Роль бактерицидного тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) в инфекционной патологии и гомеостазе Сулейманов, Камиль Гильмиарович

Введение к работе

з

Актуальность проблемы. Тромбоцитарный бактерицидный кати-онный белок (ТКБ), ранее известный под названием бета-лизин, был открыт J.Fodor (1887), G.Nuttal (1888) и E.Behring (I 889), которые продемонстрировали в опытах in vitro и in vivo наличие в сыворотке крови некоторых животных термостабильного бактерицидного фактора к грамположителышм спорообразующим бактериям.

Фактор был назван бета-лизином для того, чтобы подчеркнуть его отличие от альфа-лизина (комплемента), характеризующегося термолабильностью.

Несмотря на давнюю историю вопроса, успехи в изучении природы и биологической роли бета-лизина до последних лет были незначительными. Это объясняется рядом причин. Во-первых, большим разнообразием различных антибактериальных факторов в крови и других тканях животных, среди которых бактерицидная активность, приходящаяся на долю бета-лизина, казалась незначительной. Во-вторых, постоянно существовала трудность дифференциации бета-литического действия от действия других антибактериальных факторов сыворотки и тканей, таких как лизоцим, гистоны, лизосомаль-ные катионные белки и другие.

Можно выделить следующие этапы истории исследований бактерицидного белка:

1. 1888-1920 гг. Обнаружение в крови различных животных и человека бактерицидного фактора против бактерий групп subtilis - anthrax (J.Fodor, 1887; G.Nuttal, 1888; E.Behring, 1889; E.Hahn, 1895, A.Schattenfron, 1897; M.Gruber, R.Futaki, 1907; M.KIing, 1910, 1916).

2. 1920-1960 гг. Изучение антибактериального спектра ТКБ, распространение его в сыворотке крови различных животных, происхождение и свойства (Н.В.Васильев, 1956, 1959, 1960; О.В. Бухарин с соавт., 1970, 1972, 1977; A.Pettereson, 1924, 1926, 1932, 1935; T.Mackie, M.Finkeletein a Van Royen, 1932; V.Wulff, 1934; W.Tilett, 1936; A.Tobler a M.Pinner, 1943; R.Jacox, 1950; Q.Myrvik a. All, 1951, 1953, 1955, 1956, 1960; D.Donaldson a.all, 1955, 1956, 1958, I960).

3. С 1960 г. Очистка ТКБ из сыворотки крови, изучение некото
рых молекулярных свойств, установление связи между его уровнем в
;ыворотке крови и некоторыми патологическими состояниями, оцен
ка диагностического и прогностического значения ТКБ теста в кли
чке (О.В.Бухарин с соавт., 1970, 1971, 1972, 1973, 1978; О.В.Бухарин,

Н.В.Васильев, 1977; О.В.Бухарин с соавт., 1980, 1982; D.Donaldson a.all, 1960, 1964, 1968, 1971).

Работы последних лет, связанные с изучением молекулярных свойств ТКБ и клиническими наблюдениями позволили отказаться от представления о нем лишь как о бактерицидном факторе тканей. Возникло понимание того, что биологическая роль ТКБ шире и должна выходить на уровень регуляторных молекул.

Гуморальные бактерицидные факторы клеток и тканей выполняют решающую функцию в защите макроорганизма, особенно в начальных фазах развития инфекции (П.Н.Бургасов, С.Н.Румянцев, 1985; О.В.Бухарин с соавт., 1996; В.Н.Кокряков, 1991; A.S.Bayer a.al., 1995; и др.). Среди них особое место занимают низкомолекулярные белки (пептиды) с выраженными катионными свойствами - гисто-ны, лизосомальные катионные белки нейтрофильных гранулоцитов (дефенсины), тромбоцитарный бактерицидный белок, значение которых определяется высокой микробоцидной активностью и способностью влиять на развитие патогенетических процессов (О.В.Бухарин с соавт., 1977; В.Н.Кокряков, 1988, 1990; R.I.Lehrer a. al., 1993 и др.).

Отдельные белки этого семейства получены в США синтетическим путем, прошли широкие клинические испытания и успешно применяются в практике здравоохранения (T.Ganz a. al., 1993).

Возрастает интерес к бактерицидному катионному белку тромбоцитов (Н.В.Васильев, 1968, 1979; О.В.Бухарин, Н.В.Васильев, 1977; О.В.Бухарин с соавт., 1979, 1984, 1991, 1997; M.R.Yeaman a. al., 1994 и др.). Известно, что его активность определяет защиту от стрептококковых и стафилококковых поражений, кандидозных и других инфекций (T.Wu a. al., 1994 и др.). Показано, что уровень тромбоцитар-ного катионного белка (ТКБ) повышается не только при инфекционной, но и при неинфекционной патологии, аллергических реакциях, травме и стрессе, что позволило отнести его к группе сигнальных острофазных белков (О.В.Бухарин с соавт., 1977; D.M.Donaldson a. al., 1974 и др.).

В серии авторских разработок установлено, что количество ТКБ в биологических объектах отражает состояние иммунного и общего гомеостаза- повышение содержания свидетельствует о напряженности гомеостазирующих реакций, понижение по сравнению с нормой - об истощении их потенциала. Внедренный в клиническую практику ТКБ (бета-лизиновый) тест позволяет оценивать тяжесть патологии,

диагностировать и прогнозировать характер течения ряда заболеваний (О.В.Бухарин с соавт., 1982-1986).

Эти исследования доказывают, что биологическая активность ТКБ не ограничивается его бактерицидной функцией, но проявляется вовлечением его в широкий спектр защитно-приспособительных реакций, до настоящего времени не изученных.

Особенностью ТКБ является связь его продукции с тромбин-сти-мулированной агрегацией тромбоцитов и свертыванием кропи (D.M.Donaldson а. а!., 1974; S.P.Koo a. al., 1996 и др.), т.е. ТКБ является звеном сопряжения двух важнейших биологических процессов -гемостаза и гомеостаза, определяемых кооперацией эндотелиоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и других клеток. Таким образом, любое нарушение микроциркуляции, связанное с патологией ткани, ведет к повышению антибактериальной защиты в очаге, а антибактериальная и гомеостазирующая активность тромбоцитарного белка является авангардной при развитии патологического процесса, определяя первые этапы взаимодействия патогена и макроорганизма.

Между тем, до настоящего времени недостаточно изучены молекулярные свойства ТКБ, условия проявления биологической активности, антибактериальный спектр, механизм бактерицидного действия и конкретные пути участия его в гомеостазирующих реакциях. Все это и определило цель планируемого исследования.

Цель исследования. Определить роль бактерицидного тромбоцитарного катионного белка в противоинфекционной защите и гомеостазе организма.

Задачи исследования.

3. Разработать способ очистки бактерицидного катионного белка из тромбоцитов человека, получить ТКБ в высокоочищеином виде и изучить его молекулярные свойства.

4. Определить антибактериальный спектр ТКБ, механизм его бактерицидного действия и влияние на перенстентные характеристики микроорганизмов.

5. Исследовать влияние ТКБ на экспериментальную инфекцию и механизм его иммуномодулирующей и гомеостазнругощей активности.

Научная новизна. Разработан новый способ очистки, выделен в

гомогенном виде бактерицидный катионный белок из сыворотки и тромбоцитов крови человека и изучены его молекулярные свойства (Л.С. № 1095493, 1984).- Показано, что это - низкомолекулярный белок (5,6 кД) с изоэлектрической точкой pi > 10,5, характеризуется высоким содержанием аминокислот лизина, гистидина, глютамата. Определены ингибиторы и активаторы ТКБ. Впервые изучены и установлены МБК очищенного катионного белка из тромбоцитов человека относительно разнообразных представителей кокковых, а также палочковидных грамположительных и грамотрицательных форм бактерий.

Впервые установлено, что тропность ТКБ к мембранам определяется не только его катионными свойствами, но и избирательным взаимодействием (лиганд-рецептор) его с фосфолипидами, а литический эффект на клетки бактерий обусловлен ингибицией ферментов антиокислительной защиты - пероксидазы и каталазы.

Впервые показана связь противоинфекционной активности тром-боцитарного белка не только с его бактерицидным действием, но и изменением функциональной активности клеток иммуногенеза, в частности путем "кондиционирования" нейтрофилов. Такая роль ТКБ в противоинфекционной защите в очаге воспаления подтверждена экспериментальными и клиническими наблюдениями. Показано, что ТКБ в условиях эксперимента повышает устойчивость организма к инфекции, стимулирует фагоцитоз, подавляет агрегацию тромбоцитов, изменяет степень РБТЛ.

Впервые установлено, что ТКБ включается в иммунный и общий гомеостаз, влияя на уровень ПОЛ мембран некоторых соматических клеток.

Проведенные исследования создают основу для производства, внедрения в биологию и медицину нового препарата, обладающего широким спектром бактерицидной, иммуномодулирующей и гомео-стазирующей активности.

Научная новизна прикладных аспектов проблемы заключается в том, что впервые ТКБ обнаружен в молоке, и на основании его количественного определения разработан способ ранней диагностики маститов (А.С. № 1389045, 1987).

В опытах на сельскохозяйственных животных впервые показано, что уровень ТКБ в молоке отражает также физиологическое состояние молочной железы в период формирования лактации у коров. Авторским свидетельством № 1139416 от 1984 г. Защищен способ

оценки физиологичности течения послеродового периода, сроков становления лактации и длительности содержания коров в родильном отделении.

Теоретическое и практическое значение работы. В результате исследований обнаружены новые свойства низкомолекулярного кати-онного бактерицидного белка из тромбоцитов человека, которые позволяют рассматривать ТКБ как регуляторнын фактор.

Выделение катионного белка из тромбоцитов связано с экстремальным явлением - их агрегацией и свёртыванием крови, процессами как обусловленными, так и предопределяющими множественную кооперацию клеток в защитных реакциях на повреждения. Экспериментально доказано, что при инфекционной патологии ТКБ стимулирует фагоцитоз бактерий не только через механизм опсонизации, но и "модуляции" нейтрофилов. Таким образом, наряду с известными механизмами активации тромбоцитов нейтрофилами через ФАТ (фактор активирующий тромбоциты), обнаруживается звено обратной связи - стимуляции нейтрофилов тромбоцитарным катионным белком. Иммуномодулирующая активность ТКБ проявляется также в подавлении РБТЛ (реакции бластной трансформации лейкоцитов) человека, вызываемой ФГА, в изменении проницаемости мембран спленоцитов, влиянии на уровень агрегации тромбоцитов, что может определять уровень продукции медиаторов иммунокомпетент-ными клетками. Показано, что регулирующая проницаемость мембран функция ТКБ обусловлена его тропностыо к фосфолипидам и способностью изменять уровень их перекиснаго метаболизма. Бактерицидная активность ТКБ неодинакова относительно различных групп микроорганизмов, но его микробоцидное действие всегда сопровождается накоплением продуктов ПОЛ. Следовательно, ТКБ обладает определённой универсальностью регуляторной функции, осуществляемой через тропизм к мембранным фосфолипидам бактерий и соматических клеток.

Разработанный способ выделения и очистки ТКБ (бета-лизина) внедрён в научно-исследовательской работе Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН и кафедре микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии. Способ диагностики субклинических форм маститов внедрен в ветеринарную практику хозяйств области, клиническую практику детского здравоохранения для контроля качества молока, используемого в

комбинатах детского молочного питания области.

Способ оценки физиологичности течения послеродового периода и сроков становления лактации включён в методические рекомендации республиканского уровня, а также внедрён в ветеринарно-ме-дицннскую практику хозяйств области.

Внедрены в практику научно-исследовательской работы в кафедрах и лабораториях Оренбургской медицинской академии, Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Аграрного университета, НПП " Экобиос " разработанные методы расчёта абсолютного содержания ТКБ в биологическом материале, нефеломет-рического варианта определения тромбоцитарной бактерицидной активности в молоке, дифференциации в биологических объектах тромбоцитарной бактерицидной активности от других бактерицидных факторов, стабилизации растворов ТКБ при хранении, получения порошковых препаратов ТКБ на носителе окиси алюминия для применения в качестве аппликаций в экспериментально-клинических исследованиях (-12, 1990, г. Оренбург; Ил. ЦНТИ № 143-86, №62-88, № 287-88).

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на проблемной комиссии по иммунологии, Оренбург, 1979; IV Всесоюзном биохимическом съезде, Ленинград, 1980; Всесоюзном симпозиуме "Физиологические основы машинного доения", Таллин, 1983; Межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", Ленинград, 1989; V Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем", Ростов-на-Дону, 1990; Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы", Оренбург, 1991; Межвузовской конференции молодых учёных и преподавателей ВУЗов, Оренбург, 1993; VI Межгосударственной межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", С.-Петербург, 1994; Международном симпозиуме "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1996; объединённых заседаниях обществ микробиологов, физиологов, биохимиков, Оренбург, 1980,1992; Ростов-на-Дон, 1994; итоговых научных конференциях, Оренбург, 1994, 1995, 1996.

Фрагменты работы экспонировались во Всероссийском Выставочном Центре (ВДНХ), 1986 г. (золотая медаль), участвовали в конкурсах научных работ республиканского и областного уровней в 1988, 1990,1993 гг.

По теме диссертации опубликовано 23 научных работ, получено 4 авторских свидетельства, оформлено и внедрено 14 рационализаторских предложений, издано 3 информационных бюллетеня.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 89 работ отечественных и 116 работ иностранных авторов. Работа иллюстрирована 59 таблицами, 33 рисунками.

Положения, выносимые на защиту.

6. Выделенный из тромбоцитов крови человека низкомолекулярный катионный белок (ТКБ) обладает широким спектром микробо-цидной активности. Бактерицидное действие ТКБ определяется его способностью ингибировать ферменты антиокислительной защиты пероксидазу и каталазу,' что вызывает накопление токсичных для клетки перекисных соединений.

7. Способность ТКБ стимулировать фагоцитоз, влиять на функциональное состояние лимфоцитов, тромбоцитов и других клеток определяет его иммуномодулирующие свойства, которые совместно с бактерицидной активностью обеспечивают его протективное и лечебное действие на ранних этапах инфекционного процесса.

8. Гомеостазирующие функции тромбоцитарного катионного белка обусовлены его способностью стабилизировать мембраны нормальных соматических клеток и стимулировать распад и элиминацию дефектных клеток так же, как и микробных патогенов в патологическом очаге. Увеличение концентрации ТКБ в тканях, биологических жидкостях является информативным прогностическим и диагностическим тестом, свидетельствующим об острофазном характере развития патогенетических механизмов при различных заболеваниях.