружной мембране и морфологическая картина его экспрессии на поверхности микробной клетки сами по себе предполагают участие ЛПС в первичном контакте бактерии и эукариоцита – положительное или даже отрицательное. Прямых экспериментальных данных об участии ЛПС в адгезивности бактерий к эукариоцитам практически нет, а вопрос о роли О-боковых цепей (О-антигена) в процессе адгезии и инвазии бактерий является предметом научной дискуссии. В части работ, выполненных с использованием
микробиологических методов, показана значимость О-антигена в процессах адгезии и инвазии бактерий (Shigella flexneri [Hoare A., 2012; West N.P., 2005; Kohler R., 2002], Salmonella enterica [Hoare A., 2006], C. jejuni [Kanipes M.I, 2004], E. coli [Klena J., 2005], P. aeruginosa [Zaidi T.S., 1996]). В работе Okamura [Okamura N., 1977], посвящённой изучению влияния О-антигена на адгезивные свойства Shigella flexneri, это отрицается.
Малоизученной остаётся роль в процессах микробной адгезии поринов – наиболее распространённых интегральных гомотримерных белков наружной мембраны (105 молекул на клетку) грамотрицательных бактерий [Rosenbusch J.P., 1974; Nikaido H., 1996]. Являясь многофункциональными белками, порины обеспечивают транспорт некоторых нутриентов и ряда ксенобиотиков, рецепцию бактериофагов [Liu X., 2001; Ceccarelli M., 2004; Zhao X., 2013], некоторые (например, Sfp из Y. enterocolitica [Mildiner-Earley S., 2006]) являются адгезинами.
При оценке адгезивных и инвазивных свойств бактерий широко используются
рутинные микробиологические методики [Darfeuille-Michaud A., 1990; Moroni O., 2006;
Jankowska A., 2008], дающие только общую, интегральную характеристику
бактериальной адгезии, и позволяющие лишь приблизительно судить о роли
конкретных поверхностных компонентов возбудителя в этом процессе. В настоящее время с этой целью всё чаще используются современные биофизические подходы, среди которых особое место занимают атомно-силовая микроскопия [Goulter R.M., 2009; Alsteens D., 2013] и метод оптической ловушки [Ikai A.I., 2010]. Существенным преимуществом последних является возможность создания и использования моделей прокариоцитов с заданными иммунохимическими свойствами. В качестве носителя в опытах с использованием оптической ловушки используются подложки из неорганического субстрата (золота) [Liang M.N., 2000], латексные [Fallman E., 2004] или полистироловые [Simpson K.H., 2003; Sieben C., 2012] микросферы,
Данные экспериментов, проведённых с использованием атомно-силового микроскопа, в которых изучалась значимость ЛПС в адгезии бактерии к неорганическому субстрату, недостаточны для объяснения процессов, лежащих в основе первичного контакта «микроб – эукариоцит». В любом случае для понимания механизмов взаимодействия макроорганизма с бактерией, роли в этом взаимодействии ЛПС, его химического состава необходимо проведение исследований, в которых вторым партнером системы, наряду с бактериальной клеткой (или моделирующей ее структурой, экспонирующей на своей поверхности исследуемый ЛПС либо его компоненты), является эукариоцит хозяина.
Несмотря на широкое применение метода оптической ловушки в молекулярно-биологических исследованиях белков, нуклеиновых кислот и их комплексов [Gutierrez-Medina B., 2009; Dholakia K., 2006; Lisica A., 2016], а также при изучении микромеханических свойств мембран клеток [Araya M., 2016], зависимость адгезивности бактерий, в том числе и рода Yersinia, к эукариоцитам от химического состава поверхностных структур возбудителей с помощью лазерного пинцета ранее не изучалась.
Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в исследовании значимости поверхностных антигенов (ЛПС и порина OmpF) в адгезивности Yersinia pseudotuberculosis к макрофагам J774 в модельной системе «прокариоцит – эукариоцит» методом оптической ловушки.
В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
-
Экспериментально обосновать методические подходы к иммунохимической функционализации микросфер для оценки значимости поверхностных антигенов Yersinia pseudotuberculosis в адгезивности бактерий;
-
Разработать способ регистрации силы взаимодействия между микросферами и поверхностью жизнеспособных эукариоцитов с помощью оптического пинцета;
-
Выявить роль О-боковых цепей ЛПС и порина OmpF в адгезивности клеток Yersinia pseudotuberculosis к макрофагам J774 методом оптической ловушки. Научная новизна. В ходе исследований разработаны методические подходы к
иммунохимической функционализации микросфер, основанные на их сенсибилизации антигенами иерсиний (ЛПС и порина OmpF) с последующей обработкой антителосодержащими препаратами различной специфичности. Обоснован способ количественной оценки сил связывания функционализированных микросфер с эукариоцитами методом оптической ловушки, подтвержденный получением патента №2604191; сформулированы критерии физического контакта между исследуемыми микросферами и эукариоцитами. С помощью лазерного пинцета установлена существенная роль О-боковых цепей ЛПС и порина OmpF в адгезивности бактерий Y. pseudotuberculosis к макрофагам J774.
Научно-практическая значимость. Полученные оригинальные результаты имеют важное научно-практическое значение для понимания роли ЛПС и порина OmpF Y. pseudotuberculosis в обеспечении адгезивности патогена к эукариоцитам. Разработанный способ регистрации силы взаимодействия модельных микросфер с клетками-мишенями может быть востребован в аналогичных исследованиях по оценке вклада того или иного антигена в адгезивную способность конкретного возбудителя, что может быть использовано при разработке лечебных, профилактических и диагностических препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработаны методические подходы к иммунохимической функционализации
полистироловых микросфер, позволяющие оценивать вклад поверхностных антигенов в
адгезивность бактерий к эукариоцитам методом оптической ловушки.
-
Экспериментально обоснован количественный способ оценки силы связи между макрофагом и функционализированными микросферами с использованием лазерного пинцета.
-
Установлена значимость в адгезивности бактерий Yersinia pseudotuberculosis О-боковых цепей липополисахарида и порина OmpF к макрофагам J774.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были изложены на II Всероссийской молодёжной научной конференции «Молодёжь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2013), XIII Всероссийской молодёжной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике», XI Всероссийском съезде по фундаментальным проблемам теоретической и прикладной механики (Казань, 2015), на V съезде биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015), на III Всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2016).
Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно.
Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались лично и
совместно с научным руководителем. Автор лично выполнял методики и обобщал
полученные результаты. Выводы сделаны на основе собственных оригинальных
данных. Микробиологические, иммунохимические исследования, работа с
перевиваемыми клеточными культурами проводились на кафедре биотехнологии
Вятского государственного университета (ВятГУ) и в лаборатории физиологии
микроорганизмов Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Киров),
просвечивающая электронная микроскопия, а также работы с лазерным пинцетом
выполнялись на базе НОЦ по направлению нанотехнологии ВятГУ. Выделение порина
OmpF производилось сотрудниками лаборатории молекулярных основ
антибактериального иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН (г. Владивосток).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, включая 4 статьи из списка ВАК, 8 тезисов в сборниках статей и материалов конференций и 1 патент на изобретение
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, который включает 265 наименований, из них 10 отечественных и 255 иностранных. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 5 таблиц.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному
руководителю – доктору медицинских наук Бывалову Андрею Анатольевичу профессору кафедры биотехнологии ВятГУ за всестороннюю поддержку в проведении исследований; доктору физико-математических наук, ведущему научному сотруднику Института биохимической физики РАН им. Н.М. Эммануэля Кононенко Вадиму Леонидовичу за ценные теоретические и практические рекомендации при проведении исследований с использованием лазерного пинцета; коллективу лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН за предоставленные образцы порина; коллективу кафедры биотехнологии ВятГУ за помощь и поддержку во время выполнения и обсуждения диссертационной работы.
Использование оптического пинцета в биологических исследованиях
Размеры некоторых объектов (ДНК, РНК, белковые молекулы), используемых при непрямых манипуляциях, не превышают длины волны лазерного луча, что создаёт определённые трудности при работе с ними. Большинство исследований структуры нуклеиновых кислот основано на измерениях сил, вызванных изменениями формы самих молекул. В роли неподвижной фазы (носителя) в таких исследованиях используются микрообъекты из синтетических полимерных материалов. Так, T.T. Perkins et al. [73] исследовали эластические свойства одноцепочечной ДНК путём прикрепления её молекул к двум латексным микросферам. Смещение столика с постоянной скоростью вызывало встречное давление жидкости на микросферу и вызывало растяжение молекулы ДНК. G.V. Shivashankar и J. Libchaber [74] в похожих опытах использовали систему, состоящую из ДНК, с одной стороны прикреплённой к кантилеверу, с другой – к поверхности силиконовой подложки. J. Liphardt et al. [75] использовали в аналогичном эксперименте вместо кантилевера АСМ оптическую ловушку. Подобный же способ использован M.L. Bennink et al. [76] при изучении взаимодействий в системе «ДНК – белок»: молекула ДНК с двух сторон связывалась с микросферами, покрытыми белками RecA и YOYO-1 посредством биотин-стрептавидиновых сшивок. G.J.L. Wuite et al. [77] похожим образом изучали взаимодействие ДНК с ДНК-полимеразой.
Следующая ступень организации ДНК – хроматин – детально изучена с использованием ОП Y. Cui и C. Bustamante [78]. Согласно предложенной ими схеме, два конца биотинилированного хроматинового тяжа соединялись с двумя полистироловыми микросферами, обработанными авидином. В дальнейшем одна из бусин, находившаяся в оптической ловушке, смещалась с помощью пьезостолика, вторая же удерживалась микропипеткой. В другой работе [79] для изучения разрывов двухцепочечной ДНК использовались кластеры из 40 латексных микрочастиц диаметром 0.2 мкм.
M.H. Larson et al. [80] и E.A. Galburt et al. [81], исследуя механизм бактериальной транскрипции, применяли пары бусин различного диаметра: к меньшей с помощью биотин-стрептавидиновой сшивки присоединялась молекула РНК, к большей – через диоксигенин-антидикоксигениновую – ДНК.
В работе [82], где исследовались микромеханические свойства ДНК, прикреплённой к двум полистироловым микросферам, удерживаемым двумя оптическими ловушками, авторы обращают внимание на возможность фотоповреждений молекул ДНК лазерным лучом. Исследования молекул РНК позволяют изучать вторичную и третичную их структуру, функциональную активность в процессах транскрипции и трансляции, а также изменения, возникающие в процессе молекулярного фолдинга [83]. Главным отличием от опытов с ДНК является использование гибридных ДНК-РНК-комплексов. В роли сшивок обычно используются стрептавидин-биотин или диоксигенин-антидиоксигениновые комплексы. J. Robert et al. [84], изучая вторичную структуру молекул РНК, гибридизовали их с двухцепочечной ДНК, которая, в свою очередь, прикреплялась к поверхности полистироловых микросфер и выполняла роль подвижного компонента модели. Аналогичным образом D. Li et al. [85] исследовали кинетику процесса фолдинга одноцепочечных молекул РНК, а L. Green et al. [86] – динамику процесса расплетания псевдовторичных структур РНК, формирующихся при некоторых вирусных инфекциях.
Взаимодействие двух белков – кинезина и тубулина микротрубочек – лежит в основе процесса транспорта везикул в клетках. В экспериментах подобного рода используется способность микротрубочек к самосборке при внесении в раствор димеров тубулина и активаторов (ионов Mg2+). При постановке классического опыта по исследованию таких взаимодействий S.M. Block et al. [87] использовали микросферы из диоксида кремния с нанесёнными на них молекулами кинезина. В роли неподвижной фазы выступали микротрубочки на поверхности предметного стекла, а оцениваемой характеристикой служила сила разрыва связи между кинезином и тубулином. K. Svoboda et al. [88] в аналогичном исследовании использовали наряду с оптическим пинцетом двухлучевой интерферометр (dual-beam interferometer). Задачей экспериментаторов в обоих случаях было зарегистрировать как можно больше циклов закрепления-отрыва микросфер от микротрубочек; величина «шага» кинезиновой молекулы по поверхности микротрубочки оказалась равной 8 нм. По такому же принципу была построена работа K. Svoboda и S.M. Block [89] по изучению зависимости силы разрыва связей от скорости отведения микросфер.
В других работах оценивали механические свойства кинезиновых молекул на примере стандартных моделей с использованием подвижной (микросфера) и неподвижной (подложка) фаз [90]. S. Jeney et al. [91] делали основной акцент на определении броуновских смещений микросфер, обработанных кинезином, которые предварительно прикреплялись к адсорбированным на стекле микротрубочкам. B. Gutierrez-Medina et al. [35] таким же образом оценивали степень скрученности кинезиновых молекул после резкого снижения мощности лазера в фазе натяжения.
Принципиально иная схема изучения силовых взаимодействий была предложена A.E. Butterfield et al. [92]. В частности, предлагалось удерживать микротрубочку, меченную биотином, двумя покрытыми стрептавидином микросферами. Далее, к микротрубочке подводилась более крупная микросфера, сенсибилизированная небольшим количеством кинезиновых молекул. Путём отведения столика добивались отрыва последней от фиксированной микротрубочки, оценивая при этом силу разрыва связи. Изучению силовых взаимодействий в системе «кинезин – тубулин» также посвящены работы [93 – 95].
Миозин, взаимодействуя с актином в составе микрофиламентов, обеспечивает протекание энергозависимых процессов мышечного сокращения, а также способствует перемещению везикул и более крупных органоидов внутри клетки. Изучение актин-миозиновых взаимодействий особенно важно при исследованиях функций цитоскелета и строения цитоплазматических микрофиламентов.
Общая схема постановки экспериментов с участием этих белков принципиально не отличается от таковой для кинезина и тубулина [96, 97]. Отметим лишь работу J.T. Finer et al. [98], в которой фиксированный на двух полистироловых микросферах актиновый филамент с помощью ловушек опускался на дно камеры, предварительно сенсибилизированное миозином. Такая операция приводила к возникновению взаимодействий между указанными белками. После этого осуществлялась процедура отведения микросфер и оценивалась сила связи между белковыми молекулами.
Штаммы и условия культивирования
В работе использовали штамм EV Y. pestis и штамм 1b Y. pseudotuberculosis (кат. № 474), полученные из коллекции Федерального казённого учреждения здравоохранения «Научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Бактерии Y. pseudotuberculosis выращивали во встряхиваемых колбах Эрленмейера с жидкой питательной средой на основе солянокислотного гидролизата казеина при температуре 10 С в течение 96 ч, Y. pestis – при температуре 27 С в течение 30 ч.
сухого веса в использованных препаратах осуществляли по Препараты ЛПС выделяли из культур иерсиний методом Вестфаля с помощью водно-фенольной экстракции [189] и очищали трёхкратным ультрацентрифугированием (105000 g, 3 ч); содержание в них примесных белков не превышало 1.5%. Препараты ЛПС, выделенные из культуры Y. pseudotuberculosis, обозначены далее символом ЛПС-10, из культуры Y. pestis – ЛПС-EV. 2.6. Определение сухого веса Определение методу [190].
Содержание белка в препаратах определяли по методу Лоури [191] по калибровочному графику, построенному с использованием бычьего сывороточного альбумина (10-100 мкг/мл).
В экспериментах с использованием лазерного пинцета использовали суточную культуру макрофагов J774 (линия получена из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН). Макрофаги смывали с поверхности флакона для культивирования смесью растворов Версена и трипсина (дважды по 2.5 мл), асептически пересевали на чашку "Fluorodish" диаметром 35 мм (WPI, USA) с 2 мл среды RPMI-1640, содержащей гентамицин (100 мкг/ мл), до конечной концентрации (10-30) 103 клеток/ мл, инкубировали в CO2-инкубаторе (5 % СО2) при 37 С в течение 18 ч.
Подсчёт числа эукариоцитов в камере Горяева осуществляли согласно методике, описанной в [192]. Оценку их жизнеспособности с трипановым синим проводили по методике [193].
Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКАт) были получены ранее. МКАт2 комплементарны эпитопам, расположенным на О-боковых цепях ЛПС [194], МКАт7 – на белковых компонентах наружной мембраны Y. pseudotuberculosis [195]. В работе также использовали поливалентную чумную агглютинирующую сыворотку (ПЧС) производства Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», которую получали путем гипериммунизации животного-донора (лошадь) культурой штамма EV Y. рestis. Для обработки микросфер использовали цельные (неразведенные) препараты ПЧС и асцитных жидкостей, содержащих МКАт2 или МКАт7. Для получения асцитных жидкостей культуры соответствующих гибридом в дозе (3-4)106 клеток внутрибрюшинно вводили мышам линии BALB/с и через 10 суток отсасывали и центрифугировали содержимое брюшной полости. Полученные надосадочные жидкости, обозначенные как МКАт2 и МКАт7, представляли собой использованные в работе асцитные жидкости.
Содержащая антитела к порину OmpF и интактная (нормальная) сыворотки были получены из лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН (г. Владивосток) от сингенных мышей линии BALB/с после их иммунизации препаратом порина OmpF.
Перед микроскопией исследуемые препараты микросфер, сенсибилизированных препаратами ЛПС-10 и БСА (контроль), термостатировали в течение 1 часа при 37 С с конъюгатом в объемном соотношении 1:1 и наносили на медные сеточки (200 меш, SPI Supplies, США), покрытые углеродной пленкой-подложкой, сорбировали 2 мин, убирали избыток жидкости фильтровальной бумагой, сушили препарат. Снимки получали на электронном микроскопе JEM-2100 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 160 кВ. Фотографирование осуществляли с использованием CCD камеры Keen View («Olympus», Германия).
Измерения сил отрыва сенсибилизированных микросфер от поверхности макрофагов выполнены методом лазерного пинцета с помощью прибора NanoTrackerTM JPK Instruments AG. В приборе использован инвертированный микроскоп Nikon Eclipse с объективом 60х, NA=1.2 и лазер с длиной волны 1064 нм для формирования оптической ловушки и регистрации смещений захваченной микросферы. Коэффициент жёсткости ловушки для полистироловой микросферы диаметром 1 мкм составляет 0.05–0.40 пН/нм, в зависимости от мощности лазера, регулируемой в пределах 0.20–1.45 Вт. Измерение коэффициента чувствительности КвФД, регистрирующего смещения микросферы, а также коэффициента жёсткости ловушки производится в автоматическом режиме на основе регистрации частотного спектра броуновских смещений микросферы в ловушке.
Вычисление среднего арифметического (М), стандартного отклонения и ошибки среднего проводили в программе Statistica 10.0 (Statistica software). Ряды измеренных значений силы отрыва микросферы от клетки анализировали путём вычисления средних значений и построения гистограмм распределения этих значений по количеству наблюдений. Аппроксимацию гистограмм непрерывными функциями распределения и построение соответствующих интегральных распределений выполняли методом ядерной оценки функции плотности (kernel density estimation) [196] с использованием программы Matlab 7.
Выбор эукариоцита в условиях эксперимента
Как указывалось в главе «Обзор литературы», в основе метода калибровки жёсткости оптической ловушки используемого в работе прибора лежит регистрация спектра броуновских смещений микросферы с учётом её диаметра, а также вязкости и температуры окружающей жидкости. Конечным результатом фурье-анализа является построение зависимости спектральной плотности мощности (S, В2/Гц) от частоты (f, Гц). Для определения значений угловой частоты (fc), из которой, в свою очередь, вычисляются адекватные поставленным экспериментальным задачам значения коэффициентов жёсткости, важно определить диапазоны учитываемых и исключаемых при расчётах частот. По умолчанию в нашем приборе при расчётах жёсткости ловушки учитываются
Изображённая на рисунке 5А кривая имеет два линейных участка – в области низких (до 0.4 – 0.6 кГц) и высоких (более 20 кГц) частот, а также широкий промежуточный диапазон от 0.6 до 20 кГц, в котором плотность спектра изменяется нелинейно. В последнем частотном диапазоне (как правило, в областях 0.4 – 1 кГц и 15 – 17 кГц) наблюдаются искажения кривой, приводящие, в свою очередь, к существенным искажениям расчётных значений жёсткости ловушки. Так, значения угловой частоты, по данным рисунков 5А и 5Б, и рассчитанные с их учётом коэффициенты жёсткости составили в первом случае – 5.945 кГц и 289.0 мкН/м, во втором – 5.097 кГц и 247.8 мкН/м. Уменьшение значений угловой частоты вызвано включением в диапазон регистрации начального участка -образного искажения в области 0.5 – 1.4 кГц. Для получения адекватных значений коэффициентов жёсткости необходимо было выбрать более широкий диапазон исключаемых частот. Для сравнения на рисунке 6 представлены результаты оценки разброса коэффициентов жёсткости для трёх исключаемых в каждом случае частотных диапазонов: 0.6 – 20 кГц, 0.4 – 20 кГц, 0.2 – 20 кГц при мощности лазера 1000 мВт.
Дисперсионный анализ значений коэффициентов жёсткости показал, что использование двух диапазонов исключаемых частот («0.4 – 20 кГц» и «0.6 – 20 кГц») приводило к увеличению дисперсии значений по одной из проекций калибровки. Так, в первом случае коэффициенты жёсткости ловушки по оси ОХ лежали преимущественно в узком диапазоне – 250–275 мкН/м, по оси OY разброс был сильнее – от 160 до 280 мкН/м. Аналогичное расхождение было получено при исключении частот от 0.6 до 20 кГц, но в этом случае больший разброс отмечался при определении коэффициентов жёсткости по оси ОХ (100–210 мкН/м) (Рисунок 6). Наименьший разброс коэффициентов в двух проекциях достигался при использовании диапазона исключения частот от 0.2 до 20 кГц. Последний был принят нами в качестве рабочего при проведении калибровки.
Технически разрешённый диапазон мощности лазера для используемого в работе прибора составляет от 20-30 мВт до 3 Вт в зависимости от свойств удерживаемого объекта и требований конкретной методики. Для увеличения точности регистрации мгновенных смещений объекта, особенно при работе с использованием лазера низкой мощности (менее 100 мВт), предусмотрена система фильтров (№№1–4), регулирующих поток излучения, падающего на КвФД, и, следовательно, величину общего напряжения на выходе. Согласно технической документации разрешённый диапазон напряжений на выходе с КвФД для нашего прибора составляет 1–9 В, предельный – до 11.2 В.
Учитывая особенности используемых в нашей работе объектов и вероятность фотоповреждения эукариоцитов при использовании лазерного излучения большой мощности, необходимо было выбрать подходящий фильтр для выбранного рабочего диапазона мощности от 50 до 1500 мВт. В таблице 4 представлены результаты определения суммарного напряжения, зарегистрированного КвФД при разной мощности лазера для двух случаев: при наличии микросферы в фокусе луча и при её отсутствии. Таблица 4 – Суммарное напряжение, зарегистрированное КвФД при использовании четырёх фильтров в опыте (микросфера в ловушке) и контроле (ловушка без микросферы)
Мощность, мВт Суммарное напряжение, зарегистрированное КвФД (В) при использовании фильтра №… при наличии (Да) или отсутствии (Нет) микросферы в ловушке 2 3 Да Нет Да Нет Да Нет Да Нет
При использовании фильтра №1 суммарный сигнал КвФД превышал максимальную регистрируемую величину 11.2 В. Аналогичные значения получены при использовании фильтра №2. Начиная с мощности в 200 мВт и ниже, сигнал входит в допустимый диапазон, не снижаясь до критически малого значения 1 В даже при мощности 50 мВт. При установке фильтра №3 отмечается допустимое напряжение в широком диапазоне мощности – от 1500 до 300 мВт с последующим снижением до значений, близких или меньших, чем 1 В. По этой причине для проведения последующих исследований нами был выбран фильтр №3. Использование фильтра №4 не оправдано по причине чрезвычайно низкого суммарного вольтажного сигнала во всём диапазоне мощности лазера.
Оценка роли порина OmpF как адгезина Y. pseudotuberculosis
Анализируя полученные результаты, отметим, что обработка микросфер некомплементарными сенситину антителами (микросферы «ЛПС-10+МКАт7» и «ЛПС-ЕV+МКАт2») приводила к изменению формы гистограмм (Рисунки 18 и 20). Вместе с тем, средние значения силы отрыва для микросфер «ЛПС-10» и «ЛПС-10+МКАт7», а также «ЛПС-ЕV» и «ЛПС-ЕV+МКАт2» разнились незначительно (Таблица 5). Зарегистрированное влияние обработки сенсибилизированных ЛПС микросфер гетерологичными антителосодержащими препаратами на форму гистограмм может объясняться наличием в препаратах сенситина некоторого количества примесных белков - выделенные и использованные в работе препараты ЛПС содержали до 1.5 % белка. Применительно к микросферам «ЛПС-10+МКАт7» помимо возможного специфического взаимодействия МКАт7 с примесным белковым эпитопом ЛПС-10 допустимо предположить и неспецифическое связывание антител с поверхностью сенсибилизированных микросфер. Так, для ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе и иерсиний, показана способность связывать иммуноглобулины в области Fc-фрагмента. Такие иммуноглобулинсвязывающие белки идентифицированы и в клетках Y. pseudotuberculosis [241]. Кроме того, нельзя исключить возможность неспецифического связывания с примесными белками сенситина отличных от антител компонентов асцитной жидкости мышей и поливалентной сыворотки лошади. Показано, например, что Psa-антиген Y. pestis способен связываться не только с Fc-областью антител, но и с аполипопротеином В100 неиммунной сыворотки человека [242]. С другой стороны, обсуждаемое изменение формы гистограмм может объясняться и неспецифическим взаимодействием компонентов асцитной жидкости и лошадиной сыворотки с целевым сенситином – молекулами ЛПС.
Известно, что химический состав ЛПС грамотрицательных бактерий, в том числе и представителей рода Yersinia, зависит от внешних условий, в частности, температуры, при которой происходят их рост и размножение [155, 243]. В свою очередь, химический состав ЛПС влияет на биологические свойства иерсиний [228]. С повышением температуры культивирования бактерий Y. pseudotuberculosis с комнатной до 37 С существенно снижается оснащенность ЛПС О-боковыми цепями [194, 243]. По-видимому, высокая концентрация О антигена на поверхности бактерий при относительно низких температурах может способствовать Y. pseudotuberculosis выживать в объектах окружающей среды: водоемах, почве, растениях, холоднокровных животных. Вместе с тем показана более выраженная вирулентность для лабораторных животных так называемых «холодовых» культур этого возбудителя по сравнению с культурами, выращенными при температуре 37 С [245], что может объясняться, в том числе, и повышенной экспрессией О-антигена на поверхности микробной клетки. О антиген, являясь компонентом ЛПС, в значительной мере определяет его вклад в патогенетический потенциал грамотрицательных бактерий, особенно на первых этапах взаимодействия с клеткой хозяина, участвует в нейтрализации бактерицидного действия сыворотки, катионных белков, проявлении антифагоцитарной активности, в том числе и путем влияния на экспрессию других факторов вирулентности [246–248]. Одно из общих проявлений вирулентных свойств энтеропатогенных иерсиний, с которым связывают наличие О-антигена, – колонизация тканей хозяина [244]. Вполне вероятно, что механизм названной колонизации опосредуется показанным в нашей работе участием О антигена в адгезивности Y. pseudotuberculosis к эукариоцитам. Полученные результаты подтверждают значимость О-антигена как одного из ключевых факторов патогенности этого возбудителя, обеспечивающих эффективность его первичного контакта с клеткой хозяина с последующим развитием инфекционного процесса.
Препарат порина в концентрации 0.69 мг/мл, хранившийся в 0.1%-ном растворе цвиттергента 3-14, предварительно диализованный против карбонат бикарбонатного буфера (КББ, рН=9.5), смешивали с суспензией полистироловых микросфер диаметром 1 мкм в концентрации 2.5% (вес/объём) в соотношении 1:2. Последующие процедуры идентичны тем, что использовались для сенсибилизации микросфер препаратами ЛПС. Полученный препарат микросфер обозначали как «OmpF».
Для верификации факта сенсибилизации микросфер препаратом порина OmpF использовались два методических подхода на основе ТИФА.
1. Лунки 96-луночного планшета сенсибилизировали препаратами микросфер «OmpF» и «БСА», предварительно раститрованных в КББ с двукратным шагом, начиная с разведения 1:10 до 1:160 (по 100 мкл). По окончании 18-часовой инкубации и трёхкратной отмывки в лунки добавляли 100 мкл препарата анти-OmpF сыворотки (1:1000) и инкубировали в течение 1.5 ч на шейкере (+37 С, 290 RPM). Далее, после трёхкратной отмывки добавляли 100 мкл кроличьего антимышиного конъюгата (1:1000), выдерживали 1 ч на термошейкере и вновь промывали лунки. Затем вносили по 100 мкл субстрата на основе о-фенилендиамина и выдерживали планшет в тёмном месте в течение 30 мин. Реакцию останавливали внесением 50 мкл 1%-ного раствора серной кислоты. Учёт результатов производили на микропланшетном ридере Anthos 2020» (Labtec, Австрия) при =492 нм.
2. Лунки 96-луночного планшета сенсибилизировали 100 мкл препарата порина OmpF (5 мкг/мл) в КББ в течение 18 часов и трижды промывали. Затем к 200 мкл разведений каждой сыворотки (1:4500) добавляли по 20 мкл суспензии микросфер «OmpF» и «БСА» и после 1 ч инкубации на шейкере (+37 С, 290 RPM) центрифугировали содержимое пробирок при 13000 g в течение 15 минут. Вносили в соответствующие лунки полученные надосадочные жидкости в объёме 100 мкл. Дальнейшая последовательность операций, начиная с внесения конъюгата, идентична описанной выше для первого способа.
По результатам иммуноферментного анализа разведённых методом титрования препаратов микросфер «OmpF» и «БСА» показано наличие достоверных разтличий в их иммунохимической активности (Рисунок 21А).
Показано также, что оптическая плотность в тех лунках, куда был внесён препарат надосадочной жидкости, полученной после инкубации микросфер «OmpF» с антисывороткой к порину в разведении 1:4500, уменьшалась в среднем в 2.5 раза по сравнению с контрольным препаратом этой антисыворотки в том же разведении (Рисунок 21Б). По результатам аналогичного опыта с контрольными микросферами «БСА» убыли оптической плотности по сравнению с антисывороткой к OmpF отмечено не было. Значения OD492 для контрольного препарата нормальной (не содержащей антител к порину OmpF) сыворотки, не превосходили фоновые.