Введение к работе
Актуальность темы. Целенаправленная научно-обоснованная борьба с инфекционным заболеванием начинается с установления природы его возбудителя. Особенно это важно для карантинных инфекций, в частности для холеры, когда в кратчайшие сроки требуется принятие решения и осуществление ответственных противоэпидемических и профилактических мероприятий.
Проблема холеры остается актуальной в связи с особенностями ее современного широкого распространения по континентам и странам (Онищенко Г.Г. с соавт., 1992; Марамович А.С. с соавт., 1994; Ломов Ю.М. с соавт., 1995).
При этом весьма существенное, даже решающее значение имеет первый точный бактериологический диагноз, в котором определяющим звеном служит серологический этап исследования.
Одним из перспективных направлений усовершенствования препаратов для идентификации возбудителя холеры является создание диагностикумов на основе моноклональных антител (Алексеева Л.П., 1983). Однако прогресс в этом направлении в нашей стране сдерживается отсутствием или дефицитом коммерческих реактивов и в еще большей мере - недостаточностью сведений о природе антигенов холерного вибриона.
В любом случае для точной серологической детекции холерного вибриона требуется высококачественная холерная агглютинирующая О-сыворотка. В настоящее время в связи со значительным снижением потребности выпуск лошадиных холерных О-сывороток стал экономически не выгодным. Кроме того, лошадиная холерная агглютинирующая О-сыворотка в силу физиологических особенностей продуцента недостаточно видоспецифична, в связи с чем технология ее производства предусматривает как дополнительный этап адсорбцию неспецифических (перекрестно-реагирующих) антител убитыми формалином холерными вибрионами не 01 группы. Однако, эта трудоемкая и требующая больших количеств микробной массы процедура не обеспечивает высокой специфичности готового препарата. При адсорбции удаляются антитела не только к штаммам, используемым в качестве адсорбента, но и существенно снижается титр специфических антител (Дертева И.И. с соавт., 1972; Тюменцев С.Н. с соавт., 1983).
Более рационально использовать кроликов в качестве продуцентов иммунных сывороток, которые более специфичны, чем аналогичные препараты от крупных животных, в частности лошадей (Андреевская Н.М., 1987). Своеобразие сывороточных антител кролика обусловлено тем, что их антиген-связывающие центры соответствуют группировкам из 2-6 простых Сахаров в молекуле О-антигена, а поскольку вероятность встречаемости именно таких
сочетаний в О-антигенах других бактерий невелика, иммунные сыворотки кроликов содержат меньшее количество гетерогенных антител и дают соответственно меньше перекрестных реакций (Staub A.M., 1964; Staub A.M. et al., 1966). По этой причине при изготовлении кроличьих агглютинирующих сывороток создается возможность исключения из технологического процесса этапа адсорбции неспецифических антител.
Активность и специфичность агглютинирующих сывороток обусловливается целым рядом факторов: свойствами иммунизирующего антигена, схемой иммунизации животных, включая способы, дозы, кратность и периодичность введения антигена, видовыми и индивидуальными особенностями иммунологической реактивности животных-продуцентов (Карпов СП. с соавт., 1976; Смирнов В.В. ссоавт., 1980; Андреевская Н.М., 1987).
В настоящее время в производстве холерных агглютинирующих сывороток в качестве антигена для иммунизации животных-продуцентов используют препараты, получаемые обработкой микробных клеток кипячением (корпускулярный О-антиген), или препараты на основе экстрагированного липополи-сахарида (ЛПС) /растворимый О-антиген/. Наличие балластных веществ в корпускулярном антигене стимулирует у животных-продуцентов выработку перекрестно-реагирующих антител, для удаления которых сыворотки подвергают трудоемкой операции - адсорбции неспецифических антител. С другой стороны, изолированный из вибриона ЛПС, как правило, высокотоксичен. Указанные обстоятельства делают актуальным поиск таких способов инактивации микробной массы и выделения иммуногенных препаратов, которые позволяют получать агглютинирующую кроличью О-сыворотку с высоким титром специфических антител.
Перспективным в этом плане может оказаться препарат клеточных оболочек холерного вибриона, получаемый путем лизиса (с одновременным обеззараживанием) живых клеток мочевиной (Голубинский Е.П. с соавт., 1988), поскольку традиционные способы инактивации холерных вибрионов (кипячение, обработка формалином или фенолом) существенно снижают антигенность получаемого материала (Kabir S., 1989).
Срок годности коммерческих диагностических холерных сывороток составляет 5 лет. Однако, судя по результатам переконтроля сыворотки некоторых серий по этому показателю не соответствуют требованиям нормативной документации. В силу этого повышение стабильности иммунобиологических препаратов, т.е. их способности длительно сохранять физические, иммунохимические и биологические свойства, продолжает оставаться в центре внимания исследователей.
Цель работы. Разработка технологической схемы получения стабильной специфической кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки для идентификации и серологической характеристики штаммов холерного вибриона.
Задачи работы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить препараты О-антигена холерного вибриона разными способами, изучить их физико-химические и биологические свойства и пригодность для получения диагностической холерной агглютинирующей О-сыворотки.
-
Разработать или оптимизировать схемы иммунизации кроликов - продуцентов холерной О-сыворотки.
-
Отработать технологию получения кроличьей высокоактивной специфической холерной агглютинирующей О-сыворотки.
-
Разработать способ стабилизации кроличьей холерной О-сыворотки с целью повышения срока ее годности.
Научная новизна работы.
Впервые проведено широкое сравнительное изучение физико-химических и биологических свойств полученных разными способами антигенов холерного вибриона с целью оценки их антигенной активности. Показано, что наиболее пригодными в качестве антигена для иммунизации кроликов-продуцентов являются клеточные оболочки и делипидизированный липополиса-харид.
На основе теоретических предпосылок и экспериментальных исследований разработаны научно-методические подходы к решению проблемы повышения эффективности получения гипериммунной высокоактивной специфичной холерной агглютинирующей О-сыворотки, не нуждающейся в адсорбции групповых антител.
Установлено, что при определенных условиях иммунизации кроликов О-антигеном холерного вибриона может наступить специфическая иммунологическая ареактивность животных-продуцентов холерной агглютинирующей О-сыворотки. Разработанные и успешно апробированные принципы иммунизации животных позволили предотвратить возникновение подобного явления.
В отношении холерной агглютинирующей О-сыворотки впервые успешно применен множественный изотермический тест на ускоренное разрушение антител, позволяющий оценивать стабильность диагностических препаратов.
Выявлено, что наилучшим стабилизирующим эффектом при хранении диагностической сыворотки обладает смесь сахарозы и тиосульфата натрия, добавляемые к препарату в установленных концентрациях. Оригинальный способ стабилизации кроличьей агглютинирующей О-сыворотки защищен авторским свидетельством.
Практическая значимость работы. Разработана и рекомендована в практику эффективная и экономичная технология получения стабильной холерной агглютинирующей О-сыворотки при использовании в качестве продуцентов кроликов. За счет оптимизации схемы иммунизации продуцентов и исключения этапа адсорбции гетерологических агглютининов срок получения конечного продукта сокращен до 45 сут. Предложен способ стабилизации О-сыворотки, позволяющий продлить срок ее хранения (до 9 лет, срок наблюдения) без потери исходных свойств. По материалам диссертации разработаны и внедрены экспериментально-производственный регламент № 393-92 на сыворотку диагностическую холерную О-агглютинирующую неадсорбированную кроличью сухую для реакции агглютинации (регламент утвержден директором Иркутского противочумного института 25.08.92 г., согласован с директором Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича 26.12.96 г. и переименован в регламент производства № 393-96 15.11.96 г.); внесены изменения в фармакопейную статью № 42-349ВС-90 на сыворотки диагностические холерные "О"- 1 - адсорбированную и неадсорбированную, сухие для РА; разработаны "Методические рекомендации по очистке липополисахарида холерного эльтор вибриона с использованием иммобилизованного полимиксина В", которые одобрены ученым советом Иркутского противочумного института (протокол № 3 от 7.02.86 г.) и утверждены директором института; предложен оригинальный метод стабилизации кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки" (авторское свидетельство № 1592780 от 15.09.1990 г.).
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Выбор оптимальных препаратов О-антигена холерного вибриона для получения кроличьей специфической высокоактивной холерной агглютинирующей О-сыворотки.
-
Технология получения стабильной кроличьей холерной агглютинирующей О-сыворотки.
3. Способ стабилизации кроличьей холерной агглютинирующей О-сыво
ротки с целью повышения срока ее годности.
Работа выполнена в лаборатории диагностических сывороток и биохимическом отделе Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока в соответствии с планом НИР в рамках двух тем: «Использование деградированного липополисахаридного О-антигена для получения высокоактивных и специфичных холерных сывороток» и «Разработка требований к однородности и стабильности бакпрепаратов для профилактики и диагностики особо опасных инфекций».
7 Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на:
научной конференции молодых ученых Сибирского института физиологии и биохимии растений, Иркутск, 1984;
научно-практической конференции по проблеме "Холера", Ростов-на-Дону, 1984;
Всесоюзной научно-практической конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии", Махачкала, 1990;
научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противо
чумного института Сибири и Дальнего Востока, Иркутск, 1984-1997 гг.
Публикации . По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе одно авторское свидетельство.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц и 12 рисунков. Список литературных источников содержит 176 наименований, в том числе 69 зарубежных.