Введение к работе
Актуальность темы исследования
Актинобактерии рода Rathayibacter Zgurskaya et al. 1993 (семейство
Microbacteriaceae) – аэробные, Грам-положительные, неспорообразующие,
неправильные палочки, содержащие 2,4-диаминомасляную кислоту (L-изомер) в составе пептидогликана клеточной стенки и преобладающий менахинон МХ-10 в дыхательной цепи. До начала нашей работы род включал 6 валидно описанных видов – R. caricis, R. festucae, R. iranicus, R. rathayi, R. tritici и R. toxicus, большинство из которых имеет высокое сходство по генам 16S рРНК (более 99%). Виды рода, за исключением R. caricis и R. festucae, являются фитопатогенами, вызывают гуммоз и задержку роста хозяйских растений. R. iranicus и R. tritici поражают пшеницу и ячмень, R. rathayi – ежу сборную, R. toxicus – плевел и ряд других злаков (McKay, Ophel, 1993; Sabet, 1954; Vidaver, 1982). R. toxicus образует также высокотоксичный гликолипид (коринетоксин), который является причиной неврологических расстройств и гибели травоядных животных (Chatel et al., 1979; Riley, Ophel, 1992; Sechler et al., 2017). Для ряда представителей Rathayibacter показана тесная ассоциация с фитопатогенными нематодами рода Anguina, которые считаются основными переносчиками инфекции (Murray et al., 2017; Riley, McKay, 1990).
Неоднократно отмечалась проблема идентификации бактерий этого рода на уровне вида, особенно изолятов из почв и растений без выраженных признаков заболевания (Arif et al., 2016; Collins, Bradbury, 1986; Murray et al., 2017). Проблема во многом обусловлена высоким сходством большинства известных видов Rathayibacter по традиционным фенотипическим признакам, наличием перекрестных реакций в серологических тестах, а также отсутствием универсальных праймеров для амплификации и секвенирования фрагментов ДНК с таксономическим разрешением на уровне вида, например, «housekeeping» генов (Evtushenko, Dorofeeva, 2012; Stackebrandt et al., 2007). С другой стороны, обнаружение в последние годы методами метагеномики и культуромики организмов Rathayibacter в самых разных природных и антропогенных источниках, в том числе, в тканях здоровых растений (Alenius et al., 2009; Bai et al., 2015; Grice et al., 2009; McGarvey et al., 2015; Osman et al., 2008а; Ulrich et al., 2008; Vishnivetskaya et al., 2006), и результаты наших исследований демонстрируют, что существующая сегодня система классификации практически не отражает видовое разнообразие непатогенных бактерий этого рода.
Неотъемлемым элементом таксономических исследований прокариот
становится в последние годы анализ полных геномов (Chun et al., 2018; Garrity, 2016;
Konstantinidis et al., 2017; Munoz et al., 2016; Parks et al., 2018; Thompson et al., 2015).
Геномика обеспечивает надежное и воспроизводимое установление
филогенетических отношений между организмами, лежащих в основе естественной биологической классификации, и способствует более точному определению рангов, структуры и границ таксонов. Интеграция геномики и систематики актуальна, в том числе, для уточнения таксономической структуры групп, включающих виды, трудно дифференцируемые по классическим фенотипическим признакам и имеющие высокий уровень сходства по генам 16S рРНК. До начала наших исследований
сведения о полных геномных последовательностях Rathayibacter имелись лишь для единичных штаммов вида R. toxicus.
Все вышесказанное определяет актуальность исследований, направленных на
развитие системы классификации актинобактерий рода Rathayibacter с
использованием современных подходов, включая методы геномики, а также разработку надежных методов идентификации ратайбактеров на видовом уровне.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было таксономическое изучение бактерий рода Rathayibacter, совершенствование таксономической структуры рода и развитие методов идентификации его представителей на уровне вида.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Формирование рабочей коллекции штаммов рода Rathayibacter.
-
Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК.
-
Конструирование праймеров, секвенирование и анализ последовательностей «housekeeping» генов -субъединицы ДНК-гиразы (gyrB), рекомбиназы A (recA), -субъединицы РНК-полимеразы (rpoB) и полифосфаткиназы (ppk).
-
Секвенирование, сборка и анализ полных геномных последовательностей представителей известных видов, а также новых штаммов Rathayibacter.
-
Получение и анализ МАЛДИ масс-спектров штаммов Rathayibacter.
-
Определение видовой принадлежности новых штаммов на основе принципов полифазной таксономии и характеристика новых видов рода Rathayibacter.
Научная новизна работы
Предложены три новых вида рода Rathayibacter (Rathayibacter oskolensis, Rathayibacter tanaceti sp. nov. и Rathayibacter acroptilonus sp. nov.), выделенные впервые из двудольных растений – проломника (Androsace koso-poljanskii Ovcz., Primulaceae), пижмы (Tanacetum vulgare L., Asteraceae) и горчака (Acroptilon repens L., Asteraceae). Получены доказательства принадлежности к разным видам рода Rathayibacter штаммов с высоким уровнем сходства генов 16S рРНК (до 99.79%).
С использованием сконструированных de novo праймеров впервые выполнен мультилокусный анализ «housekeeping» генов (gyrB, recA, rpoB, ppk) и определены пороговые значения сходства этих генов для всех видов Rathayibacter. Впервые секвенированы и аннотированы полные геномы типового штамма типового вида рода Rathayibacter (R. rathayi), а также типовых штаммов видов R. iranicus и вновь выявленных видов. Впервые проведен филогеномный анализ Rathayibacter (17 штаммов) и определены показатели средней идентичности нуклеотидов (ANI), частоты встречаемости тетрануклеотидов (TETRA) и ДНК-ДНК гибридизации in silico (dDDH) для видов рода. Впервые обнаружены гетерогенные копии генов 16S рРНК у представителей рода. Выявлены новые хемотаксономические маркеры рода Rathayibacter – компоненты МАЛДИ масс-спектров; обнаружены значения масс, характерные для каждого вида рода. Выявлены полярные липиды и сахара клеточных стенок, специфичные для отдельных видов Rathayibacter.
Научно-практическое значение работы
Создана коллекция охарактеризованных штаммов рода Rathayibacter, которые доступны широкому кругу специалистов для фундаментальных и прикладных
исследований. Существенно расширена база данных последовательностей генов 16S рРНК и «housekeeping» генов; полученные в настоящей работе последовательности депонированы в международные базы данных DDBJ/ENA/GenBank. Предложен экспресс-метод идентификации известных, в том числе, фитопатогенных, видов Rathayibacter и выявления новых видов на основе МАЛДИ масс-спектрометрии и анализа генов gyrB; разработаны специфические праймеры для амплификации и секвенирования этих генов. Полученные результаты могут быть востребованы в различных областях фундаментальных исследований (экология, фитопатология, эволюция и коэволюция микро- и макроорганизмов), при решении практических задач, касающихся повышения урожайности зерновых, фитосанитарного контроля, защиты прав интеллектуальной собственности на штаммы и т.п.
Личный вклад автора
Соискатель лично принимал участие в работе на всех ее этапах: разработке и апробации методов исследования, проведении экспериментов, обработке и обобщении полученных результатов, написании статей для публикации в научных изданиях и тезисов конференций. Соискателем непосредственно выполнены: восстановление и поддержание рабочей коллекции штаммов рода Rathayibacter; секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК; конструирование праймеров, секвенирование и анализ последовательностей «housekeeping» генов gyrB, recA, rpoB и ppk; анализ ряда полных геномных последовательностей; депонирование последовательностей в международные базы данных DDBJ/ENA/GenBank.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях:
-
Первой Пущинской школе-конференции ИБФМ РАН «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, 2014).
-
XXII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2015» (Москва, 2015).
-
XV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2015).
-
19, 20 и 21-й Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2015, 2016, 2017).
-
III Всероссийской конференции фундаментальной гликобиологии (Владивосток, 2016).
-
IV Международной конференции «Микробное разнообразие: ресурсный потенциал» ICOMID 2016 (Москва, 2016).
-
1-м Российском Микробиологическом Конгрессе (Пущино, 2017).
Публикации
Материалы диссертации представлены в 17 печатных работах: 6-ти статьях в изданиях, входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования, и 11-ти тезисах докладов и постерных сообщений.
Место проведения работы и благодарности
Работа выполнена на базе ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН в отделе «Всероссийская коллекция микроорганизмов».
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. Людмиле Ивановне Евтушенко за предоставленную тему и советы на всех этапах выполнения диссертации.
Автор искренне благодарен всему коллективу отдела ВКМ за плодотворное сотрудничество и помощь в освоении методов и интерпретации результатов. Особую благодарность автор выражает к.б.н. Любови Владимировне Дорофеевой за помощь в работе с культурами, к.б.н. Елене Викторовне Арискиной и к.б.н. Валентине Ивановне Краузовой за выполнение экспериментов по ДНК-ДНК гибридизации, Валентине Яковлевне Лысанской за помощь в определении состава клеточной стенки, Наталье Викторовне Присяжной за регистрацию и анализ МАЛДИ масс-спектров, к.б.н. Олегу Викторовичу Василенко и Сергею Владимировичу Тарлачкову за секвенирование ряда полных геномов и помощь на всех этапах анализа геномных данных. Автор благодарен всем сотрудникам ВКМ за доброжелательное отношение и поддержку, особенно старшему лаборанту Лидии Савельевне Травкиной.
Автор выражает огромную признательность сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. Наталье Егоровне Сузиной за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований, Наталье Григорьевне Винокуровой за определение полярных липидов и Борису Петровичу Баскунову за определение менахинонов.
Отдельную благодарность автор выражает сотрудникам Центра паразитологии ФГБУН Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН (Москва) к.б.н. Владимиру Николаевичу Чижову и к.б.н. Сергею Александровичу Субботину за предоставленные образцы растений, инфицированные нематодами и идентификацию нематод.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского фонда
фундаментальных исследований: «Новые таксоны коринеформных и
нокардиоформных актинобактерий» (РФФИ № 14-04-31825 мол_а) и
«Актинобактерии родов Clavibacter и Rathayibacter: развитие таксономической структуры и методов идентификации филогенетически близких видов» (РФФИ № 16-34-01048 мол_а).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список сокращений» и «Список литературы». Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 23 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 320 ссылок.