Введение к работе
Актуальность темы. Судя по научным публикациям последних лет, биологи-еская фиксация азота атмосферы остается проблемой, значение которой возрас-ает и выходит далеко за рамки биологии и сельского хозяйства. Главные причи-:ы этого сводятся к тому, что производство азотных минеральных удобрений по-ребляет до трети энергии, выделяемой на сельское хозяйство в развитых странах, их применение ведет к крайне неблагоприятным экологическим последствиям. "аким образом, наиболее важной альтернативой использованию азотных удобре-ий следует признать активное развитие и внедрение в сельскохозяйственную рактику принципов и методов биологической азотфиксации (Мишустин, Черепов, 1979).
В анализе взаимоотношений почвенных диазогрофов с растениями одно из ;ентральных мест занимают исследования молекулярных основ контактных (и об-іенньїх) взаимодействий между растительной и микробной клетками. В связи с тим внимание исследователей привлекают поверхностные структуры партнеров, частвующих в такого рода взаимодействиях (De Maagd, Lugtenberg, 1987, Smit et 1., 1989). При решении этой проблемы хорошую перспективу, очевидно, имеют одходы, связанные с применением методов иммунохимии (Kabat, 1976, Петров, іерезин 1982, Polak, Van Noorden, 1987). Благодаря высокой чувствительности и пецифичности, реакции антиген + антитело и их аналоги (углевод + лектин, фер-іент + субстрат и т.п.) создают благоприятную аналитическую основу для иден-ификации разнообразных природных соединений, для изучения их физико-имических и биологических свойств.
Одним из наиболее перспективных и быстро развивающихся аналитических редств иммуноцитохимии становится в последние годы метод, связанный с ис-ользованием в качестве биоспецифических маркеров конъюгатов коллоидного олота (КЗ) (Roth, 1983, Horisberger, 1985, De Mey et al. 1986, Богатырев, 1995). Іьісокая электронная плотность золота и сильное поглощение им света в видимой бласти спектра обеспечивают высокую эффективность данной метки при ее ис-ользовании, например, в методах световой и электронной микроскопии (как про-вечивающей, так и сканирующей). Интенсивная окраска золотосодержащего іаркера позволяет также проводить непосредственную визуализацию продуктов иоспецифической реакции в методах гомогенного и гетерогенного твердофазного ио- и иммуноанализа.
Несмотря на известные достоинства золотой метки, примеры ее систематиче-кого применения в микробиологической практике и, конкретно, в исследованиях очвенной микрофлоры пока весьма немногочисленны. Это можно, по-видимому, бъяснить недостаточной развитостью методологии иммуноанализа с применени-м КЗ. В том числе потребностью в создании новых биомаркеров на основе пер-пективных зондов, удовлетворяющих запросам исследовательской практики в бласти почвенной микробиологии, разработку биохимических и физико-имических основ аналитических методик с применением широкого спектра мар-еров - конъюгатов КЗ в сочетании с методами световой и электронной микроско-ии, твердофазного био- и иммуноанализа.
Цель работы. В данной работе мы попытались использовать преимущества иоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота для усовершенст-ования методологии иммуноцитохимического анализа клеточной поверхности очвенных ассоциативных азотфиксирующих бактерий. При этом были использо-аны, в основном, представители родов Azospirillum и Agrobacterium, которым уде-
ляется большое внимание исследователей, изучающих молекулярно-генетические механизмы ассоциативных взаимодействий микроорганизмов с растениями. В соответствии с данной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:
-
Разработать методику получения и варианты использования некоторых новых перспективных иммунохимических маркеров.
-
Разработать и апробировать методику определения относительной гидрофобное клеточной поверхности микроорганизмов с использованием золотосодержащего "катионного" маркера.
-
Исследовать особенности иммуноанализа на частицах золя золота в приложении к изучению биоспецифических взаимодействий.
-
Проанализировать варианты использования конъюгатов коллоидного золота в сочетании с методами световой и электронной микроскопии для изучения процессов колонизации корней пшеницы почвенными диазотрофами, для ультраструктурных исследований клеточной поверхности почвенных бактерий.
-
Оценить возможность использования коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации животных для пол)'чения антител к низкомолекулярным соединениям.
Научная новизна работы. Впервые разработаны методики получения и варианты использования новых биомаркеров на основе перспективных зондов: фал-лоидина, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, меченных коллоидным золотом. Последний из перечисленных зондов использован в разработке оригинальной методики определения относительной гидрофобности клеточной поверхности. Показано ее согласие с традиционными методами при том, что данная методика превосходит их в простоте и экспрессности. Впервые с помощью метода дот-анализа целых клеток (cell-gold immimoblotting) проведено изучение взаимодействия штамма A. radiobacter 5D-1 с антителами, целлюлазой и пектинами, меченными КЗ. Выявлены мутанты данного штамма, утратившие способность взаимодействовать с вышеперечисленными зондами. Блот-анализ с применением золотой метки сделал возможным определение участков полного электрофоретического спектра липополисахаридов (ЛПС) штамма A. brasilense Sp7, ответственных за иммунный ответ. С применением биоспецифических зондов - конъюгатов КЗ впервые проведено исследование локализации О-специфических полисахаридов, лектиновых рецепторов и целлюлозосодержащих компонентов на поверхности бактериальных клеток A. brasilense и A. radiobacter с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии. Показана целесообразность и разработана методика использования коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации животных для получения антител к биотину.
Практическая значимость работы. На основе разработанного и защищенного патентом РФ способа получения биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ в рамках Госзаказа Министерства науки и технической политики РФ создан Лабораторный технологический регламент и наработаны образцы 129 препаратов. Синтезированные биомаркеры и разработанные новые методологические приемы используются в ряде лабораторий ИБФРМ РАН. Кроме того, часть образцов передана по заказам 22-м организациям, включая академические и прикладные научно-исследовательские институты, Вузы, лечебные учреждения России и стран СНГ для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области биологии, биотехнологии и медицины.
Результаты работы были представлены на Международной выставке "Достижения Российской биотехнологии" (ФРГ, 1996 г.).
На защиту выносятся следующие основные положения:
Методики получения и варианты использования новых иммунохимических маркеров - конъюгатов КЗ на основе универсальных зондов: фаллоидина, целлюла-зы, фетуина, полиэтиленимина.
Новый метод определения относительной гидрофобности клеточной поверхности с использованием золотосодержащих "катионных" маркеров. Результаты иммуноцитохимических исследований клеточной поверхности у представителей почвенных диазотрофов с использованием препаратов КЗ в методах твердофазного иммуноанализа, световой и электронной микроскопии. Методика применения коллоидного золота в качестве носителя при иммунизации животных для получения антител к биотину.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ФХКС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих тем: "Изучение мо-кулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами оспирилл и культурных злаков", научный руководитель темы д.б.н. профессор В. Игнатов, № гос. регистрации 01860024516; "Разработка эффективных тест-стем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" научный ководитель темы к.ф.-м.н. зав. лаб. СЮ. Щеголев, № гос. регистрации 890017743. Работа поддерживалась Министерством науки и технической политики РФ в мках программы "Средства обеспечения исследований по физико-химической юлогии и биотехнологии" (Распоряжения № 1508ф от 11.05.93 г. и последующие). 1СТИЧНО данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда шдаментальных исследований (код проекта 94-03-09286) и Международного на-ного фонда (фонда Сороса) (номер гранта RNR000). Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы предав лялись, докладывались и обсуждались на: Всесоюзной школе "Электронная ікроскопия в молекулярной биологии", Звенигород, 1990; V International mposium on Nitrogen Fixation with Non-legumes, Florense (Italy), 1990; XV ternational Congress of Biochemistry, Jerusalem (Israel), 1991; VIII Eastern European mposium on Biological Nitrogen Fixation, Saratov (Russia), 1992; I International inference on Polysaccharide Engineering, Trondheim (Norway), 1994; I European itrogen Fixation Conference, Szeged (Hungary), 1994; NATO Advanced Research orkshop on Azospirillum and Related Microorganisms, Sarvar (Hungary), 1994; ternational Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with ants, Saratov (Russia), 1995; International Symposium on Biomedical Optics JROPE'95, Barselona (Spain), 1995; Beijerinck Centennial Conference Microbial lysiology and Gene Regulation: Emergings Principles and Applications, Hague (The :therlands), 1995, а также на заседании Саратовского отделения Всесоюзного юхимического общества и на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы ключая одно изобретение) в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав ключающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, ложение полученных результатов и их обсуждение), заключения, списка исполь-ванных литературных источников и приложения. Работа изложена на 130 стратах, иллюстрирована 15 рисунками и включает 5 таблиц. Список использован-IX литературных источников включает 187 наименований.