Роль изменений редокс-статуса при адаптации Escherichia coli к меняющимся условиям среды Тюленев Алексей Валерьевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Активные формы кислорода и клеточные тиолы как факторы, определяющие редокс-статус клеток 14

1.1 Активные формы кислорода 14

1.2 Редокс-активные тиолы

1.2.1 Цистеин 15

1.2.2 Глутатион

1.2.2.1 Свойства и синтез глутатиона 17

1.2.2.2 Восстановление глутатиона (глутатионредуктаза ) 20

1.2.2.3 Турновер глутатиона (-глутамилтранспептидаза и -глутамильный цикл) 21

1.2.2.4 Транспорт глутатиона 23

1.2.2.5 Трансмембранная циркуляция глутатиона 24

1.3 Тиол-зависимые редокс-системы клетки 25

1.3.1 Глутаредоксины и тиоредоксины 25

1.3.2 Периплазматические редокс-системы 28

1.4 Eh в бактериальных культурах и низкомолекулярные тиолы 29

ГЛАВА 2. Роль редокс-регуляции при адаптации e. coli к стрессам 31

2.1 Окислительный стресс 31

2.1.1 Пероксидный стресс 31

2.1.2 Супероксидный стресс

2.2 ArcAB и FNR системы 34

2.3 Общий стрессовый ответ и строгий ответ 36

2.4 Другие примеры участия тиолов в редокс-регуляции 39

2.5 Роль GSH в регуляции транспорта К+ 40

2.6 Транспорт фосфата 44

Экспериментальная часть 48

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 48

3.1 Объекты исследования 48

3.2 Питательные среды и условия культивирования 49

3.3 Определение удельной скорости роста 50

3.4 Колониеобразующая способность 50

3.5 Определение живых и мертвых клеток (live-dead test) 51

3.6 Определение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и pH в среде культивирования 51

3.7 Измерение парциального давления кислорода 52

3.8 Выявление изменений мембранного потенциала 52

3.9 Скорость продукции супероксида

3.10 Определение концентрации перекиси водорода в среде и в клетке 54

3.11 Определение концентрации глутатиона 54

3.12 Определение концентрации внутриклеточного калия 56

3.13 Определение -галактозидазной активности 56

3.14 Определение концентрации цистеина 57

3.15 Статистическая обработка полученных результатов 58

3.16 Материалы 58

ГЛАВА 4. Трансмембранная циркуляция глутатиона при изменении параметров среды в периодических культурах escherichia coli 59

4.1 Изменение удельной скорости роста у различных штаммов E. coli при переходе к микроаэробным условиям 59

4.2 Изучение экспрессии rpoS::lacZ и sodA::lacZ как маркеров индукции RpoS и ArcAB регулонов 62

4.3 Продукция экстраклеточного супероксида в периодической культуре E. coli 63

4.4 Статус глутатиона в растущей культуре E. coli 64

4.5 Взаимосвязь трансмембранной циркуляции GSH с глобальными регуляторными системами клетки 68

ГЛАВА 5. Влияние экзогенных афк на экспорт глутатиона 73

5.1 Влияние экзогенных АФК, генерируемых ксантиноксидазой, на рост и циркуляцию GSH у бактерий E. coli 73

5.2 Взаимодействие глутатиона с экзогенными АФК 79

5.3 Влияние АФК на жизнеспособность и мембранный потенциал клеток 82

ГЛАВА 6. Взаимосвязь между трансмембранной циркуляцией глутатиона и ионными потоками при изменении доступности фосфата и сульфата в среде 88

6.1 Роль неорганического фосфата и сульфата в циркуляции глутатиона у бактерий E. coli 88

6.2 Изменение и продукции супероксидного радикала при добавлении Pi к голодающим по фосфату клеткам 95

6.3 Влияние искусственных изменений H+ на экспорт глутатиона при добавлении фосфата в голодающую культуру 97

6.4 Изучение связи между экспортом GSH и К+ при добавлении фосфата и сульфата в культуры, голодающие по этим субстратам 99

ГЛАВА 7. Регуляция экспорта глутатиона при аминокислотном голодании 105

7.1 Изменение циркуляции глутатиона и цистеина при аминокислотном голодании и возобновлении роста 105

7.2 Изменение продукции супероксидного радикала при добавлении валина 109

7.3 Изменение циркуляции глутатиона при добавлении низкой концентрации валина и предобработке хлорамфениколом 110

Обсуждение 114

Заключение 123

Литература 127

• Восстановление глутатиона (глутатионредуктаза
• Общий стрессовый ответ и строгий ответ
• Определение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и pH в среде культивирования
• Изучение экспрессии rpoS::lacZ и sodA::lacZ как маркеров индукции RpoS и ArcAB регулонов

Введение к работе

Актуальность проблемы. Изучение механизмов регуляции жизнедеятельности клеток является одним из приоритетных и актуальных направлений современной экспериментальной биологии. В последнее время значительное внимание уделяется исследованию регуляторных механизмов с участием редокс-активных соединений. В этот способ регуляции вовлечены активные формы кислорода (АФК), в особенности супероксидный радикал и перекись водорода, а так же ряд эндогенных соединений, способных к редокс-превращениям. Среди них особое значение имеют соединения, содержащие тиоловые (SH-) группы, глутатион (GSH), тиоредоксины, глутаредоксины и др. Взаимодействие АФК, тиолов и SH-групп в составе активных центров в белках приводит к изменению их конформации, что составляет молекулярную основу редокс-регуляции (Kwon et al., 2003; Paget, Buttner, 2003). Механизмы редокс-регуляции хорошо изучены у эукариот. Известно, что у этих организмов АФК и редокс-активные тиолы вовлечены в регуляцию экспрессии генов, клеточной сигнализации и апоптоза (Voehringer, 1999; Klatt, Lamas, 2000; Filomeni et al., 2002).

У бактерий известно несколько молекулярных систем, включенных в редокс-регуляцию. Показано, что у E. coli переключение между аэробным и анаэробным метаболизмом осуществляет белок FNR, в регуляции которого в роли редуктанта выступает GSH (Unden et al., 2002). Другой системой, регулирующей у E. сoli метаболизм при пониженном парциальном давлении кислорода (pO₂) в среде, является ArcAB. В аэробных условиях механизм регуляции включает образование интермолекулярных дисульфидных связей в киназе ArcB вследствие специфического окисления хинонами двух редокс-активных цистеиновых остатков в сенсоре (Malpica et al., 2004).

Одним из наиболее изученных примеров редокс-регуляции c участием тиолов у бактерий является ответ E. coli на действие пероксида. В присутствии H₂O₂ активируется экспрессия антиоксидантных генов, часть из которых контролируется транскрипционным фактором OxyR. Его активация происходит при образовании внутримолекулярной дисульфидной связи, в восстановлении которой участвует глутаредоксин 1 в присутствии GSH или тиоредоксина (Trx1). Важно, что OxyR проявляет чувствительность как к H₂O₂, так и к изменению внутриклеточного тиол-дисульфидного статуса (Aslund et al., 1999).

Ранее было обнаружено, что при различных переходных процессах и стрессах, в аэробных культурах E. coli наблюдаются характерные изменения редокс-потенциала среды (Eh) в область отрицательных значений, прямо не связанные с изменениями рН и pO₂ в среде. Основной вклад в эти изменения Eh вносят внеклеточные низкомолекулярные тиолы (НМТ), в том числе, GSH. Выявлена связь между изменениями внеклеточных НМТ, внутриклеточными уровнями ионов K⁺ и рН в этих ситуациях (Октябрьский, Смирнова, 2012). Позже были представлены доказательства, свидетельствующие о существовании непрерывной циркуляция глутатиона между аэробно растущими клетками E. coli и средой. Параметры процесса зависят от pH, Eh, pO₂, энергетики клетки, трансмембранных ионных потоков и значительно изменяются при стрессах (Smirnova et al., 2012). Роль этих изменений в регуляции активности бактерий остается недостаточно изученной. Было предположено, что трансмембранная циркуляция НМТ вместе с реакциями, определяющими направление ионных потоков и внутриклеточный рН, может составлять существенную часть сенсорного и регуляторного механизмов, быстро реагирующих на изменения параметров среды и клетки. Требуются дальнейшие исследования для подтверждения этой гипотезы.

До настоящего времени остаются мало изученными системы экспорта глутатиона и регуляция их активности у бактерий E. coli. Известен только один АТФ-зависимый транспортер CydDC, осуществляющий перенос GSH в периплазму (Pittman et al., 2005), который не участвует в экспорте глутатиона при экспоненциальном росте (Smirnova et al.,

4 2012). Таким образом, значительная часть внутриклеточного GSH экспортируется через не идентифицированные транспортеры.

Цель настоящей работы – изучить вклад активных форм кислорода и трансмембранной циркуляции тиолов в редокс-регуляцию клеточных функций E. coli при изменении ростовых условий.

Основные задачи исследований:

1. Изучить изменения продукции АФК, трансмембранных потоков GSH и редокс-статуса глутатиона в периодических культурах E. coli родительского типа и мутантов по генам, связанным с изменением редокс-статуса клеток и регуляцией адаптивных процессов.

2. Исследовать влияние экзогенных АФК на экспорт глутатиона и мембранный потенциал в клетках мутантов и родительского штамма.

3. Осуществить мониторинг экстраклеточного супероксида, GSH, мембранного потенциала и внутриклеточного калия при добавлении фосфата и сульфата к родительским и мутантным клеткам E. coli, голодающим по этим субстратам.

4. Изучить изменения АФК и тиолов (цистеин и GSH) при аминокислотном голодании в клетках родителя и мутантов по гену relA.

Научная новизна.

Впервые показано, что экспорт и редокс-статус глутатиона у E. coli находятся под контролем RelA, ArcAB и RpoS, что свидетельствует о включении трансмембранной циркуляции глутатиона в общую регуляторную сеть бактериальной клетки. Через сигнальную цепь «менахинон ArcB СydDC» статус глутатиона и интенсивность его трансмембранной циркуляции может контролироваться редокс-состоянием дыхательной цепи.

Впервые обнаружено, что в растущих культурах E. coli микромолярные дозы экзогенных O₂^- и Н₂О₂ стимулируют экспорт GSH и модулируют мембранный потенциал (). Получены доказательства, что экспортируемый глутатион вносит вклад в защиту периплазмы от окислительного стресса.

Впервые показано, что внесение фосфата в голодающую по нему культуру E. coli приводит одновременно к обратимому повышению , кратковременному усилению продукции супероксида и стимуляции редокс-чувствительного экспорта GSH, сопряженного с транспортом К⁺ из клеток. Связь потоков GSH и К⁺ наблюдается также при внесении анионов SO₄ ^2- в культуру, голодающую по сульфату. Экспортная система калия KefC является не только мишенью для регуляции глутатионом, но прямо или косвенно участвует в экспорте GSH.

Впервые установлено, что переход растущих E. coli в режим аминокислотного голодания приводит к ускорению продукции супероксида и стимулирует экспорт цистеина и GSH в среду. Мутация relA противоположным образом влияет на трансмембранные потоки цистеина и глутатиона, свидетельствуя об участии алармона (p)ppGpp в регуляции экспорта этих тиолов при аминокислотном голодании.

Теоретическое и практическое значение работы

Наибольшее теоретическое значение имеют данные, свидетельствующие о том, что у бактерий E. coli экспорт и редокс-статус глутатиона находятся под контролем глобальных регуляторов ArcAB и RpoS, и зависят от уровня (p)ppGpp. Обнаружен сигнальный путь, связывающий интенсивность циркуляции глутатиона с редокс-состоянием дыхательной цепи, а также индукция экспорта глутатиона низкими дозами оксидантов. Полученные результаты свидетельствуют о включении трансмембранной циркуляции GSH в регуляцию метаболизма бактериальной клетки и расширяют представления о молекулярных механизмах, контролирующих адаптацию бактерий к изменению условий среды.

Обнаруженные связи между циркуляцией GSH и глобальными регуляторами, контролирующими рост бактерий, могут быть мишенями при поиске новых антибактериальных препаратов и разработке путей управления развитием бактериальных культур в биотехнологии.

Глутатион относится к высокоэффективным антиоксидантам и выпускается в качестве БАВ. В биотехнологии в качестве источников получения GSH используются микроорганизмы. Одним из критических моментов в получении глутатиона является выделение его из клеток. В настоящей работе показано, что обработка клеток стимуляторами экспорта GSH, может позволить значительно повысить эффективность процесса получения GSH в биотехнологии за счет сокращения стадии разрушения клеток и упрощения процедуры очистки.

Основные положения, выносимые на защиту

5. Трансмембранная циркуляция глутатиона в периодической культуре E. coli зависит от продукции эндогенного супероксида и регулируется с участием глобальных регуляторов RpoS, ArcAB и синтетазы (p)ppGpp RelA.

6. Экзогенный супероксид стимулирует экспорт глутатиона из клеток E. coli и изменяет мембранный потенциал ().

7. Обратимый выход GSH при добавлении фосфата к голодающим клеткам E. coli связан с гиперполяризацией мембраны, усилением продукции супероксида и экспортом калия через транспортные системы KefB и KefC.

8. RelA-зависимый синтез (p)ppGpp противоположным образом регулирует экспорт цистеина и глутатиона в клетках E. coli при аминокислотном голодании.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований по теме диссертации представлены на II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2015). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (1 статья в иностранном рецензируемом журнале).

Объем и структура работы

Восстановление глутатиона (глутатионредуктаза

L-цистеин – тиол-содержащая аминокислота, входящая в состав белков, необходима для биосинтеза большого числа серосодержащих соединений (метионин, тиамин, биотин и коферменты). Кроме того, цистеин играет ключевую роль в сборке белковых молекул, их фолдинге и стабилизации посредством формирования дисульфидных связей. L-цистеин-содержащие белки, такие как тиоредоксин (Trx) и глутаредоксин (Grx), участвуют в защите клеток от окислительного стресса. Недавно показано, что периплазматический цистеин защищает клетки Escherichia coli от продуцируемого фагоцитами пероксида водорода (Ohtsu et al., 2010). В то же время, в определенных условиях цистеин может индуцировать окислительный стресс. При возрастании внутриклеточной концентрации он восстанавливает свободное железо, способствуя в ходе реакции Фентона продукции гидроксильных радикалов, повреждающих ДНК (Park, Imlay, 2003). Клетки бактерий поддерживают низкий уровень цистеина в цитоплазме, что достигается путем регуляции его синтеза и деградации. Синтез цистеина включает две стадии. На первом этапе происходит О-ацетилирование L-серина при участии L-серин-О-ацетилтрансферазы (SAT, cysE). А далее О-ацетил-L 16 серин(тиол)-лиаза замещает ацетильную группу на серу. Один из способов регуляции уровня цистеина происходит по типу обратной связи, когда избыток цистеина ингибирует активность фермента собственного биосинтеза – SAT (Kredich, 1992, 1996). Предотвращение аккумуляции избыточного количества L-цистеина в клетке может также обеспечиваться работой фермента L-цистеиндесульфгидраза (CD), которая отщепляет аминогруппу от цистеина, образуя пируват. У E. coli идентифицировано 5 различных CDs (MetC, MalY, CysK, CysM, TnaA) (Awano et al., 2005). Включение цистеина в состав глутатиона может рассматриваться как еще один способ регуляции его внутриклеточного уровня для защиты микробной клетки от окислительного стресса.

Гены биосинтеза цистеина и гены, чьи продукты отвечают за поступление цистина, совместно образуют цистеиновый регулон, находящийся под контролем транскрипционного фактора CysB. Регулон включает в себя также белки, ответственные за поступление и восстановление окисленных источников серы, таких как сульфаты или тиосульфаты (Berger, Heppel, 1972). Для активации белка CysB необходим индуктор – N-ацетил-L-серин (NAS), который формируется из О- ацетил-L-серина (OAS) (Kredich, 1996).

Еще один ген, cbl вовлечен в регуляцию второго пути биосинтеза цистеина из органических соединений серы. Его экспрессия находится под контролем транскрипционного фактора cys-регулона, а аминокислотная последовательность Cbl на 40% идентична таковой у CysB (Iwanicka-Nowicka, Hryniewicz, 1995).

В клетках E. coli гены fliY, yecS и yecC кодируют белки, которые совместно образуют L-цистин/L-цистеиновый комплекс транспортеров АВС суперсемейства, осуществляющий импорт цистеина. FliY – периплазматический связывающий белок (Butler et al., 1993), а YecC и YecS – АТФ-связывающая и мембранная субъединицы, соответственно (Kertesz, 2001). Quadroni с коллегами показали, что экспрессия первого гена данного комплекса переносчиков, значительно индуцируется при сульфатном голодании (Quadroni et al., 1996). Кроме того, идентифицирован второй, более специфичный, цистеиновый транспортер, кодируемый геном ydjN, который отвечает за поступление цистеина в момент роста микроорганизмов на минимальной среде (Berger, Heppel, 1972). Недавно установлено, что YdjN способен транспортировать такие токсичные соединения как L-селенопролин и L-селеноцистин (Deutch et al., 2014).

За экспорт цистеина отвечает другая транспортная система, а именно CydDC, которая, как и система импорта цистеина, принадлежит к суперсемейству АВС-кассетных переносчиков. Помимо цистеина данные белки осуществляют перенос глутатиона из цитоплазмы, что делает данный комплекс переносчиков важным инструментом в поддержании редокс-баланса периплазматического пространства (Pittman et al., 2002, 2005). Другие неспецифические цистеиновые переносчики-импортеры локализованы как во внутренней мембране (YdeD, YfiK, Bcr) (Daler et al., 2000; Franke et al., 2003), так и наружной (TolC) (Wiriyathanawudhiwong et al., 2009). Полипептид TolC никак не связан с транспортерами во внутренней мембране, что свидетельствует о первоначальном накоплении экспортируемого цистеина в периплазматическом пространстве (Wiriyathanawudhiwong et al., 2009).

Глутатион (GSH) – низкомолекулярный тиол, который присутствует в клетках всех эукариот (Meister, Andersen, 1983) в концентрациях от 0.5 до 10 мМ (наибольшее содержание отмечено в клетках печени животных). При этом основная часть внутриклеточного GSH, а именно, 80-85% сосредоточена в цитозоле, 10-15% в митохондриях и незначительная доля тиола приходится на эндоплазматический ретикулум (Meredith, Reed, 1982; Yuan, Kaplowitz, 2009). В миллимолярных концентрациях GSH присутствует в клетках всех грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (Fahey et al., 1978), где играет ключевую роль в защите от окислительного, осмотического, теплового стрессов, воздействия некоторых антибиотиков, соединений хлора и токсинов (метилглиоксаль) (Смирнова и др., 2001; Ferguson, Booth, 1998; Smirnova, Oktyabrsky, 2005). Как биологически активное соединение, глутатион широко используется при производстве фармпрепаратов и пищевых продуктов (Valencia et al., 2001). Фирмы, продающие глутатион, рекламируют его как «суперантиоксидант» и «универсальное лекарство природного происхождения без неблагоприятных побочных эффектов». В биотехнологии в качестве продуцентов глутатиона часто используются генно-инженерные штаммы Saccharomyces cerevisiae и Candida utilis (Li et al., 2004).

Общий стрессовый ответ и строгий ответ

Обнаружен ряд других редокс-чувствительных белков, окисление которых является сигналом для активации подконтрольных систем. Среди них транскрипционные регуляторы OhrR, PpsR/CrtJ, PerR, шаперон Hsp33 и другие. Активация этих белков достигается путем различных механизмов: цистеиновый остаток OhrR образует производное сульфеновой кислоты (C15-SOH), репрессоры PpsR/CrtJ формируют обратимую дисульфид, а Hsp33 окисляется с образованием двух дисульфидных связей и освобождением цинка с последующей димеризацией белка (Paget, Buttner, 2003).

Регуляция путем глутатионилирования существенных SH- групп, обычная у эукариот, возможна и в клетках прокариот. Одним из прокариотических белков, для которых показана возможность регуляции путем образования смешанного дисульфида с глутатионом, является PAPS-редуктаза E. coli (Vlamis-Gardikas et al., 2002). Недавно было показано, что в клетках E. coli тиоредоксин способен связываться с 80 белками, участвующими в различных клеточных процессах (Kumar et al., 2004). Наличие среди этих белков транскрипционных регуляторов указывают на потенциальную возможность участия тиоредоксина в редокс-регуляции активности бактериальных клеток.

К числу важных функций глутатиона у грамотрицательных бактерий относится его участие в регуляции внутриклеточного уровня ионов К+. Клетки всех живых организмов аккумулируют К+. У бактерий этот катион играет центральную роль в поддержании клеточного тургора, гомеостаза цитоплазматического рН и передачи информации из среды в клетку (Booth, 1985; Epstein et al., 1993). У E. coli в поглощении К+ участвуют три системы: конститутивная TrkG/H, индуцибельная Kdp, обладающая высоким сродством к ионам К+, и Kup (TrkD) (Epstein et al., 1993). Для выхода К+ из клеток важное значение имеют продукты конститутивно экспрессируемых генов kefB и kefC, представляющих собой два независимых К+ канала. Мутации в этих двух генах предотвращают поддержание клетками высокого трансмембранного градиента калия и требуют высоких концентраций калия для роста (Bakker et al., 1987; Meury, Kepes, 1982; Epstein et al., 1993). Быстрый выход К+ из клеток наблюдается при обработке бактерий N-этилмалеимидом (NEM) и другими тиоловыми реагентами (Meury et al., 1980; Elmore et al., 1990). Одновременно было показано, что клетки E. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, быстро теряют К+ при переносе в среду, не содержащую К+, и не могут расти на среде с низким содержанием К+, в отсутствие экзогенного GSH или его аналога, офтальмовой кислоты (Meury, Kepes, 1982; Meury, Robin, 1985). Показано также, что GSH-опосредуемое открытие К+-каналов зависит от окислительного метаболизма, оксиданты и редуктанты модифицируют скорость выхода калия в стационарном состоянии. При этом восстановительные условия (воздействие цианида, редуктантов и анаэробиоз) ингибируют выход калия в клетках дикого типа, что соответствует закрытому К+ каналу; окислительный метаболизм субстратов переводит каналы в физиологически открытое состояние; а действие оксидантов (перекись водорода и t-бутил-гидропероксид) и тиоловых реагентов (диамид, NEM, p-хлормеркурибензоат, HgCl2) вызывает полное открытие каналов и вытекание К+ из клеток («leaky» фенотип) (Meury, Robin, 1990).

На основании приведенных выше данных была предложена гипотеза о том, что продукты генов kefB и kefC образуют калиевые каналы, а глутатион участвует в их регуляции, закрывая каналы (Meury, Kepes, 1982). Кроме того, было высказано предположение, что выход К+ через эти каналы контролируется редокс-состоянием клетки. Предполагалось также, что редокс-состояние глутатиона прямо или косвенно может влиять на открытие калиевых каналов, поэтому в растущих бактериях соотношение GSH/GSSG может быть одним из факторов, контролирующих скорость выхода К+ (Meury, Robin, 1990). Последующие исследования дали дополнительные доказательства в пользу гипотезы об участии глутатиона в регуляции калиевых каналов KefB и KefC, однако предположение о регуляторной роли редокс-состояния клетки в активности каналов не получило дальнейшего экспериментального развития.

KefB и KefC являются большими белками (более 600 аминокислот) и состоят из каналообразующего N-терминального мембранного домена и С-терминального домена, соединенных экстремально гидрофильным линкером. С-терминальный домен содержит центр связывания глутатиона и отвечает за регуляцию каналов трипептидом (Munro et al., 1991; Ness, Booth, 1999). KefB и KefC содержат дополнительные субъединицы, необходимые для их полной активности (YabF и YheR для KefC и KefB, соответственно) (Miller et al., 2000). Гомологи KefB и KefC обнаружены у многих грамотрицательных бактерий, что свидетельствует о важности выполняемых ими функций (Booth et al., 1996).

Было показано, что глутатион-S-конъюгаты электрофильных веществ (NEM, p-хлормеркурибензоат, метил-глиоксаль и др.) могут взаимодействовать с К+ каналами KefB и KefC, приводя к вытеканию К+ из клеток. Добавление редуктантов обращает процесс, вызывая распад конъюгатов. Канал поддерживается в закрытом состоянии как восстановленным глутатионом, так и мембранным потенциалом (отрицательным внутри). Вызванный глутатион-S-конъюгатами выход К+ из бактерий сопровождается входом протонов, закислением цитоплазмы и повышением выживаемости бактерий (Bakker, Mangerich, 1982; Ferguson et al., 1995, 2000). На основании рассмотренных выше данных Booth с коллегами заключили, что основной функцией KefB и KefC является защита клеток бактерий от токсического действия эндогенных (метилглиоксаль) и экзогенных электрофилов (Booth et al., 1996).

Более детальные исследования последних лет выявили, что GSH и его конъюгаты (GSX) располагаются в KefC в перекрывающихся «карманах», при этом связывание с GSX вызывает значительные конформационные изменения, приводящие к активации KefC (Roosild et al., 2010). Показано, что конъюгаты обладают более высоким сродством к сайтам связывания, чем GSH, поэтому даже при очень высокой концентрации GSH в цитоплазме, конъюгаты способны активировать выход калия через KefC (Healy et al., 2014). Кроме того, KefC содержит нуклеотид-связывающий домен (KTN), присоединение к которому NADH инактивирует KefC (Fujisawa et al., 2007). Примечательно, что белок TrkA, включенный в транспорт калия в клетки E. coli, также имеет два сайта для связывания NAD(H) (Schlsser et al., 1993). Важность этой связи подтверждается тем, что калиевые каналы животных также регулируются пиридиновыми нуклеотидами (Kilfoil et al., 2013). Пиридиновым нуклеотидам принадлежит важная роль как донорам/акцепторам электронов в различных процессах, включая энергетику, биосинтез, антиоксидантную защиту. Соотношение NAD(P)H/NAD(P), как и GSH/GSSG, определяет редокс-статус цитоплазмы. Накапливается все больше данных о регуляторной роли пиридиновых нуклеотидов. Таким образом, два компонента, обеспечивающих трансмембранную циркуляцию К+ у бактерий, могут находиться под контролем двух важных редокс-систем, что обеспечивает интеграцию транспорта калия в клеточный метаболизм и адаптацию к изменениям в окружающей среде. Cледует отметить, что участие пиридиновых нуклеотидов в регуляции К+-выходных каналов соответствует концепции, предполагающей, что выход К+ через эти каналы контролируется редокс-состоянием клетки (Meury, Robin, 1990).

Недавно было обнаружено еще одно важное свойство KefC, связанное с наличием у его компонента KefF оксидоредуктазной активности. Как оказалось, KefF использует NADH и NADPH как доноры электронов, а хиноны (в числе другие соединения) - как акцепторы. Показано, что, будучи электрофилами, хиноны способны активировать KefС, образуя S-конъюгаты с глутатионом (GS-Q), однако энзиматическая активность не требуется для активации KefC, поскольку удаление KefF не лишает способности KefC осуществлять экспорт калия. Авторы предположили, что в данной ситуации KefF, катализируя образование GS-Q, выполняет параллельно две функции: снижает редокс-активность электрофильных хинонов и активирует выход калия через KefC систему (Lyngberg et al., 2011).

Механочувствительные каналы (MS-каналы) являются еще одним примером связи между транспортом ионов и глутатионом. Эти каналы играют важную роль в регуляции тургорного давления у бактерий и представляют собой мембранные белки, реагирующие на растяжение мембраны увеличением своей способности находиться в открытом состоянии и пропускать ионы по их электрохимическому градиенту (Booth et al., 1996; Blount et al., 1996). Показано, что у E. coli GSH снижает способность MS-каналов открываться в ответ на растяжение мембраны (Koprowski, Kubalski, 1999). Авторы предположили, что глутатион может действовать как редуктант, восстанавливающий дисульфидную связь в молекуле MS-канала или в ассоциированном регуляторном белке (Koprowski, Kubalski, 1999).

Определение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и pH в среде культивирования

Отобранные пробы бактериальной культуры в объеме 0.5 мл, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и осажденные клетки промывали физиологическим раствором NaCl. Осадок растворяли в 0.5 мл 0.9% NaCl и добавляли флуоресцирующие красители, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами: SYTO 9 до конечной концентрации 10 мкМ и пропидиум йодид (PI) до конечной концентрации 5 мкМ. Полученную пробу оставляли в темноте на 15 мин при комнатной температуре. По истечению указанного времени 10 мкл образца наносили на предметное стекло, покрытое 1% агарозой, приготовленной на минимальной среде М9. После наложения покровного стекла флуоресценцию препарата смотрели под микроскопом Leica DM2000 («Leica Microsystems GmbH», Германия). Для детекции флуоресценции SYTO 9 использовалась фильтр-система I3 (возбуждение – 450-490 nm, эмиссия – 515 nm, дихроичное зеркало – 510 nm). Для детекции флуоресценции PI использовалась фильтр-система N2.1 (возбуждение – 515-560 nm, эмиссия – 590 nm, дихроичное зеркало – 580 nm) (Biggerstaff et al., 2006).

Величину pH в среде культивирования регистрировали с помощью комбинированного pH-электрода InLab Expert Pro-ISM (Mettler Toledo, Швейцария) и комплекта измерительной аппаратуры NBS «BioFlo 110» (Германия). Окислительно-восстановительный потенциал в среде культивирования определяли в режиме реального времени с непрерывной регистрацией потенциометрическим методом с использованием редоксметрического комбинированного электрода ЭРП-105 («ИТ», Россия) и pХ-метра cpX-2 ИБП РАН (Россия) с выводом на компьютер. Значения Eh выражали в зависимости от полярности (±) в милливольтах. Базовое значение Eh определяли в среде, не содержащей клеток.

Парциальное давление кислорода (рО2) в среде культивирования определяли полярографическим методом с использованием электрода Кларка InPro 6800 (Mettler Toledo, Швейцария) и комплекта измерительной аппаратуры NBS «BioFlo 110» (Германия). Значения рО2 выражали в % от максимального насыщения, которое определялось в среде без клеток.

Для выявления изменений мембранного потенциала использовали проникающий флуоресцентный краситель DiBAC ([DiBAC4(3)], бис-(1,3-дибутилбарбитуратовая кислота)-триметиноксонол), относящийся к категории медленных флуорохромов (Wickens et al., 2000). DiBAC4(3) растворяли в 70% этаноле до концентрации 1 мг/мл, а затем в деионизированной воде до конечной концентрации 100 мкг/мл.

Бактериальную культуру (180 мкл) смешивали с 20 мкл раствора DiBAC4(3) 100 мкг/мл (финальная концентрация красителя 10 мкг/мл) и оставляли в темноте при 37С в течение 10 минут, после чего готовили микропрепарат. Для этого образец в объеме 10 мкл наносили на предметное стекло с 1 %-ной агарозой (приготовленной на средах MOPS или M9) и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM2000 (фильтр-система I3, возбуждение – 450-490 нм, эмиссия – 515 нм). Общее количество клеток подсчитывали в проходящем свете на определенной площади с помощью программного пакета Leica Application Suite (v.3.4.0). Для каждого образца в сумме подсчитывали не менее 800 клеток в трех независимых экспериментах. 3.9 Скорость продукции супероксида

Продукцию экстраклеточного супероксида в среде определяли по реакции восстановления супероксидом цитохрома С, который был добавлен в клеточную суспензию (Korshunov, Imlay, 2006). Бактериальную культуру выращивали на минимальной среде М9 с добавлением 0.15% глюкозы при 37С (150 об/мин). Для измерения общей продукции супероксида клетки экспоненциальной фазы роста (ODeoo = 0.5) центрифугировали и отмывали свежей средой культивирования. Пробу разделяли на две части и доводили до оптической плотности СЮбоо = 0.2, каждая колба в конечном объеме содержала по 10 мл подогретой среды М9 с 0.15% глюкозы и 20 мкМ цитохрома С. В одну из колб добавляли фермент Мп-супероксиддисмутазу до конечной концентрации 30 Е/мл. Поскольку при восстановлении цитохрома С появляется характерная окраска, искажающая истинную оптическую плотность при длине волны 600 нм, готовили третью колбу с бактериальной культурой в аналогичных условиях, но без добавления цитохрома и фермента, в которой определяли OD600. Колбы инкубировали при 37С в термостатируемом орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через установленные промежутки времени, клеточную суспензию в объеме 1.5 мл из каждой колбы, пропускали через ацетат-целлюлозный мембранный фильтр МФАС-ОС-2 («Владипор», Россия) с диаметром пор 0.45 мкм. Фильтраты помещали на холод и определяли количество восстановленного цитохрома С по изменению спектра поглощения между 550 нм и 556.5 нм. Затем окисляли цитохром С добавлением 0.2 мМ феррицианида калия к фильтрату с повторным снятием спектра поглощения при тех же длинах волн. Количество восстановленного цитохрома С рассчитывали, используя индуцированное феррицианидом изменение поглощения при 550 нм относительно 556.5 нм. Общее количество восстановленного цитохрома (ОКВЦ) определяли по формуле: ОКВЦ = Колба"S0D (A 50 восст "A 5б5 восст )+Колба+SOD(A 50— "A окисл ) 21 где А восст - оптическая плотность в нм в колбе с восстановленным цитохромом, А окисл - оптическая плотность в нм в колбе с окисленным цитохромом. Фракцию цитохрома С, восстановление которой опосредованно только супероксидом, определяли путем сравнения парных образцов из двух колб, содержащей и не содержащей SOD. Скорость продукции супероксида (v) определяли по формуле: у = ОКВЦ/О.1х0Доохґ, где t - время в минутах. Результат выражали в пмоль/0.1 х OD6oo х мин.

Изучение экспрессии rpoS::lacZ и sodA::lacZ как маркеров индукции RpoS и ArcAB регулонов

Полученные результаты позволяют выделить в периодической культуре E. coli две фазы, первая из которых характеризуется высоким значением удельной скорости роста и наблюдается при OD600 не более 0.7 – 0.8, pO2 – от 100 до 5-10% и Eh от +200 до 0 мВ. Во второй фазе происходит резкое снижение скорости роста. Судя по значениям pO2 и Eh, в этой фазе клетки находятся в микроаэробных условиях. Это подтверждается резким сдвигом соотношения GSH/GSSGout в сторону восстановительных значений у родительского штамма и у четырех мутантов (рисунок 10). Значения pO2 и Eh, ниже которых в наших условиях начинался микроаэробный рост, являются критичными для физиологии E. coli, в этой области происходит переключение активности двух глобальных регуляторов ArcAB и FNR, контролирующих адаптацию бактерий к аэробно-анаэробным переходам (Alvarez et al., 2013; Levanon, 2005).

Согласно рассмотренным данным в этой главе, уровни внутриклеточного глутатиона и редокс-статус экстраклеточного глутатиона значительно варьируют у разных штаммов и зависят от фазы роста. В то же время, по такому интегральному физиологическому показателю как удельная скорость роста статистически значимые различия между штаммами отсутствовали. Исключение составил штамм cydD, скорость роста которого была заметно ниже, чем у всех остальных штаммов (рисунок 2). Этот мутант, лишенный мембранного белка, транспортирующего GSH в среду, имел, как следствие, самый низкий уровень экстраклеточного общего глутатиона и самое низкое значение соотношения GSH/GSSGout на обеих фазах роста. Таким образом, даже в отсутствие стрессовых воздействий, поддержание определенного редокс-статуса экстраклеточного глутатиона, по-видимому, является необходимым для нормального роста бактерий. Ген cydD находится под контролем системы ArcAB.

Представляет также интерес поведение мутанта kefC, у которого не функционирует транспортер (KefC), участвующий у E. coli в экспорте K+. По сравнению с родительским штаммом, этот мутант имел более высокий уровень внутриклеточного глутатиона на второй фазе роста и более низкий уровень экстраклеточного глутатиона в течение всего периода культивирования. Это указывает на то, что KefC может участвовать в экспорте глутатиона. Как указывалось выше, KefC негативно регулируется GSH и активируется аддуктами глутатиона с электрофилами, в том числе и хинонами (Booth et al., 1996; Lyngberg et al., 2011). Наши данные указывают на более широкую связь между KefC и глутатионом. KefC может выступать не только как мишень регуляции глутатионом, но прямо или косвенно участвовать в его экспорте.

Штамм, лишенный глутатионредуктазы (GOR), отличался самым высоким уровнем экстраклеточного общего и окисленного глутатиона. Повышенный уровень GSSGout приводил к значительному снижению соотношения GSH/GSSGout, особенно в микроаэробных условиях. Отсутствие GOR в этом штамме должно приводить к накоплению GSSG в цитоплазме. Дисульфид GSSG является сильным оксидантом, поэтому, интенсивный экспорт GSSG в среду можно рассматривать как способ защиты цитоплазмы от окислительного (дисульфидного) стресса. Следует отметить, что, несмотря на существенный сдвиг редокс-статуса экстраклеточного глутатиона в сторону окисленной формы, мутант gor рос с такой же скоростью, как и родительский штамм (рисунок 2). Вероятно, отсутствие GOR компенсировалось повышением активности других тиоловых редокс-систем. Перекрывание функций тиоловых редокс-систем – хорошо установленный факт (Carmel-Harel, Storz, 2000).

Известно, что, как и у других бактерий, аэробный рост E. coli сопровождается образованием супероксидного радикала (О2-), который образуется не только в цитоплазме, но и в периплазме, где он может продуцироваться при аутоокислении дигидроменахинона (компонента цепи переноса электронов) и вызывать окислительный стресс в этом компартменте. Поскольку цитоплазматическая мембрана не проницаема для супероксида, то считается, что О2-, определяемый в культуральной жидкости, генерируется, в основном, с внешней стороны цитоплазматической мембраны (Korshunov, Imlay, 2006). Было предположено, что функцией периплазматической супероксиддисмутазы (SodC), кодируемой геном sodC, является защита периплазмы от экстраклеточного супероксида (Korshunov, Imlay, 2002, 2006). Рассматривалась также возможность участия экстраклеточного глутатиона в этом процессе (Smirnova et al., 2012). Однако все еще нет полной ясности в этом вопросе. В нашей работе показано, что мутанты, дефектные по синтезу SodC, обладали более высоким уровнем экстраклеточного глутатиона (рисунок 7 А). Повышенный уровень экстраклеточного редуктанта (GSH) может компенсировать отсутствие активности SodC. Полученный результат можно рассматривать как один из дополнительных аргументов в пользу участия глутатиона в защите периплазмы от действия АФК.

Примечательно, что до плотности OD600 = 1.0 уровень экстраклеточного GSH в мутанте sodC изменялся также, как в мутанте rpoS. Ген rpoS кодирует сигма-субъединицу РНК-полимеразы RpoS – глобального регулятора общего стрессового ответа у E. coli (Hengge, 2008). Поскольку экспрессия sodC находится под контролем гена rpoS (Gort et al., 1999), неудивительно одинаковое поведение этих двух штаммов в отношении GSHout. Мутант rpoS, но не sodC, имел самый высокий уровень внутриклеточного глутатиона из всех исследуемых штаммов и более высокий, чем у родителя, уровень экстраклеточного GSH. Это свидетельствует о том, что у E. coli RpoS может выступать в качестве негативного регулятора статуса глутатиона по обе стороны цитоплазматической мембраны.

Мутант relA отличался от всех испытанных штаммов самым низким уровнем GSHin. Одновременно, у этого мутанта уровень GSHout и скорость продукции супероксида были примерно в два раза ниже, чем у родительского штамма. Эти данные свидетельствуют о том, что у E. coli при нормальных условиях уровни глутатиона по обе стороны цитоплазматической мембраны и уровень супероксида в среде находятся под контролем глобального регулятора relA-зависимого пути синтеза (p)ppGpp.

По сравнению с родительским штаммом у мутантов по синтезу менахинона (menA) был более высокий уровень GSHin и более низкий уровень GSHout. Кроме того, в отличие от родительского штамма, у мутанта тепА при переходе к микроаэробным условиям не наблюдалось повышения соотношения GSH/GSSG0Ut в сторону восстановительных значений. Из всех испытанных штаммов мутант тепА показывал самую низкую скорость накопления супероксида. Последний результат был ожидаем, поскольку ранее было показано, что у аэробно-растущих бактерий Е. coli одним из основных источников продукции супероксида в периплазме может быть аутоокисление хинона в электронной цепи (Korshunov, Imlay, 2006). Наши результаты подтверждают эти данные.

У Е. coli система АгсАB контролирует переход от аэробных к микроаэробным условиям (Alvarez et al, 2013). В наших экспериментах мутанты агсА и агсВ показывали более высокие уровни GSHm, а мутант агсВ (контролирующий сенсорный белок) - более низкий уровень GSH0Ut. Поскольку для активации АгсВ в микроаэробных условиях или при переходе к анаэробным условиям требуется менахинон, логично, что мутанты тепА и агсВ идентичны по уровню экспортируемого GSH. В свою очередь, под контролем АгсАB находится рассмотренный выше ген cydD, продукт которого осуществляет экспорт глутатиона в среду. Полученные результаты позволяют предположить, что при переходе к микроаэробным условиям происходит переключение экспорта GSH с еще не идентифицированной транспортной системы на транспортер CydDC.