Введение к работе
1. Актуальность темы. Охрана окружающей среды - одна из глобальных проблем современной цивилизации. Насущная необходимость экономии металла и древесины стимулирует многотоннажное производство заменяющих их пластических масс во всем мире. Для улучшения свойств пластмасс применяются пластификаторы преимуде-ственно на основе фталевой кислоты. Однако, несовершенство используемых технологических процессов, особенности строения пластических изделий, в которых пластификатор не закреплен химическими связями с полимером, приводят к загрязнению окружающей среды. Во многих странах в объектах окружающей среды регистрируется Значительное количество токсикантов техногенного происхождения, а том числе и эфиров о-фталевой кислоты ( Mayer et al. , 1972; (uedhill et al. ,1980; Hans, 1987; Tur«n, Larsson, 1990 ; Клюев, уродский, 1993). Экспериментальные доказательства мутагенных, тератогенных свойств и канцерогенной активности о-фталатов при зтоль широком распространении их в окружающей среде свидетельствуют об их угрозе здоровью человека ( Гончарова, Кужир, 18Я4: Kluwe at al. , 1982, 1988; Dostal at al. , 1988; Воронин, 1993).
Раэрувение токсикантов в биогеоценозах осуществляется при взаимодействии биотических и абиотических факторов. Микроорганизмам, благодаря их уникальной способности адаптироваться к ус-ловиям окружающей среды, принадлежит ведущая роль в деструкции загрязняющих веществ. В последние десятилетия появились сообщения об исследованиях по деградации эфиров о-фталевой кислоти ( Кеувег at al, 1976; Kurftrte et al. , 1877, 1902, 1984; Eaton, Ribbons, 1982; Williams,. Dale, 1883; Hirando-Romero, Gutierrez Castrejon, 1984; АлещенКова И др, 1993, 1994! Гофароб, Наумов, 189*), которые демонстрируют возможность деградации их представителями родов Peeudononaa, Bacillus, Cordnebtct erlujn. Micrococcus, Nocarctia, Aspergillus, Rhodotorula. В доступной паи литературе отсутствуют сведения о деструкции иирокого ряда эфиров о-фталевой кислоты бактериями рода Rhodococcus. Однако^ расширение круга исследований в этой области представляется чрезвычайно перспективным благодаря возможности практического использования микроорганизмов для детоксикации ксенобиотиков ( Гвоздях и лр 3986; Ной, 3990; Головлева Л. А. , 1992; SingKon. іячл, Самсомова, 399b).
Физико-химические методы и традиционная биологическая очистка малоэффективны в деконтаминации сточных вод и почвы от ?тиров о-фталевой кислоты. В связи с этим разработка надежных микробиологических методов очистки от них сточных вод и почвы приобретает важное народнохозяйственное значение.
Получение наиболее активных штаммов-деструкторов, исследование утилизации и особенностей ферментативной атаки, а также чнализ разрушения о-фталатов в связи с проблемой соотношения между, химической структурой и особенностями деструкции представляют теоретический интерес. Полученные в этой области данные послужат основой для ррвения практических задач охраны обьектов окружающей среды от загрязнения эфирами о-фталевой кислоты.
Связь работы с крупными научными программами, тамами. Диссертационная работа выполнена в лаборатории экологии микроорганизмов Института микробиологии АН Беларуси в течение 1890-1996гг. в рамках научно-исследовательских тем: "Разработать м внедрить микробиологические методы, предотвращающие загрязнение окружающей среды и сельскохозяйственной продукции выбросами предприятий химической промышленности", Н Гос. регистрации 01. 9. 10022751 (РНТП 75.02р, "Охрана природы", 1981-1993гг. > и "Изучение метаболических путей микробной деградации эфиров фталевих кислот штаммами микроорганизмов-деструкторов", К Гос. регистрации 1993242 ( РПФИ "Биотехнология", 1993-1995 гг. ).
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в выявлении особенностей процесса разложения эфиров о-фталевой кислоты различного строения бактериями рода Rhodoooocus. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
выделение, получение, идентификация и скрининг активных штаммов микроорганизмов с повышенной способность» деградировать эфиры о-фталевой кислоты;
исследование зависимости процесса деградации эфиров о-Фтал'еэой кислоты от их химического строения;
установление оптинальных параметров разрушения эфиров о-фталевон кислоты родококками;
определение метаболических путей деградации эфиров о-фталевой кислоты;
выявленив активности и природы Ферментных систем, осуве -сгвляюиих д^градаци» эфиров о-фталевой кислоты;
- исследование разложения эфиров о-фталевой кислоты в почве интродуцироаанными бактериями-деструкторами.
научная цови^на полученных результатов. Впервые исследоьан процесс разложения эфиров о-фталевой кислоты нормального, разветвленного алкильного и фенильного типа различными видами бак терий рода Rhodococcus. Предложена схема пути деградации эфиром о-фталевой кислоты у родококков, отличная от таковой у лсеедо-монад и микрококков. Впервые получены данные о субстратной специфичности фермента, гидролиэуюжего эфиры о-фталевой кислоти и активности диоксигенаэ, участвуючих в разрыве ароматического кольца у различных видов рода Rhodocoocus. Впервые показана ьо-j мощность применения микроорганизмов-деструкторов эфиров о-фтале вой кислоты, иммобилизованных на торфяном носителе, ДЛЯ ЛОКа льной очистки почвы от орто-фталатов. Полученные в работе результаты значительно расяиряют и дополняют существующие представления о микробной деструкции широко распространенных пил лютантов - эфиров о-фталевой кислоты родококками.
Практическая значимость полученных результатов. Выделенные и полученные путем адаптивной селекции «таммы микроорганизма» -деструкторов могут быть использованы для очистки СТОЧНЫХ ВОД И почвы от -эфиров о-фталевой кислоты. Ькспериментальные данные о путях метаболизма эфиров о-фталевой кислоты будут полезными при разработке практических приемов получения новых втаммов микроор ганиэмов, способных деградировать более стойкие эфиры фталешм кислот. Р&эработ&н и изучен в условиях лабораторной модели еио-технологический прием интенсификации процесса разрушении в почне эфиров о-фталевой кислоти с помощью интродуцированных микрооц-а низмов-деструкторов.
Эдинминивская значимость ешлучвнлы» вазультатень Испольли вани а втаммов микроорганиэмов-деструкторов эфиров о-фталепои кислоты в биотехнологии очистки почвы имеет суцествениый социальный эффект, выражающийся в охране окружающей среды от миг і-,г.. нения. Ітаммьі и разработанные на их основе биотехнологии яелмюг--ся коммерческими продуктами, которые могут быть реализованы за интересованным организациям по договорным ценам.
Основные положения диссертации, вьжосимчд .«а зашиту.
1. Бактерии рода Rhodococcus способны использовать эфиры о-фталевой кислоты в качестве единственного, источника углерода Представители вида R. erythropolis обладают широкой суоетратнеи
специфичность» в отнесении эфиров о-фталевой кислоты раз-яичного строения (н-алкил-, нэо-алкил-, фенилфталаты).
2. Деградации эфиров о-фталевой кислоты осуществляется по
средством гидролиза нх во фталеву» кислоту. Фермент обладает
алрокой субстратной специфичностью и является индуцибельннм.
3. Предложен пути утилизации эфиров о-фталевой кислоты:
диэфир*г Фталевая кислота* бензойная кислота** П-0БЇ-* ПН- У ис
следованных родококков разрыв ароматического кольца идет по
орто-пути, что подтверждает выявленная в активном состоянии
протокатехат-3,4-диоксигеназа.
4. Экспериментальное обоснование принципиальной возможности
использования полученных штаммов родококков для ускорения про
цессов естественного самоочищения почвы от наиболее распростра
ненны» загрязнителей окружающей среды - эфиров о-фталевой кис
лоты ДИФ, ДБФ, ДЭГФ.
ДіІМНЧЙ. РПЛЗД срНСкателя. Диссертант принимала непосредственное участие в получении экспериментальных данных, составляющих основу диссертации, их анализе, обобщении и изложении материала настояией работы.
Апробация результатов )\л съездах. цшіф<;в.еііщц», Результати
Исследований, включенных в диссертационную работу, докладывались на: Международной конференции "Загрязнение "окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии" Москва-Пермь, ЗЭ9Э г. і ХУ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Минск, 1993 г. ; VI Конференции Российской федерации " Новые направления биотехнологии", Пущине, 1994г. ; Международной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущине 1996г.
Опубликовднность результатов. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 4 тезиса международных конференций.
Структура и объем диссертации.. Работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, четырех глав экспериментальной.! части, анализа и обобщения результатов исследований, виводов, списка цитируемой литературы, включающего 173 Источников Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включающих 26 рисунков и 19 таблиц.