Введение к работе
Актуальности прошлом;.'. ЛеП';:сплрози относятся г: группе nar'j'j-яее распространенных >« социально аначииых природкоочвговых зоонозоь. о последние годы на территории Российской їсдерации отпечена тенденция к росту заболеваемости этими-инфекциями среди людей. По тяжести кл:::шческого течения и показателям детальности, достигающий в отдельных регионах страны 30%, они занимают одно «* »~^;:«ч «««' в инфсюшояип» "~г:л«.«и "*т~;г~ «.«-- '^ггеп:^ Г..д., іззО). С од-»" сгс>-п«, это обусловлено возрастанием этиологической роли наиболее ВИрулеНИШХ ЛеПТОСПйр СерОГруПП latarohaeoorrfcSLglae- И Oaaleola ,
с другой - отсутствием эффективных аетодов ранней экспресс-диагностики.
В литературе имеются сообщения о развитии отдаленных клинических, в частности неврологических, последствий у людей, перебсіевших иеиингоэнцефалитаыи лепгоспирозиой этиологии (3aouit. , 1982). Получены экспержензальные доказательства возможности персистенция леп-їсепир в тканях центральной нервной системы млекопитающих (Ананьина її.В., 1988, 1993). Однако эткопатогенез этих процессов практически не изучен из-за отсутствия эффективных методов индикации перс/.сти-руздих возбудителей.
Чувствительность рязраСотанніїх к настоящему времени методов индикации лептоспир (микроскопические, иммунологические, иолекулярно-
^ 7
гоїісіические) довольно низка: от Ю-*'до 10 клеток в I мл. Эффективность ранее.использованного для изучения феномена гостальной персястекцта бактериологического метода ограничена ввиду широкого спектра питательных потребностей лептоспир, наличия среди них труднокультивируемих штаммов, а также действия компонентов тканей оргаиизиа-хозявна на их рост laTitro
Более перспективным в этом отношении представляется метод поли-меразной цепной реакции іПЦР), основанный на амплификации in vitro специфических последовательностей ДНК и отличающийся высокой
ЧуВСТВИТеЛЬНОСТЬЮ И СПецИфИЧНОСТЬЮ (KuTLU. , SaifcL , 1985-1988).
Ранее разработанные за рубежом высокочувствительные тест-системы на основе ПЦР для индикации лептоспир ( пп Еу» , 1989; о«тв-івшр , І990;нооісеу , 1992;иаг1вп , 1992; Peroiat ,1993) обладают родовой, либо серогрупповой специфичностью. Это обстоятельство ограничивает возможности их использования в политипичных очагах лептоспирозов. Более того, они применялись исключительно в диагностических целях и не предпринималось попыток их использования для решения научных проблем, в частности, для изучения феномена персистенции лептоспир. Поэтому представляется актуальной разработка тест-системы ПЦР, специфичной для всех патогенных лептоспир
ВИДа Leptospira in-terrogans И Применение ЄЄ В ЦЄЛЯХ раННеЙ ЭКСПрвСО-
диагностики лептоспирозов и изучения феномена гостальной персистенции лептоспир.
Цель исследования. В связи с изложенным целью работы явилась разработка высокочувствительного и видоспецифичного метода индикации xeptospira interrogans на оснозе полицеразной цепной реакции для изучения феномена гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспирозов.
Основные задачи исследования:
-
Подобрать оптимальные- условия постановки ПЦР, обеспечивающие таксономическую специфичность тест-системы; определить ее чувствительность па препаратах очищенной ДНК и лизатах клеток чистых «ультур лептоспир.
-
Разработать сп-тииальныс способи подготовки проб клиничсско-
-3-го и патологического материала для исследования в ПЦР.
3. Определить чувствительное?"1 тест-спстеш.: ПЦР при пндпкаїу.. лептоспир т, клиническое и патологическом материале на иодцдьнкх образцах.
'+. Оценить сравнительную эффективность ПЦ?, багете; полэгпческо-го и микроскопического методов индикации при экспериментальной
ОСТРОЙ ЛеПТОСПИрОЗНОЙ ИНфеКЦИИ И ПерСЯСТеЛПИИ *"—*—«xw.nn я п«~;
5. дать оценку эффективности тест-системы ПЦР при диагностике лептоспирозов у больных на различных стадиях заболевания.
Научная новизна. Разработана тест-система на основе ПЦР, обладающая высокой чувствительностью, таксономической специфичностью и позволяющая в короткие сроки проводить индикацию патогенних лепто-спар большинства эпидемически значима серогрупп. Б экспериментах на лабораторных животных и модельных системах ш vitro показана более высокая диагностическая эффективность ПЦР по сравнению с традиционными методами индикации лептоспир в тканях организма-хозяина на разных стадиях инфекционного процесса. Впервые метод ПЦР был применен с целы) изучения гостальяой персистепции лептоспир, что позволило расширить спектр сероваров лептоспир, для которых устс-яовлена способность перемстировать в тканях центральной нервной зистемы млекопитающих: выявлена дерсистенция низковирулентных и груднокулътивируемых лептоспир серовара е*хЗы>вът«. в тканях голов-юго мозга золотистых хомячков. С помощью ПЦР получены также новые данные о продолжительности персистенции и локализации в различных :труктурах головного мозга хомячков лептоспир сероваров сорвпьа^еш,
laikoeblng, mozdok.
Практическая значимость работы. Показана принципиальная воз-
- It -
меткость использования разработанной аыплификационной тест-системы л целях экспресс-диагностики лептоспирозов людей как на ранних стадия;; заболевания (включая серонегативные случаи), так и при отдаленных клинических последствиях. Полученные в работе данные используются при чтении лекций для врачей-бактериологов и эпидеииологов в Информационной Центре Госсанэпиднадзора РФ и Российской Медицинской Академии последиллоыного обучения.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены ка совместной конференции отдела инфекций с природной очаговостью и лаборатории генной инженерии патогенных ыикроорганизиов НИИЗІ mi. Н.Ф.Гамалеи РАМН 10 ноября 1994г., на заседании сектора инфектоло-гии отделения профилактической медицины РАЫН (октябрь 1992г.) и на УІ Международной Европейской конференции по зоонозам в Словакии (октябрь 1993г.).
Публикации. По ыатериалаи диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисов в отечественной и зарубеяной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы, вгакгаащего 390 работ (из них на русском языке - 189, на иностранных языках - 201 > Работа изложена на 189 страницах машинописи, иллюстрирована 18 таб» лицами и 8 рисунками.