Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Понятие «доминантность» в структуре микробных сообществ и биокоммуникативная активность бифидофлоры 16
1.2. Аспекты интеграции бифидобактерий с организмом хозяина 29
1.3. Бифидобактерии - основа для разработки новых лечебных препаратов и перспективы создания синбиотиков 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе 48
2.2. Методика определения состояния микробиоценоза кишечника 49
2.3. Методы выделения и идентификации микроорганизмов 50
2.3.1. Метод выделения микроорганизмов из микросимбиоценоза толстого кишечника человека 50
2.3.2. Биохимическая идентификация бактерий 51
2.3.3. Масспекрометрическая идентификация бифидофлоры 52
2.3.4. Генотипическая идентификация бифидобактерий 52
2.4. Молекулярно-генетические методы исследования культур 54
2.4.1. Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ геномов микроорганизмов 54
2.4.2. ПЦР-анализ на наличие генов колибактинов (clbA, clbB, clbQ, 56 clbN) у штаммов E. coli M-17 и E. coli ЛЭГM-18 56
2.5. Хроматографический метод исследования спектра и уровня короткоцепочечных жирных кислот в метаболитах бифидобактерий 57
2.6. Фенотипические методы изучения биологических свойств бактерий 58
2.6.1. Антилизоцимная активность микроорганизмов 58
2.6.2. Антилактоферриновая активность бактерий 59
2.6.3. Антииммуноглобулиновая активность бифидобактерий 60
2.6.4. Антипептидная активность микроорганизмов 61
2.6.5. Иммунорегуляторная активность бактерий 62
2.6.6. Биопленкообразование микроорганизмов 64
2.6.7. Антагонистическая активность бактерий 64
2.6.8. Гемолитическая активность микроорганизмов 65
2.7. Метод определения «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе толстого кишечника человека 66
2.8. Изучение уровня локальных антимикробных факторов и цитокинов в копрофильтратах человека 67
2.8.1. Метод получения копрофильтратов человека 67
2.8.2. Определение лизоцима, лактоферрина, про- и противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах 67
2.9. Статистические методы обработки полученных результатов 68
Глава 3. Стуктурно-функциональная характерстика бифидофлоры толстого кишечника человека 69
3.1. Таксономическая характеристика бифидофлоры при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека 69
3.2. Характеристика генома, масс-спектров белков и состава короткоцепочечных жирных кислот бифидобактерий кишечного микросимбиоценоза 77
3.3. Персистентный потенциал бифидобактерий в ассоциативном симбиозе человека 100
3.4. Обсуждение результатов 111
Глава 4. Аспекты взаимодействия бифидобактерий с системой иммунитета хозяина 115
4.1. Влияния метаболитов бифидофлоры на баланс про- и противовоспалительных цитокинов на модели клеток врожденного и адаптивного иммунитета 115
4.2. Оценка способности метаболитов бифидобактерий изменять уровень про- и противовоспалительных цитокинов после контакта in vitro с рекомбинантными цитокинами 126
4.3. Иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека 130
4.4. Обсуждение результатов 136
Глава 5. Роль бифидобактерий в регуляции кишечного микросимбиоценоза человека 139
5.1. Роль бифидобактерий в межмикробном распознавании «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» 140
5.2. Разработка способа определения биосовместимости кишечных микросимбионтов на основе феномена распознавания «свой-чужой» 155
5.3. Обсуждение результатов 170
Глава 6. Фундаментальные и прикладные аспекты исследования бифидобактерий 173
6.1. Функциональные группы бифидофлоры кишечной микробиоты в ассоциативном симбиозе человека 174
6.2. Бифидобактерии – регулятор иммунного гомеостаза хозяина в условиях ассоциативного симбиоза 184
6.3. Определение уровня биосовместимости пробиотических штаммов в симбиотической композиции и оценка биологической активности новых композиций in vitro 204
6.4. Обсуждение результатов 227
Заключение 229
Выводы 251
Список сокращений 254
Список литературы 267
- Аспекты интеграции бифидобактерий с организмом хозяина
- Характеристика генома, масс-спектров белков и состава короткоцепочечных жирных кислот бифидобактерий кишечного микросимбиоценоза
- Разработка способа определения биосовместимости кишечных микросимбионтов на основе феномена распознавания «свой-чужой»
- Бифидобактерии – регулятор иммунного гомеостаза хозяина в условиях ассоциативного симбиоза
Аспекты интеграции бифидобактерий с организмом хозяина
Развитие современных методов исследования, в том числе «-омик»-технологий (геномика, эпигеномика, метагеномика, транскриптомика, протеоми-ка, метаболомика и др.) позволило получить информацию о молекулярных механизмах взаимодействия человека и микробиоты как единой интегрированной системы, являющейся результатом адаптивной эволюции, отражающей уровень развития регуляторных механизмов микробиоты и организма человека [116, 136, 157, 238, 297].
Интеграция молекулярных систем микросимбионтов и макропартнёра (человек) осуществляется посредством сигнальных молекул: со стороны микробио-ты, реализуемой через биокоммуникативную активность (регуляторные метаболиты), а со стороны хозяина – это медиаторы иммунной и гормональной систем [10]. Регуляторные метаболиты микроорганизмов включают короткоцепочечные жирные кислоты, разветвленные жирные кислоты, гамма аминомасляная кислота (ГАМК), биотин, витамин К, Р-гидроксифенилуксусные кислоты, гидроксикорич-ная кислота, п-аминобензойная кислота, индоксил сульфат, индолилуксусная кислота, индолкарбоновые кислоты, путресцин, спермидин, спермин, таурин, кадаверин, триптофан, тирозин и другие [82, 213, 289].
Не исключено, что результатом интеграции микробиоты и организма хозяина является формирование «единой регуляторной среды» [8, 10], обеспечивающей поддержание гомеостаза в биотопах организма человека. В условиях биотопа толстого кишечника человека, характеризующегося разнообразием процессов и представляющего собой сложную микроэкологическую систему, важным является поддержание имуннологического гомеостаза.
Ведущая роль в регуляции иммунологического кишечного гомеостаза человека принадлежит про- и противовоспалительным цитокинам, продуцируемым эпителиальными, иммунными клетками кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (GALT) под воздействием представителей нормобиоты, посредством формирования адекватного цитокинового баланса [250, 254, 255]. Цитокины принимают участие в регуляции иммунного ответа при инфекции. Кроме того, в ряде исследований показано, что дисбиоз толстого кишечника может привести к нарушению баланса цитокинов в среде и развитию ряда патологий, таких как ожирение, диабет I и II типа, воспалительные заболевания кишечника, колоректаль-ный рак и формированию иммунодефицитных состояний у пожилых людей [80, 81, 94, 99, 160, 195]. Изучение роли представителей нормобиоты в формировании иммунного баланса в биотопе толстого кишечника позволит определить их как микробных регуляторов кишечного гомеостаза человека.
Бифидофлора, секреторные иммуноглобулины и прослойка слизи представляют собой полноценный надэпителиальный слизистый слой, который защищает слизистую оболочку от физической и химической агрессии, а также от атак микроорганизмов, бактериальных токсинов и паразитов. Компоненты муцина обеспечивают экологическое преимущество для Bifidobacterium spp., так как служат субстратом для их роста (эндогенные пребиотики), адгезии и защиты. Бифидобактерии обладают рядом ферментов — -L-fucosidase, N-acetylgalactosaminidase, galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase, участвующих в процессах синтеза и деградации муцина, необходимых для процессов регенерации слизи и защиты толстого кишечника человека [120, 167]. Известно стимулирующее действие бифидофлоры на синтез секреторного иммуноглобулина A (IgА) в кишечнике. Улучшение барьерной функции биотопа толстого кишечника возможно за счет усиления целостности эпителиального барьера компонентами бифидобактерий. Структура пептидогликана доминанта распознаётся через TLR-2 рецепторы и в ответ на этот сигнал инициируется синтез EGF-R фактора, укрепляющего плотные контакты эпителиоцитов толстого кишечника за счет процессов апикальной стяжки и герметизации [83, 261].
В физиологических условиях штаммы бифидобактерий, дифференцированно регулируя выработку анти- / провоспалительных цитокинов и поддерживая Th1/Th2 баланс, стимулируют протективный иммунный ответ и подавляют воспалительные реакции [64, 74, 84, 200, 216]. Таким свойством обладают как непосредственно микробные клетки, так и их экзометаболиты. Иммунорегуляторны-ми компонентами бифидобактерий являются белки, секретируемые во внеклеточную среду или локализованные на поверхности бактерий, низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, полисахариды клеточные стенки, компоненты бактериальной ДНК и ЛЖК (рисунок 2) [155].
Учитывая различную молекулярную природу этих молекулярных эффекторов прокариот, их механизмы действия весьма разнообразны [105]. Установлено, что взаимодействие микроорганизмов (микрофлоры) и их компонентов (в том числе метаболитов) с макроорганизмом осуществляется через так называемые об-разраспознающие (паттернраспознающие) рецепторы (PRR) - первичные cенсоры (Toll-like рецепторы, NOD-like рецепторы и др.), конститутивно экспрессирую-щиеся главным образом на клетках миеломоноцитарного ряда и на различных популяциях лимфоцитов [37, 94, 100, 178, 179, 219, 249]. Используя ограниченный набор PRR иммунокомпетентные клетки способны детектировать присутствие различных микроорганизмов и их структурных компонентов. Основные иммуно-тропные эффекты бифидобактерий реализуются через цитокиновый отклик им-мунокомпетентных клеток на компоненты прокариот от паттерн-распознающих рецепторов TLR-2 и TLR-9.
Известно, что TLR-2 участвуют в поддержании гомеостаза кишечного эпителия [53, 176, 287]. Компоненты бифидобактерий содержат лиганды для рецепторов NOD2 [272, 311]. Связывание TLR с лигандами, различными адаптерными молекулами прокариот приводит к активации сигнальных киназ, последующей активации транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов. Однако иммунный отклик зависит от индивидуальных характеристик штаммов и типов кишечных иммунных клеток (таблица 1).
На модели макрофагов показано противовоспалительное влияние бифидо-бактерий через ингибирование сигнального пути NF-kB и снижение секреции провоспалительных цитокинов IL-12, IL-6, IL-1 и IFN- [225]. Культуры B. bifidum B536 и B. breve BbC50 блокировали связывание липополисахаридов (LPS) грамотрицательных бактерий с рецепторами макрофагов CD14, ассоциированного с TLR-4, препятствуя сигнальной трансдукции LPS и активации NF -kB. Установлено предотвращение LPS-индуцированной активации NF–kB в макрофагах культурами B. adolescentis ATCC 15703 через снижение фосфорили-рования IkB, ингибитора NF–kB, с увеличением супрессора цитокинового сигналинга (SOCS). Подобная активность была характерна и для штамма L. casei Shirota, хотя у большинства культур лактобактерий (L. casei YIT 9029, L. fermentum YIT 0159, L. crispatus, L. rhamnosus GG ATCC 53103) отмечалась способность к активация NF–kB и провоспалительного потенциала макрофагов [217, 240].
Интересным фактом является приоритетность противовоспалительного сигнала бифидобактерий на модели клеток врожденного иммунитета. Так, сочетанное воздействие компонентов LPS с клетками бифидобактерий на макрофаги (B. breve ATCC 15700, B. longum ATCC 15697, B. adolescentis ATCC 15703) характеризовалось снижением уровня экспрессии генов IL12p40, IL-1 и TNF- по сравнению с отдельной LPS-индукцией [205]. Возможно, бифидофлора минимизирует риск избыточной стимуляции иммунитета, способный нанести вред собственным клеткам хозяина, что может быть одним из механизмов опосредованного формирования иммунологической толерантности организма хозяина к синантропной грамотрицательной микробиоте.
Помимо противовоспалительной активности, бифидобактерии стимулируют бактерицидную активность макрофагов. При недостатке бифидобак-терий в микросимбиоценозе толстого кишечника у макрофагов замедляется гидролиз чужеродных агентов. Включение в рацион здоровых мышей культур B. lactis и L. rhamnosus способствовало увеличению фагоцитарной активности нейтрофилов и перитонеальных макрофагов, усиливалась выработка - интерферона спленоцитами. К бактериальным компонентам бифидоф-лоры, стимулирующим фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов относят мурамил – дипептид клеточной стенки прокариот и различные группы химических соединений, входящих в состав метаболитов микроорганизмов [299]. В присутствии клеток B. animalis VKL и B. animalis VKB у макрофагов отмечалась стимуляция секреции NO/NO 2 и снижение IL-12 [223]. Усиление бактерицидного потенциала макрофагов бифидобактериями является частью защитного эффекта нормобиоты и имеет значение в поддержание колонизационной резистентности биотопа толстого кишечника человека.
Показан противовоспалительный эффект бифидобактерий через негативную регуляцию сигнального пути NF-kB в кишечных эпителиальных клетках (IEC). Этот путь является одним из основных каналов сигнализации энтероцитов, активирующий иммунный ответ на различные антигены и может представлять собой «ключ к разговору» между пробиотическими штам-мами/нормофлорой и IEC [197]. Культуры B. longum и B. lactis BB12 ингиби-ровали активацию транскрипционного фактора NF-kB, уменьшая транслокацию p65 и модифицируя фосфорилирование NF-кВ транскрипционно активной субъединицы RelA. Подобный механизм противовоспалительного влияния был установлен у штаммов B. thetaiotaomicron, Faecalibacterium prausnitzii DSM 17677, L. bulgaricus и L. crispatus M247. Вместе с тем для большинства пробиотических штаммов (L. acidophilus ATCC 4356, L casei DN-114001, L. fermentum DSMZ 20052, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus GG ATCC 53103, S. thermophilus ATCC 19258 и т.д.) показана противовоспалительная активность, реализуемая через активацию цитоплазматического ингибитора NF-кВ [240].
Характеристика генома, масс-спектров белков и состава короткоцепочечных жирных кислот бифидобактерий кишечного микросимбиоценоза
Использование современных молекулярно-генетических методов исследований прокариот организма человека позволили усовершенствовать подходы к идентификации и таксономии микроорганизмов, экспресс диагностики ряда функциональных и патологических состояний макропартнёра. Были получены новые данные о молекулярных структурах бактерий и выявлены новые лиганд-рецепторные механизмы взаимодействия с организмом человека. В последнее время широкое развитие получили новые дисциплины - патогеном, целью которой является изучение генетической основы бактериального патогенеза, и пробиогеном, наука изучающая многообразие синан-тропных/пробиотических бактерий, их генетические детерминанты и молекулярные основы, ответственные за укрепление здоровья человека [96, 269, 321]. Изучение полного генома ряда синантропных микроорганизмов расширило наше понимание биологии этих микроорганизмов и позволило получить новую информацию о метаболических возможностях, генетике и филогении прокариот [318].
Вместе с тем особый интерес представляет использование современных подходов исследований микросимбионтов для получения новых знаний, способствующих пониманию механизмов адаптации и интеграции прокариот в условиях ассоциативного симбиоза с организмом хозяина. На следующем этапе исследования была предпринята попытка изучить генотипическую характеристику бифидофлоры, включая размеры геномов, филогенетический анализ генов 16S РНК полностью секвенированных штаммов, рассмотреть материалы по масс-спектрометрическому анализу белков (MALDI) и проанализировать профиль короткоцепочечных жирных кислот данных микроорганизмов.
При сравнении полных аннотированных геномов базы данных GenBankа бифидобактерий и наиболее распространенных представителей микросимбиоценоза толстого кишечника были использованы основные количественные параметры, получаемые при секвенировании, позволяющие в целом охарактеризовать тип питания, экологическую нишу, занимаемую исследуемым микроорганизмом и длительность адаптации к ней. Поскольку в силу особенностей клеточной организации прокариот существует сильное селективное давление на размер генома свободноживущих форм в сторону его редукции за счёт фрагментов, не имеющих адаптивного значения [324]. Кроме того, в настоящее время существует возможность оценить и регуля-торный диапазон адаптации рассматриваемых микросимбионтов в целом – посредством определения «сигнального ценза» по числу генов двухкомпо-нентных сигнальных систем [139, 222].
В результате было установлено, что представители рода Bifidobacterium sp. обладают сравнительно небольшим геномом (менее 3 млн. пар нуклеоти-дов) и малым числом генов сигнальных систем (не более 19 штук белков, за исключением B. longum spp. infantis) (таблица 4). Эти значения меньше, чем таковые у большинства остальных представителей микробиоты толстого кишечника человека, таких как бактероиды, клостридии и протеобактерий. Поскольку разнообразие и сложность адаптивных реакций прокариот прямо определяется количеством генов сигнальных (регуляторных) систем в форме «сигнального ценза», а редукция генома – доминирующий режим эволюции свободноживущих прокариот [324], то общий размер генома культивируемых бактерий прямо коррелирует с диапазоном их адаптивного потенциала.
Оценивая по возрастанию размеры генома и набор генов двухкомпо-нентных систем у типичных представителей облигатно-анаэробного звена кишечного микросимбиоценоза на основании базы данных GenBankа, было выполнено следующее ранжирование таксонов: Bifidobacterium sp. (менее 2,5 млн.п.н., 5-19 белков) Propionibacterium sp. (2,5-3,5 млн.п.н., 6-34 белков) Prevotella sp. (2,6-3,6 млн.п.н., 4-22 белков) Clostridium sp. 4,1±0,06 млн.п.н., 14-32 белков) Peptoclostridium sp. (4,1±0,7 млн.п.н., 51 белков) Bacteroides sp. (5,0-6,26 млн.п.н., 50-86 белков). Сравнительно небольшой геном и малое числом генов сигнальных систем представителей рода Bifidobacterium являются отличительными параметрами их генома в сравнении с другими таксонами, что может свидетельствовать о способности бифи-дофлоры к более простому адаптивному «поведению» в микробиоценозе и сформировавшейся в процессе длительной коэволюции глубокой специализации данных микроорганизмов в отношении небольшого числа устойчивых биотопов с постоянными условиями, к которым можно отнести дистальный отдел толстого кишечника человека.
Подтверждением высокой специализации бифидофлоры к биотопу толстого кишечника явились результаты полногеномного секвенирования. В данном исследовании секвенированные последовательности геномов 6 штаммов (таблица 5), из которых 4 принадлежали к виду B. bifidum, и 2 штамма – к B. longum. Среди исследуемого набора штаммов размер генома был унимодально распределен со средним значением 2,26 млн. п.н у B. bifidum и 2,37 млн. п.н у B. longum. Наибольший геном (2,45 млн. п. н.) среди проанализированных штаммов принадлежал B. longum ICIS-505.
В аннотированных сервисом RAST геномах всех секвенированных штаммов исследуемых бифидобактерий, доля гомологов генов с достоверно известной функцией находится в диапазоне от 68 до 74%; доля генов, образующих функциональные подсистемы, составила 41-42% у всех рассмотренных штаммов за исключением B. longum MC-42, у которого данный параметр равен 45,3% (840 из 1853 генов).
Секвенирование штаммов B. bifidum показало, что итоговые длины полученных сборок в среднем на 50 тысяч пар нуклеотидов и на 200 потенциальных рамок считывания больше чем в четырёх полных геномах NCBI, но не превышает верхнего значения размера генома для данного вида в 2,28 тысяч пар нуклеотидов. Доля GC-пар также полностью соответствует другим секвенированным к настоящему времени штаммам данного вида и составляет 62-63%. У секвенированных штаммов сохраняется широкий набор известных генов, обеспечивающих симбиотические взаимодействия бактерий данного вида с организмом хозяина: ферменты расщепления олигосахаридов человеческого молока и кишечного муцина [220]. У штамма B. bifidum ICIS-310 не обнаружены гомологи гена пермеазы лактозы и галактозы, присутствующие в двух других секвенированных штаммах B. bifidum, но сохранены два гена экзо-альфа-сиалидаз, выявлен дополнительный ген семейства ДНК-метилтрансфераз (таблица 6). Эти факты свидетельствуют о высокой генетической однородности исследуемых штаммов вида B. bifidum и подтверждают валидность применённых в данной работе методик.
Секвенированные штаммы B. longum демонстрируют несколько больше различий между собой: штамм B. longum ICIS-505 содержит на 200 генов больше, чем B. longum MC-42, из которых 29 – гомологи с установленной функцией. Данные гены распределены равномерно по функциональным классам, главным образом в классах фаговых генов, систем противовирусной защиты и стресс-регуляторных систем.
Тем не менее, указанные различия не выходят за уровни вариабельности количества генов, определённых в полных геномах штаммов B. longum, депонированных в базе данных GenBank к настоящему моменту (таблица 7).
Также следует отметить, что гены, обеспечивающие оба пути синтеза ключевого предшественника «аутоиндуктора-2» - важного медиатора межвидовой коммуникации - дигидрокси-2,3-пентандиона (ДПД) как из S-рибозил-L-гомоцистеина (ген luxS), так и из рибулозо-5-фосфата [10] в виде генов двух ферментов, обеспечивающих взаимопревращение двух его стереоизо-меров (рибулозо-фосфат 3-эпимеразы и L-рибулозо-5-фосфат 4-эпимеразы) присутствуют у всех секвенированных штаммов. В то же время других ферментов путей превращения пентоз (KEGG) выявлено не было.
На заключительном этапе исследования было проведено вычисление абсолютного сигнального ценза исследуемых штаммов: суммарное число известных генов регуляторных систем составило 28 во всех трёх исследованных геномах бактерий B. longum, тогда как у B. bifidum выявлены небольшие различия в общем числе данной группы генов: 29 у штамма B. bifidum ICIS-310, 35 у штамма B. bifidum ICIS-643 и 34 у штамма B. bifidum ICIS-791. Значения относительного показателя сигнального ценза – «бактериального IQ» у B. longum находятся в диапазоне 112-121 единиц, у исследованных штаммов B. bifidum варьируют в пределах от 125 до 133 единиц.
Разработка способа определения биосовместимости кишечных микросимбионтов на основе феномена распознавания «свой-чужой»
В природе организмы существуют не дискретно, вне связи с другими организмами, а постоянно взаимодействуют с множеством других организмов. Наличие связи между ними приводит к возникновению биологических ассоциаций, симбиотических комплексов с микроорганизмами разной степени сложности. Для определения эффективности взаимодействия микросимбионтов должны быть определены критерии (признаки), направленность типов связей, требующие проведение исследований и разработки новых экспериментальных подходов [10, 13]. Понимание и теоретическое осмысление экологических закономерностей функционирования симбиотической микрофлоры является необходимой предпосылкой для развития и совершенствования способов влияния на ее формирование и нормализацию с помощью различных форм пробиотиков из представителей резидентной микрофлоры.
В фундаментальной работе «Новый принцип биологии. Очерки теории симбиогенеза» Б.М. Козо-Полянским (1924) было предложено для характеристики симбиоза учитывать степень объединения партнеров, выявляя морфологические, физиологические особенности симбиотических систем. Вместе с тем, в современной литературе мы не встретили индексы и показатели, характеризующие уровень биосовместимости между участниками симбиоза. Известно использование для оценки взаимодействия между партнерами-симбионтами индекса взаимодействия или симбиотический индекс, определяемый как соотношение показателя развития вида в составе симбиоза к таковому в свободноживущем состоянии [13]. Данный индекс может скорее характеризовать степень облигатного (обязательный) симбиоза или уровень специализации микросимбионтов к занимаемому биотопу, нежели свидетельствовать об отношениях между партнерами, учитывая многокомпонентность известных симбиозов.
Современные информационные технологии дают возможность структурировать обширные базы данных, оценивать как множество единичных показателей, так и их совокупность в многомерном пространстве показателей, проводить статистический и экологический анализ. Так, использование синэкологического анализа микросимбиоценозов здоровых и больных людей разных возрастных групп, проживающих на территории промышленного мегаполиса, проводили с помощью количественного описания видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека [57, 58]. Были проведены расчеты с использованием общепринятых в экологии индексов: видового разнообразия Шеннона, доминирования Симп-сона, видового богатства Маргалефа и выравненности Пиелу, а также предложены авторами особенности возрастной периодизации, основанной как на физиологических параметрах, так и на состоянии микробиоты ЖКТ. В результате был определен спектр родов микроорганизмов, приоритетных для использования в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков: бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium и Lactococcus.
Проведенный анализ межвидовых коммуникаций бифидобактерий в парных сочетаниях в рамках биоценоза показал избирательное отношение видов к совместному вегетированию [43, 44]. Для определения степени совместимости или расхождения между парами видов использовали показатель К (коэффициент парной совместимости), учитывающий число событий, в которых одновременно наблюдалось оба исследуемых вида в сравнении по отношению к число событий с видами в общей выборке. По выраженности коэффициента совместного встречаемости видов судили о наличии, либо отсутствии антагонистических отношений в парах бифидобактерий.
Вместе с тем, использование показателей, характеризующих структурно-таксономические особенности микросимбиоценозов, без учета ряда физиологических параметров (рост, репродукция, выживаемость) прокариот, может являться, прежде всего, предпосылкой для дальнейшего изучения формирования и функционирования симбиотических взаимодействий микроорганизмов.
В методах экосистемномного анализа также известно применение коэффициентов конкурентоспособности жертв и конкурентоспособности хищников, используемый при изучении модели сосуществования только двух видов, из которых один («жертва») служит пищей для другого («хищника») [23]. Данная модель подходит для изучения биосистем с большей степенью организации, чем у одноклеточных прокариот и характеризуют только антагонистический тип взаимодействия между партнерами.
На сегодняшний день модель «хищник-жертва» получила активное развитие в теориях эволюционной игры, нелинейной динамики и теории случайных процессов, включающая математические инструменты и концептуальную основу для более глубокого понимания взаимодействий видов в экологических системах [77, 110, 234, 296]. Эти теории сформулированы на языке нелинейной динамики, где термины теории игр «равновесие Нэша» или «эволюционная стабильная стратегия» отображаются на «неподвижных точках» обычных нелинейных дифференциальных уравнений. Иллюстрации этих понятий даны в терминах двухстраничных игр и циклической модели Лотка-Вольтерра, также известной как игра «камень-ножницы-бумага».
Циклическая конкуренция видов, как метафорически описываемая дет ской игрой «камень-ножницы-бумага», является основой видовых взаимо действий. Лабораторные эксперименты по популяциям, состоящим из раз личных бактериальных штаммов E. coli, показали, что бактерии могут сосу ществовать, если низкая подвижность сегрегации (отделения) различных штаммов. Однако детерминированное описание популяций взаимодейст вующих индивидов в терминах нелинейных дифференциальных уравнений не учитывает некоторые важные особенности реальных экологических сис тем. Так, показаны нетранзитивный тип взаимодействий «камень-ножницы бумага» на примере бактериоцин-продуцирующих, бактериоцинчувствительных и бактериоцин-резистентных штаммов E. coli [86, 145]. Однако, в естественной среде наличие у прокариот генетически детерминированной системы «токсин-антитоксин» определяет существование у большинства штаммов способности к секреции и резистентности к действию колици-нов, и лишь у небольшой части популяции – чувствительности.
С позиции ассоциативного симбиоза, оценивая микросимбиоценоз в качестве биологической системы, обладающей регуляторной функцией, направленной на поддержание собственной сложной многовидовой структуры и выступающей регулятором гомеостаза организма хозяина, авторами были выделены 2 наиболее важные функции микробной системы: размножение и адаптацию к меняющимся условиям среды [10]. В соответствии с названными базовыми функциями были уточнены их критерии. Для оценки ростовых свойств – это колониеобразующие единицы (КОЕ), т.е. число микробных клеток, а адаптации – факторы персистенции (переживания). Универсальный характер факторов персистенции позволил выделить: биопленкообразование (БПО) и антилизоцимный тест (АЛА), как отражающие адаптивные возможности микроорганизмов и встречающиеся одинаково часто при эубиозе, и при дисбиозе. Выбор этих универсальных тестов, характеризующих базовые функции микросимбионтов чрезвычайно важен, т.к. они позволяют одновременно решить вопрос и об определении «биомишени», без чего невозможна регуляция биосвойств микроорганизмов и отбор эффективных средств.
На модели микросимбионтов дистального отдела толстого кишечника человека с использованием алгоритма микробного распознавания «свой-чужой» были определены антагонистические/синергидные типы связей, что позволили с помощью доминантных микроорганизмов - бифидобактерий дифференцировать «свои» и «чужие» культуры микросимбионтов среди клинических изолятов бактерий и грибов. При использовании математической и аналитической модели при интерпретации результатов микробного распознавания был определен уровень как «чужеродности» между микросимбионтами и доминантами, так и уровень «биосовместимости» бифидофлоры к «своим» ассоциантам.
Это позволило нам использовать разработанный алгоритм как основу для определения способа биосовместимости между кишечными микросимбионтами, имеющего значение при формировании и функционировании мик-росимбиоценоза толстого кишечника человека. Разработка количественного способа биосовместимости микросимбионтов на основе микробного распознавания и определения разнонаправленности симбиотических типов связи между микроорганизмами, позволит ранжировать ассоциативное звено мик-росимбиоценоза, определить особенности экологических закономерностей формирования сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки и прогнозировать дальнейшее формирование микросимбиоценозов через интерференцию ассоциантов, либо формирования стабильных консорциумов с доминантами. Поскольку ассоциативные микросимбионты, с одной стороны, не накапливаются в значимых количествах в морфологических структурах макросимбионта, с другой, часто присутствуют только на определенных стадиях развития симбиоза [5].
Бифидобактерии – регулятор иммунного гомеостаза хозяина в условиях ассоциативного симбиоза
Известно, что микробиом человека играет важную роль в поддержании гомеостаза (здоровья) человека [114, 304], но, к сожалению, роль микробного фактора как регулятора здоровья и реализации функционирования висцеральных систем хозяина еще далека от своего разрешения.
Оценивая инфекционный процесс как результат паразит-хозяинных отношений, мы рассматриваем его в качестве модели, описывающей такое природное явление как ассоциативный симбиоз [6]. Такой подход создает методологическую платформу для решения вопроса о синергидных и антагонистических механизмах взаимодействия про- и эукариот, расширяя патогенетические представления в области инфектологии, определяет перспективы развития нового направления, возникшего на стыке биологии и медицины – «инфекционной симбиологии».
Несмотря на разнообразие биотопов организма, есть общие моменты, заслуживающие внимания. Для каждого биотопа существует свой «ключевой» (основной) вид (виды) нормофлоры, обладающей универсальным набором характеристик микробного антагонизма в защите этого биотопа. Для кишечной автохтонной микрофлоры важны бифидобактерии, лактобациллы, типичные эшерихии; для женского репродуктивного тракта – лактобациллы, для полости носа – стафилококки и коринеформные бактерии, для зева – стрептококки. Формирование индигенной микрофлоры в биотопе также во многом зависит от его морфофункциональных особенностей и степени защищенности от патогенов различными природными субстратами (лизоцим, интерферон, карнозин, лактоферрин и др.) хозяина.
Ключевая функция доминантных микроорганизмов, в частности бифи-дофлоры в кишечном биотопе хозяина, как показали наши исследования, определяется «наведением порядка в доме» за счет поддержания своих микроорганизмов и выраженного антагонизма в отношении чужих. Реализация этого принципа в межмикробных отношениях позволила разработать алгоритм микробного распознавания «свой – чужой» в микросимбиоценозе кишечника человека на основе экспериментально выявленного оппозитного феномена (усиление/подавление) важнейших физиологических функций (размножение и адаптация) выживания микросимбионтов пары «доминант – ассоциант» [6, 10]. Не исключено, что эта первичная дискриминация чужеродного материала бифидофлорой – инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунных механизмов гомеостаза хозяина.
На следующем этапе взаимодействия – «хозяин – ассоциант» роль факторов врожденной защиты организма резко повышается при включении в ассоциативный симбиоз микроорганизмов – ассоциантов, что приводит к различным исходам инфекции. Это во многом зависит от патогенного потенциала ассоциантов – «патогенассоциированных молекулярных паттернов», их способности преодолевать распознающие механизмы врожденного иммунитета хозяина – «паттернраспознающие рецепторы», определяющие стереотипные и консервативные в эволюции молекулы, присущие большим группам микроорганизмов. Эти механизмы врожденного иммунитета, как рекогносцировочные, так и эффекторные хорошо описаны [74, 166].
При этом, несмотря на очевидную связь врожденного иммунитета с микросимбионтами, остается ряд не выясненных вопросов, в частности, каким образом осуществляется физиологическая цепь «сигналинга» от «ключевых» видов бактерий к иммунным клеткам и какова роль доминантных микроорганизмов (представителей нормофлоры) в регуляции иммунного гомео-стаза?
В связи с этим несомненный интерес представляет изучение механизмов взаимодействия микросимбионтов с дендритными клетками (ДК) человека, поскольку именно они являются важнейшими клетками иммунной системы, способными интегрировать различные сигналы, формируя прямые им-муногенные или толерогенные ответы [28, 38, 62].
Имеются указания, что ДК являются «point of contact» (точкой контакта) клеток иммунной системы и кишечной микробиоты, опосредующей поддержание сбалансированного мукозального и системного иммунных ответов [244]. Известно, что дендритные клетки также называют «воротами иммунитета» и мобильными «стражами» [38], являющимися «связующим звеном» врождённого и адаптивного иммунитета, обеспечивающими хрупкий баланс кишечного гомеостаза, защиту от инфекции и формирование толерантности [78, 268, 285].
Установлено, что ДК – это гетерогенная популяция антигенпрезенти-рующих клеток (АПК) костномозгового происхождения, которые относят к факторам врожденного иммунитета, поскольку они, в отличие от Т- и В-лимфоцитов не несут рецепторов, ответственных за специфическое распознавание. В тоже время дендритные клетки играют важную роль в развитии реакций адаптивного иммунитета, поскольку это единственные клетки, обеспечивающие презентацию антигена (АГ) в лимфоидных органах, инициируя процессы генерации антиген - специфических клонов Т-лимфоцитов [28, 268].
Известна высокая антигенпрезентирующая способность ДК, с чем связывают их эффективное представление различных антигенов. Высокое содержание комплексов МНС-АГ (в 10-100 раз больше, чем на других АПК) позволяют одной ДК презентировать АГ одновременно большому количеству Т-лимфоцитов (до 300 - 1000 клеток). Таким образом, малое количество ДК в организме не пропорционально их эффекту влияния на адаптивный иммунитет [288]. Кроме того, у дендритных клеток более высокий уровень экспрессии молекул адгезии и костимуляции, чем у других АПК, и в зависимости от условий ДК могут секретировать различные цитокины. Все эти особенности делают ДК в 100 - 1000 раз более активными по сравнению с макрофагами и В-лимфоцитами, в процессах иммунного реагирования на чужеродные АГ (в том числе микробиоту), что свидетельствует о значимости дендритных клеток в процессах иммунорегуляции при взаимодействии с многочисленным и разнообразным по видовому составу микробиомом организма человека.
В результате взаимодействия ДК с ПАМП микроорганизмов осуществляется не только презентация АГ наивным Т-клеткам и дифференцировка их в АГ-специфический клон, с инициацией Т-клеточного ответа, но и поддержание баланса между Т-хелперами 1-го (Th 1) и 2-го (Th 2) типов. Кроме того, ДК способны стимулировать продукцию антител у покоящихся В-клеток, а в определённых условиях «переключать» изотип иммуноглобулинов. Также дендритные клетки способны регулировать процессы индукции центральной и периферической толерантности к ауто-АГ и микросимбионтам [218]. Более того, сами ДК продуцируют про- и противовоспалительные цитокины, участвующие, как в дифференцировке самих ДК, так и привлечении Т-клеток в область воспаления [87, 146].
Пластичность дендритных клеток при активации адаптивных реакций иммунитета связана с тем, что функции ДК реализуются в зависимости от сопутствующих факторов в микросреде кишечника, включая ретиноевые кислоты и цитокин TGF- (трансформирующий фактор роста ) [119, 205]. Другие кофакторы, включая интерфероны 1 типа (IFN), IL-10 и IL-12 могут способствовать поляризации ответа Т-лимфоцитов на конкретный АГ [312]. Например, цитокины IL-12 и IL-10, секретируемые ДК, определяют CD4+ поляризацию Т-клеток, индукцию дифференциации в про-воспалительные (Th1) и регуляторные (Tr1) Т-лимфоциты. Другой цитокин TGF- - является критическим для дифференциации гена семейства FOX (forkead box), кодирующих транскрипционный фактор FoxP3 регуляторных Т-клеток (Treg), что совместно с IL-6, способствует генерации IL-17- продуцирующих клеток, участвующих в защите от бактерий и грибов [91].
Таким образом, способность ДК реагировать на микроокружение может позволить им интегрированно влиять на иммунные ответы, генерируемые в отсутствие инфекции, либо в результате прямого взаимодействия с патогенами, помогая поддерживать баланс в кишечнике между различными классами защитных реакций иммунитета и толерантностью.
Наряду с ДК, клеточными компонентами лимфоидной ткани кишечника человека, находящимися в тесном контакте с громадным потоком микробного материала, являются Т-лимфоциты (40-60 % популяции), В-лимфоциты (20-40 % популяции), моноциты и макрофаги (5-10 %) [63]. Иммунокомпе-тентные клетки осуществляют ряд функций, связанных с формированием ци-токинового микроокружения в кишечном биотопе, процессами усиления синтеза IgA и презентацией антигенов.
Механизмы, с помощью которых ДК адаптируют свои ответы и проводят дискриминацию между вирулентными бактериями и не патогенными микроорганизмами - симбионтами пока остаются малоизученными [78, 206, 224]. Вместе с тем известно, что комменсальные и патогенные микроорганизмы могут по-разному активировать ДК, благодаря наличию у них множества рецепторов, за счет чего ДК способны различать микроорганизмы и индуцировать тип и интенсивность реакции адаптивного иммунитета [250].
Некоторые представители нормальной микрофлоры способствуют поляризации ДК к толерантности путем непосредственного контакта с их поверхностью. Так, взаимодействие штамма L. acidophilus с ДК приводило к продукции IL-10 при низкой экспрессии IL-12p70 этими клетками. Оказалось, что формирование «невоспалительного фенотипа» ДК было связано с активацией их поверхностного рецептора DC-SIGN, взаимодействующего с поверхностным белком SlpA лактобактерий [250]. Была отмечена гетерогенность штаммов лактобацилл в отношении иммунной стимуляции дендритных клеток: L. reuteri, L. rhamnosus, L. paracasei, L. paraplantarum индуцировали лишь незначительный уровень и/или ингибировали ряд про-воспалительных цитокинов, в то время как другие виды (L. plantarum, L. paracasei, L. acidophilus, L. gasseri) - являлись сильными индукторами IL-12, IFN- и хемокинов CXCL10, CCL12.