Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 33
1.1. Микрофлора свежевыловленной и охлажденной рыбы 33
1.2. Микробиологическая порча охлажденной рыбы 35
1.3. Бактерии, вызывающие инфекции, передаваемые пищевым путем, и порчу продукции 37
1.4. Подходы к деконтаминации пищевых полуфабрикатов 42
1.5. Инновационные способы деконтаминации продуктов питания 52
Результаты собственных исследований
ГЛАВА 2. Создание безопасного и эффективного коктейля бактериофагов как основы технологического вспомогательного средства для деконтаминации пищевых полуфабрикатов 62
2.1. Определение видов бактерий, способствующих микробиологической порче охлажденных гидробионтов 63
2.1.1. Отбор бактерий-мишеней, приводящих к микробиологической порче 64
2.1.2. Подтверждение отсутствия умеренных бактериофагов в потенциальных бактериях-хозяевах 65
2.1.3. Изолирование бактериофагов, активных в отношении определенного спектра бактерий-мишеней
2.2. Фенотипическая характеристика (биологические свойства и морфологическая структура) изолированных штаммов-кандидатов бактериофагов, лизирующих бактерии, вызывающие микробиологическую порчу 68
2.3. Устойчивость полученных бактериофагов к агрессивным факторам окружающей среды 75
2.3.1. Устойчивость бактериофагов-кандидатов к повышенным и
пониженным температурам
2.3.2. Устойчивость бактериофагов-кандидатов к воздействию хлороформа 75
2.3.3. Влияние сред с разными водородными показателями на титр бактериофагов-кандидатов 76
2.3.4. Определение параметров инфекционного процесса в системе фаг-клетка для бактериофагов, входящих в состав технологического вспомогательного средства 77
2.3.5. Определение частоты возникновения фагорезистентных бактериальных мутантов 83
2.4. Модификация метода получения фаговой биомассы с высокой
литической активностью и предельно низким содержанием токсинов 83
2.4.1. Подбор оптимальных значений температуры для культивирования бактериофагов 83
2.4.2. Апробация жидких и плотных питательных сред для высокотехнологичного культивирования бактериофагов 84
2.4.3. Принципы модификации метода получения бактериофага с высокой литической активностью и предельно низким содержанием токсинов
2.5. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов-кандидатов бактериофагов 86
2.6. Оценка безопасности технологического вспомогательного средства на основе коктейля вирулентных, оригинальных бактериофагов, активных в отношении бактерий-мишеней, вызывающих микробиологическую порчу охлажденной рыбы
2.6.1. Исследование острой токсичности коктейля бактериофагов 92
2.6.2. Хроническая токсичность коктейля бактериофагов 93
2.6.3. Влияние технологического вспомогательного средства на основе коктейля бактериофагов на нормальную микрофлору кишечника лабораторных животных
ГЛАВА 3. Получение готовой формы технологического вспомогательного средства и оценка его эффективности в процессе фаг-опосредованного биопроцессинга охлажденной рыбы 98
3.1. Конструирование рецептуры и разработка технологии получения готовой формы технологического вспомогательного средства на основе бактериофагов 98
3.1.1. Отработка рецептуры ТВС 98
3.1.2. Пилотная технология получения ТВС 99
3.1.3. Определение срока годности технологического вспомогательного средства на основе коктейля бактериофагов 103
3.2. Оценка эффективности ТВС на основе бактериофагов для деконтаминации охлажденной рыбы 104
3.2.1. Оценка эффективности литического действия бактериофагов на поверхности охлажденной рыбы в лабораторных условиях 104
3.2.2. Отработка метода промышленного фаг-опосредованного биопроцессинга на базе форелеводческого хозяйства 111
3.2.3. Оценка эффективности разработанного метода фаг-опосредованного биопроцессинга в условиях конвейерной переработки производственной партии радужной форели 114 Заключение 118
Выводы 126
Практические рекомендации 127
Перспективы дальнейшей разработки темы 127
Список сокращений 128
Список литературы
- Бактерии, вызывающие инфекции, передаваемые пищевым путем, и порчу продукции
- Подтверждение отсутствия умеренных бактериофагов в потенциальных бактериях-хозяевах
- Подбор оптимальных значений температуры для культивирования бактериофагов
- Отработка метода промышленного фаг-опосредованного биопроцессинга на базе форелеводческого хозяйства
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Применяемые в пищевой промышленности современные технологии
деконтаминации и продления сроков годности продуктов питания, в том числе
охлажденной рыбы, не являются надежными, как с точки зрения предохранения
последних от микробной порчи, так и в качестве средств защиты потенциальных
потребителей т патогенных агентов, чем свидетельствует непрерывное
увеличения числа регистрируемых случаев инфекций, передаваемых пищевым путем (Food-born infections - FBI), возбудителями которых являются Salmonella, Campylobacter, Е. coli, Listeria и др. (Акимкин В.Г., и др., 2002; Altekruse S. F., et al., 1997; DuPont H. L., 2007; Garcia P., 2008).
В связи с возможностью попадания микродоз антибиотиков с пищевыми
продуктами в ганизм ловека и стремительным формированием
антибиотикорезистентных штаммов бактерий - возбудителей инфекций, передаваемых пищевым путем, производители продуктов питания, в том числе рыбоперерабатывающего сектора, с конца 1990-х годов ограничили применение химических антибактериальных агентов, используемых при переработке пищевых полуфабрикатов, что стало одним из ведущих факторов увеличения количества случаев рассматриваемой категории инфекционных заболеваний (Beutin L., 2006).
В качестве инновационных средств деконтаминации, используемых при переработке охлажденной ыбы, рядом второв предложены природные антибактериальные агенты - бактериофаги (вирусы бактерий), характеризующиеся специфической способностью к инфицированию и последующему лизису бактериальных леток (Алешкин А.В., и др., 2013; Sulakvelidze A., 2013). Бактериофаги могут применяться на каждом из этапов пищевого производственного континуума: т прижизненной санации гидробионтов до иопроцессинга полуфабрикатов с целью элиминации эпидемиологически значимых бактерий и увеличения сроков хранения продукции (O'Flynn G., et al., 2004; Sharma M., et al., 2009; Soni K.A., et al., 2010; Bigot B., et al., 2011; Spricigo D.A., et al., 2013; Endersen L., et al., 2014).
Степень разработанности темы исследования
С 2006 года, после регистрации и признания Управлением по продовольствию и медикаментам США (US FDA) фагосодержащего технологического вспомогательного редства - processing aid, на основе поливалентного листериозного коктейля бактериофагов ListShield (Intralytix, США), позволяющего производить обработку готового к употреблению мяса домашних животных, птиц, охлажденной ыбы морепродуктов, «абсолютно безопасной» - Generally Recognised as Safe (GRAS), в Америке и станах западной Европы начали появляться биотехнологические компании (Intralytix Inc., Micreos Inc., OmniLytics Inc.), активно разрабатывающие эффективные технологические вспомогательные средства (ТВС) для деконтаминации пищевых продуктов от эпидемиологически значимых штаммов бактерий с целью снижения риска возникновения спорадических случаев и вспышек инфекций, передаваемых пищевым путем (Guenther S. and Loessner M., 2009; Soni K., 2010). В то время как в Российской Федерации до сегодняшнего дня нет ни одного зарегистрированного технологического спомогательного редства на основе бактериофагов, используемого для деконтаминации и продления сроков годности пищевых полуфабрикатов, включая охлажденную рыбу.
Цель исследования:
Создание безопасного и эффективного средства деконтаминации на основе поливалентного коктейля бактериофагов, активного в отношении бактериальных патогенов, вызывающих как порчу охлажденной рыбы, так и кишечные инфекции у человека.
Задачи исследования:
-
Определить основные виды бактерий , являющиеся причиной порчи охлажденной рыбы , а также вызывающие острые кишечные и пищевые токсикоинфекции у человека.
-
Изолировать из объе ктов окружающей среды и отобрать , используя фенотипическую и молекулярно-генетическую оценку , производственно -перспективные штаммы бактериофагов, активные в отношении бактериальных патогенов, вызывающих порчу охлажденной рыбы.
-
Разработать рецептуру, пилотную технологию получения технологического вспомогательного средства на основе бактериофагов, а также алгоритм фаг-опосредованного биопроцессинга охлажденной рыбы в лабораторных условиях . Определить срок годности и условия хранения фагосодержащего средства.
-
Подтвердить безопасность использования средства биодеко нтаминации охлажденной рыбы на лабораторных животных.
-
Оценить эффективность технологического вспомогательного средства на основе бактериофагов в соответствии с разработанным алгоритмом фаг -опосредованного биопроцессинга в условиях реального рыбоперераба тывающего предприятия.
Научная новизна исследования
Выявлены определенные закономерности, подтверждающие взаимосвязь нарастания количества бактерий видов Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Raoultella ornithinolytica, Citrobacter freundii, Listeria monocytogenes и органолептических изменений, характеризующих порчу охлажденных гидробионтов.
Впервые в РФ, на основе изолированных из объектов окружающей среды и охарактеризованных с фенотипической и молекулярно-генетической точки зрения штаммов бактериофагов, обладающих литической активностью в отношении бактерий P. fluorescens, A. hydrophila, P. putida, R. ornithinolytica, C. freundii, L. monocytogenes, вызывающих порчу охлажденной рыбы и инфекции, передаваемые пищевым путем у человека, сконструировано эффективное средство деконтаминации охлажденной рыбы.
Сформирована и адаптирована многоступенчатая схема контрольно-испытательных мероприятий новой категории биоконсервантов - технологических вспомогательных средств на основе бактериофагов.
Усовершенствована пилотная технология получения поливалентных фаговых коктейлей, позволяющая нарабатывать средство деконтаминации охлажденной рыбы с высоким титром фаговых частиц и низким содержанием эндо - и экзотоксинов.
На базе одного из ведущих предприятий рыбоперерабатывающей отрасли Российской Федерации создан алгоритм промышленного фаг-опосредованного биопроцессинга охлажденной рыбы, позволяющий продлевать срок годности данной категории полуфабрикатов и снижать риск заражения инфекциями, передаваемыми пищевым путем при их употреблении.
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования, разработанный проект нормативно-технической документации и алгоритм промышленного фаг-опосредованного биопроцессинга позволили сформировать теоретические предпосылки для создания нового для Российской Федерации класса технологических вспомогательных средств на основе бактериофагов.
Созданный алгоритм оценки безопасности и эффективности биоконсервантов на основе бактериофагов позволит разработать регистрационную процедуру для нового класса технологических вспомогательных средств, содержащих бактериофаги.
Разработан проект нормативно-технической документации на технологическое вспомогательное средство на основе коктейля бактериофагов , включающий: рецептуру, технические условия, технологическую инструкцию и проект этикетки.
Подана заявка на патент на изобретение РФ № 2016150928 от 23.12.2016 г. содержащая оптимальный фаговый состав, способ получения и метод применения технологического вспомогательного средства для обработки охлажденной рыбы.
Разработанное средство деконтаминации охлажденной рыбы на основе коктейля бактериофагов и усп ешно апробированный на крупном рыбоперерабатывающем предприятии метод фаг-опосредованного биопроцессинга позволит увеличить на 5 суток срок годности данной категории полуфабрикатов и снизит риск развития спорадических случаев и вспышек инфекций, передающихся пищевым путем.
Методология и методы исследования
Методология диссертационной работы спланирована в соответствии со структурой и задачами исследования. Предметом исследования стала разработка технологического вспомогательного средства деконтаминации охлажденной рыбы на основе коктейля бактериофагов. Объектами исследования выступали штаммы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также бактериофаги, изолированные нами из объектов окружающей среды. Научная литература, посвященная исследованиям бактериофагов, была проанализирована формальнологическими методами . В работе использованы микробиологическ ие, иммунохимические, молекулярно-генетические, масс -спектрометрические, электронно-микроскопические и статистические методы исследования.
Образцы охлажденной рыбы
Образцы охлажденной рыбы (сибас, радужная форель) были приобретены в торговых сетях города Москвы. Для лабораторных экспериментов по фаг -опосредованной деконтаминации использовали искусственно и естественно контаминированные куски рыбы (мышечные волокна с чешуей) массой от 1 до 10 г и площадью обрабатываемой поверхности не более 55 см. В процессе моделирования микробиологического загрязнения штаммами-мишенями, образцы предварительно подвергали деконтаминации в 70C спирте, а затем отмывали от последнего 0,9% раствором натрия хлорида.
Для фаг-опосредованного биопроцессинг а на р ыбоперерабатывающем предприятии использовали 48 тушек потрошённой на конвейере радужной форели массой 600-700 г.
Штаммы микроорганизмов
В работе были использованы культуры A. hydrophila, P. fluorescens, C. freundii, L. monocytogenes, R. ornithinolytica и P. putida в количестве 197 штаммов, выделенных с поверхности рыб, приобретенных в сетях гг. Москвы, Ульяновска, Астрахани, а также тушек конвейерно потрошенной рыбы и элементов технологического оборудования одного из рыбоперерабатывающих заводов Республики Карелия.
В ходе работы, из образцов сточных вод Московской области и других объектов окружающей среды , были выделены 15 бактериофагов-кандидатов, активных в отношении бактерий-мишеней, представленных выше.
Лабораторные животные
В экспериментах in vivo в качестве модельных животных использовали белых аутбредных (беспородных) мышей (самцы/самки, 18-21 г). Все закупленные животные прошли карантин в виварии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора в соответствии с СП № 2.2.1. 3218-14.
Бактериологические методы
Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили по общепринятым методикам (Хоулт Дж ., Криг Н., Снит П., 1997; Приложение №1 к приказу Министерства здравоохранения СССР от 22 апреля 1985 г . №535). Родовую принадлежность культур устанавливали на средах Эндо (ФГУП «НПО Микроген»), желточно-солевом, кровяном и хромогенном агаре уриселект 4 (Bio-Rad, США). Бактерии Listeria monocytogenes выявляли по ГОСТ 32031-2012 с использованием бульона Фразера (Himedia, India) с последующим пересевом на Chromocult Listeria Selective Agar Base acc. OTTAVIANI and AGOSTI (Merck KGaA, Germany) из последовательных разведений образцов (1:10).
Масс-спектрометрический метод
Подтверждение родовой и видовой принадлежности штаммов микроорганизмов проводили масс-спектрометрическим методом на приборе VITEK MS («bioMerieux», Франция) согласно инструкции производителя оборудования.
Испытания на животных
При разработке процедур оценки безопасности отдельных производственно-перспективных штаммов фагов и коктейля фаголизатов на лабораторных животных использовали методы оценки токсичности из «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р .У., 2005) и «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Иммунобиологические лекарственные средства) (Миронов А.Н., 2013).
Методы изолирования и изучения биологических свойств бактериофагов
Выделение бактериофагов и изучение их биологических свойств проводили методами, предложенными М. Adams (1959) и Д.М. Гольдфарбом (1961). Для определения титра фаговых частиц и морфологии негативных колоний использовали метод Грациа (1936) и метод Аппельмана (1961).
Метод аффинной хроматографии использовали для удаления эндотоксинов в полученных фаголизатах. Очистку проводили на хроматографической колонке Endo Trap HD (Hyglos GmbH, Германия) с использованием буферных растворов фирмы производителя.
Электронно-микроскопическое исследование бактериофагов,
контрастированных уранилацетатом, проводили на микроскопе JEM-100СХ (JEOL, Япония) при конечном увеличении 80000х.
б
Молекулярно-генетические методы
Фаголизаты, содержащие исследуемые бактериофаги в титре не ниже 109 БОЕ/мл, пропускали через стерильную фильтрующую шприцевую насадку Millex-GP с диаметром пор 0,22 мкм (Merck Millipore, США), после чего обрабатывали ферментом DNase I (NEB, США). Выделение ДНК бактериофагов проводили при помощи набора К -Сорб (ООО «НПФ Синтол», Россия) согласно протоколу производителя.
Подготовка к секвенированию и непосредственно секвенирование.
Определение полных нуклеотидных последовательностей проводили при помощи полупроводникового секвенирования второго поколения на платформе Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, США).
Для секвенирования ДНК, выделенной из каждого фаголизата, готовили бар-кодированные библиотеки случайных фрагментов. Выделенную ДНК предварительно фрагментировали ул ьтразвуком при помощи прибора Bioruptor UCD-200 (Diagenode, Бельгия). Библиотеки случайных фрагментов для последующего секвенирования готовили при помощи набора реагентов NEBNext (NEB, США) согласно протоколу производителя с использованием стандартных баркодов Ion XpressTM Barcode Adaptors Kit (Thermo Fisher Scientific, США).
Все работы по получению ДНК бактериофагов и приготовлению бар-кодированных библиотек случайных фрагментов проводили с использованием методических подходов , исключающих перекрестную контаминацию образцов . Оценку распределения длин фрагментов библиотек и их концентрацию проводили с использованием прибора Bioanalyzer 2100 и набора реагентов Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, США) согласно протоколу производителя.
Клональную амплификацию библиотек , которые были предварительно эквимолярно пулированы, проводили с использованием набора Ion PI Template OT2 200 Kit v3 (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя.
Непосредственно секвенирование проводили при помощи набора реагентов Ion PI Sequencing 200 Kit v3 на чипе Ion PI Chip Kit v2 секвенатора Ion Proton (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя.
Биоинформатический анализ секвенированных геномов проведен с
использованием пакета программного обеспечения NEWBLER (Roche Diagnostics),
UGENE (Унипро, Россия), BLAST Ring Image Generator (BRIG), PHACTS (San Diego
State University, США) и интернет-ресурса BLAST
().
Оценка параметров микробиологической безопасности охлажденной рыбы
КМАФАнМ определяли согласно ГОСТ 10444.15-94. Результаты подсчета количества колоний пересчитывали на 1 г или см2 продукта по ГОСТ 26670-91.
Статистические методы обработки данных
Статистическую обработку результатов (вычисление средних арифметических значений и стандартного отклонения) проводили с использованием статистических ресурсов программы Microsoft Excel 2016.
Личное участие автора в получении результатов
Автором составлен план исследования , проведен аналитический обзор литературы, определены ведущие патогены , вызывающие порчу охлажденной рыбы, изолированы из объектов окружающей среды бактериофаги -кандидаты, литически активные в отношении идентифицированного спектра бактерий, выполнен весь объем микробиологических исследований бактериофагов и
бактериальных штаммов-мишеней, отработана технология получения готового технологического вспомогательного средства , проведены его доклинические испытания, а также оценка эффективности в лабораторных и производственных условиях на базе полномасштабного рыбоперерабатывающего предприятия.
Полногеномное секвенирование и анализ сиквенса проведен совместно с младшим научным сотрудником лаборатории прикладной иммунохимии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора Е.О. Рубальским. Электронная микроскопия проводилась на базе Института микробиологии РАН им . С . Н. Виноградского, при участии старшего научного сотрудника к.б.н. Е .Е. Куликова. Метод MALDI-TOF проводился на базе ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России совместно с профессором кафедры микробиологии и вирусологии д.м.н., профессором Ефимовым Б .А. и руководителем лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекции ФБУН МНИИЭМ им Г .Н. Габричевского Роспотребнадзора д.м.н., доцентом Борисовой О.Ю.
Положения выносимые на защиту:
-
Разработанный коктейль оригинальных вирулентных производственно-перспективных бактериофагов (Aeromonas hydrophila Ah 1, Pseudomonas fluorescens Pf 1, Citrobacter freundii Cf 1, Listeria monocytogenes Lm 1, Raoultella ornithinolytica Ro 1, Pseudomonas putida Psp6) безопасен в качестве действующего вещества технологического вспомогательного средства.
-
Технологическое вспомогательное средство на основе кок тейля бактериофагов эффективно деконтаминирует охлажденную рыбу, пролонгируя срок годности данной категории полуфабрикатов и снижая риск возникновения инфекций, передающихся пищевым путем.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
О достоверности полученных результатов работы свидетельствует
достаточный объем выборки анализируемых образцов (300 образцов почв, сточных
вод, рыбных полуфабрикатов , экскрементов крупного рогатого скота , 224
патогенных и условно-патогенных штамма и изолята бактерий, 15 штаммов-
кандидатов бактериофагов), использование сертифицированных
бактериологических, биохимических и молекулярно -генетических методов и
процедур доклинических испытаний, характеризующихся высокой специфичностью
и чувствительностью. Комплексное бактериологическое, биохимическое и
молекулярно-генетическое исследование бактериальных штаммов-мишеней и
бактериофагов, а также доклинические испытания и оценка эффективности
технологического вспомогательного средст ва позволило получить данные ,
сопоставимые с данными научной литературы, что также свидетельствует о
достоверности полученных результатов.
Диссертация апробирована 01.12.2016 г. на расширенном межкафедральном заседании Федерального г осударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол от 01.12.2016 г).
Материалы и результаты исследований представлены и обсуждены на Российских и международных конференциях и конгрессах: II научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой
промышленности» (Санкт-Петербург, 2014 г.); V международная конференция ФизтехБИО (Долгопрудный, 2015 г.); XI научно-практическая конференция «Биомедицина и биомоделирование» (Светлые горы - Московская область, 2015 г.); Международная научно-практическая конференция «Перспективы сотрудничества государств-членов Шанхайской организации сотрудничества в противодействии угрозе инфкционных болзней» (Москва, 2015 .); Международная нучно-практическая конференция «Общие угрозы-совместные действия. Ответ государств БРИКС на вызовы опасных инфекционных болезней» (Москва, 2015 г.); VIII Ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 2016 г.); III научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Москва, 2016 г.); VIII Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора (Москва, 2016 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, 9 - в сборниках материалов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 152 страницах и состоит из следующих рзделов: введения, обор литературы, результатов собственных исследований и их обсуждений, заключения, выводов, списка использованных литературных источников, приложений. Диссертация иллюстрирована 35 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 188 работ, в том числе 31 - отечественных и 157 - зарубежных публикаций.
Бактерии, вызывающие инфекции, передаваемые пищевым путем, и порчу продукции
Порчу продуктов можно рассматривать как любое изменение (окисление липидов, активность собственных ферментов, жизнедеятельность микроорганизмов), которое делает продукт нежелательным для потребления [42, 114].
К порче рыбы приводят три основных механизма: ферментативный автолиз, перекисное окисление липидов, микробный рост. Вскоре после вылова начинают происходить биохимические изменения в тканях гидробионтов [88]. Автолиз происходит под действием ферментов и заключается в распаде основных структурных молекул рыбы. Наблюдается разрушение форменных элементов крови, что приводит к покраснению тканей гидробионтов. Автолитические ферменты снижают качество структуры продукта, но не производят характерные для порчи гнилостные запахи и посторонние привкусы. При автолизе создаются благоприятные условия для развития микроорганизмов, которые, постепенно проникая в мышцы и развиваясь там, вызывают порчу рыбы. Перекисное о кисление липидов является основной причиной ухудшения качества и порчи пелагических видов рыб с высоким содержанием жира. Окисление липидов включает три этапа образования свободных радикалов: кислородная инициация, развитие цепи, обрыв. Инициация заключается в образовании свободных радикалов под воздействием тепла, света и ионов металлов . В процессе развития цепи перекисные радикалы вступают в реакцию с другими молекулами липидов и образуют гидроперекиси и новые свободные радикалы [92, 110]. Обрыв происходит, когда накопленные свободные радикалы начинают взаимодействовать между собой. Окисление обычно включает в себя воздействие кислорода на жирные кислоты с двойными связями. Поэтому рыбные липиды, которые состоят из полиненасыщенных жирных кислот, наиболее предрасположены к окислению. У рыб может проходить ферментативное либо неферментативное окисление липидов. Ферментативный гидролиз жиров липазами называется липолизом, во время данного процесса липазы расщепляют глицериды, образуя свободные жирные кислоты [87, 114]. Микроорганизмы могут разлагать белки, но лучшим субстратом для них являются образующиеся при автолизе продукты расщепления белков – аминокислоты, а также входящие в состав мышц небелковые азотистые вещества. Конечными продуктами бактериального разложения рыбы являются аммиак, амины, биогенные амины, путресцин, гистамин, кадаверин, сероводород, индол, скатол, органические кислоты, сульфиды, спирты, альдегиды, кетоны и другие вещества, придающие рыбе неприятный запах и неприемлемый вкус [83, 102, 103].
Все химические реакции зависят от температуры, чем она ниже, тем медленнее происходят процессы порчи. Тщательный контроль температуры имеет решающее значение не только с точки зрения потери качества, но и для гарантии безопасности потребителей [89].
Микробиологическая порча охлажденной рыбы происходит за счет активного роста микроорганизмов на поверхности охлажденных полуфабрикатов и выработки продуктов своей жизнедеятельности, также влияющих на органолептические свойства и пищевую ценность гидробионтов, что не соответствует нормам ТР ТС 021/2011 [28] по микробиологической чистоте.
В условиях роста мирового населения увеличивается спрос на продукты питания. В целях удовлетворения этого спроса происходит повышение интенсивности и объемов промышленного производства в секторах растениеводства и животноводства, что создает как новые возможности, так и новые угрозы в том, что касается безопасности продуктов питания. В свете этих событий на производителей продуктов питания и работников пищевой промышленности ложится дополнительная ответственность по обеспечению безопасности продуктов питания. В условиях, при которых потоки продукции перемещаются с большой скоростью и на большие расстояния, местные инциденты могут быстро разрастаться до международных чрезвычайных ситуаций. За последнее десятилетие на каждом континенте были отмечены серьезные вспышки заболеваний пищевого происхождения, масштабы которых нередко усугублялись особенностями глобализированной торговли. В качестве примера можно назвать вспышку энтерогеморрагической инфекции, вызванной Escherichia coli, в Германии в 2011 г., которая была связана с употреблением в пищу проростков пажитника. Случаи заражения были зарегистрированы в 8 странах Европы и Северной Америки, умерли 53 пациента [15].
Потребление морепродуктов значительно увеличилось за последние годы из-за осведомленности потребителей о высокой питательной ценности и большого количества в них важных витаминов и минералов [98]. В связи с этим глобальное распространение патогенных микроорганизмов через морепродукты представляет особую опасность [140]. Микроорганизмы являются возбудителями пищевых инфекций, наиболее опасной из которых, с прогностической точки зрения, является листериоз. Листериоз - инфекционная болезнь людей и животных с полиморфизмом клинических проявлений и высокой летальностью. Основной путь заражения человека - пищевой, при употреблении не прошедших термической обработки продуктов питания. Особую опасность листериоз приобрел в конце XX в., что обусловлено контаминацией пищевых продуктов листериями и способностью расти на поверхности продуктов при низких температурах. В связи с этим листериоз олучил наименование «пищевой инфекции» - «пищевой листериоз», и врачами нашей страны с 1992 г. эта инфекция была признана как эпидемически значимая. Особое значение имеет способность листерий к вертикальной передаче от беременной женщины плоду трансплацентарно или интранатально [6, 31]. У людей, не страдающих иммунодепрессивными состояниями, L. monocytogenes может вызвать гастроэнтерит, который, как правило, протекает в легкой форме. У пациентов с нарушенным клеточным иммунитетом листериоз может приводить к серьезным осложнениям, в том числе сепсису, менингиту, энцефалиту, заканчивающимся нередко летальным исходом [77, 79, 132].
Подтверждение отсутствия умеренных бактериофагов в потенциальных бактериях-хозяевах
Отобранные бактерии предварительно, до выделения к ним бактериофагов из объектов окружающей среды, были проверены в тесте по индукции профага с помощью митомицина С и УФО.
В результате проведенных исследований перечисленные штаммы бактерий в таблице 4 были закреплены в качестве клеток-хозяев и использовались в дальнейшем для выделения бактериофагов и получения фаголизатов с высоким титром фаговых частиц. Позднее они были задепонированы вместе с бактериофагами в “ГКПМ-Оболенск”. Таблица 4 – Проверка потенциальных бактерий-хозяев Штамм Митомицин С УФО Aeromonas hydrophila B-7964 - Pseudomonas fluorescens B-7967 - Pseudomonas putida B- 7965 - Citrobacter freundii B-7966 - Raoultella ornithinolytica B-7963 - Listeria monocytogenes B-6643 - «-» - отсутствие профага; «+» - наличие профага
Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным М. Адамсом (1959) и Д.М. Гольдфарбом (1961), определения титра фаговых частиц и морфологии негативных колоний - по методу Грациа (1936), с учетом температурных режимов оптимальных для культивирования отобранных бактерий-хозяев.
Для выделения бактериофагов из сточных вод Московской области исследуемые образцы объемом 15 мл засевали в колбу с МПБ в объеме 50 мл, внося при этом по 0,2 мл (полная петля) суточной бактериальной культуры. Посевы P. putida, P. fluorescens, A. hydrophila, R. ornithinolytica, L. monocytogenes инкубировали при температуре 28 С, C. freundii – при 37 С в течение 24 ч . После инкубирования из колбы брали 10 мл жидкости и помещали в стерильную пробирку. Затем, с целью освобождения от посторонней микрофлоры, материал центрифугировали в течение 30 мин при 5000 об /мин, надосадочную жидкость отбирали и фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
Полученный фильтрат исследовали методом агаровых слоев на присутствие бактериофагов. Для этого 1,5% МПА разливали в чашки Петри в количестве 25–30 мл (первый слой). После застывания среды чашки ставили на 1,5–2 ч для подсыхания в термостат при температуре 37 С. В пробирку с 2,5 мл 0,7% расплавленного и остуженного до температуры 45 С МПА вносили 1 мл исследуемого фильтрата и 0,2 мл суточной бульонной культуры соответствующего индикаторного бактериального штамма. Содержимое пробирок быстро перемешивали, чтобы не произошло застывания агара, и выливали в ту же чашку вторым слоем. После того, как агар принимал плотную консистенцию, посевы P. putida, P. fluorescens, A. hydrophila, R. ornithinolytica, L. monocytogenes ставили в термостат при 28 С, C. freundii – при 37 С.
Присутствие бактериофага определяли по наличию прозрачных пятен (бляшек, негативных колоний), хорошо видимых на матовом фоне роста бактерий.
В случае положительного результата негативные колонии или участок лизиса пересевали с помощью бактериологической петли в МПБ с соответствующей индикаторной культурой. Для этого в две пробирки с 4,5 мл МПБ добавляли стерильной пипеткой по 0,2 мл суточной бульонной индикаторной культуры, в одну из которых пересевали негативную колонию соответствующего бактериофага, вторая пробирка служила контролем. Посевы P. putida, P. fluorescens, A. hydrophila, R. ornithinolytica, L. monocytogenes инкубировали при 28 С, C. freundii – при 37 С 10–12 ч . Определяющим моментом являлось просветление бульона в опытной пробирке и выраженное помутнение среды в контроле. После чего содержимое опытной пробирки с целью освобождения от бактериального дебриса центрифугировали в течение 30 мин при 5000 об /мин, надосадочную жидкость отбирали и фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
В результате проведенных исследований было выделено 15 штаммов бактериофагов, из которых отобрали 6 производственно-перспективных (таблица 5), активных в отношении бактериальных штаммов Pseudomonas putida B-7965, Pseudomonas fluorescens B-7967, Aeromonas hydrophila B-7964, Raoultella ornithinolytica B-7963, Listeria monocytogenes B-6643, Citrobacter freundii B-7966. Штамм фага Индикаторный бактериальный штамм Источник выделения Psp6 Pseudomonas putida B-7965 р. Волга, Ленинский район города Ульяновска Pf 1 Pseudomonas fluorescens B-7967 Сточные воды, Московская область Ah1 Aeromonas hydrophila B-7964 Сточные воды, Московская область Lm1 Listeria monocytogenes B-6643 Экскременты овец, Астраханская область Cf1 Citrobacter jreundii B-7966 Сточные воды, Московская область Ro1 Raoultella ornithinolytica B-7963 Сточные воды, Московская область На данном этапе были изолированы штаммы-кандидаты бактериофагов, активные в отношении бактерий-мишеней, которые, по нашим данным, являлись исходно прижизненной микрофлорой гидробионтов, а после ее вылова способствовали скорой порче охлажденной продукции, продолжая персистировать на поверхности потрошеных тушек сибаса и радужной форели, приобретенных в торговых сетях городов Москвы, Ульяновска, Астрахани и полученных с рыбоперерабатывающего предприятия в Республике Карелия.
Подбор оптимальных значений температуры для культивирования бактериофагов
Согласно разработанной рецептуре, в процессе получения 10 экспериментально-производственных партий ТВС была отработана пилотная технология производства технологического вспомогательного средства. Разработанная технология представляет собой следующую цепочку этапов: 1-й этап. Подготовка стартерных культур пары бактериофаг - штамм-хозяин. Штаммы бактерий, используемые для наработки бактериофагов, лиофилизируют, используя сублимационную сушку CoolSafe110 FreezeDryer. Штаммы бактерий в соотношении 1:1 смешивают с защитной средой (сахароза 20%, желатин 1%), разливают во флаконы по 2 мл и высушивают в течение 12 ч при давлении 0,03 гПа и при постепенном повышении температуры от -50 до +20 С. Фенотипически и молекулярно-генетически охарактеризованные штаммы бактериофагов лиофилизируют по схеме, соответствующей изложенной выше в отношении штаммов бактерий, используя следующую защитную среду: сахароза 20%, желатин 8%. 2-й этап. Подготовка помещения и оборудования. Перед началом дезинфекции проверяют эффективность вентиляционного оборудования и HEPA фильтров. Боксированное помещение и ламинар обрабатывают при помощи аламинола. Дезинфекцию оборудования, предназначенного для розлива и укупорки флаконов с ТВС, а также поддонов для флаконов и емкости для крышек, проводят 70% раствором спирта. 3-й этап. Приготовление материалов. Перед стерилизацией осуществляют мойку стеклянной посуды. Стерилизацию лабораторной посуды осуществляют по следующему режиму: сухожаровой шкаф – 1 ч при 200 С. Стерилизацию емкостей большого объема и частей перистальтического насоса (силиконовый шланг) проводят в автоклаве под давлением пара 1,2 атмосферы и рабочей температуре 121 С, время стерилизации – 20 мин. Сухая стерилизация гамма-лучами пластиковых флаконов и крышек производится по контракту по следующей схеме: 18,5 кГр при скорости конвейера 3,0 см/сек. 4-й этап. Питательные среды. Разливают в литровые матрасы и стерилизуют при следующих режимах: под давлением 1,2 атмосферы и рабочей температуре 121 С. Приготовление и стерилизация питательных сред (МПА, МПБ, Сабуро). Состав сред приведен в Материалах и методах. 5-й этап. Подготовка фаголизатов бактериофагов. Фаголизаты бактериофагов получали способом, запатентованным в РФ (патент №2525141) – с учетом модификации, приведенной в разделе диссертации 2.4.3. 4,5 мл 18-часовой бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 109 КОЕ/мл засевают в матрац для культивирования – скошенная плотная питательная среда толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3–3,5 ч при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 106–107 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования. Культивируют в течение 4–5 ч при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0–7,2 в количестве 9–10 мл, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ в количестве 1:10, выдерживают в течение 30 мин при непрерывном шуттелировании, ц ентрифугируют в течение 30 мин при 5000 об./мин, отбирают надосадочную жидкость в стерильные пробирки и проверяют титр по Грациа. Полученные раздельно б актериофаги в титре не менее 1011 БОЕ/мл смешивают в стерильной емкости, в равных объемах. 6-й этап. Стерилизация фаголизата. Полученный коктейль фаголизатов фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм. 100 7-й этап. Освобождение от эндотоксина. Стерильный коктейль фильтратов фаголизатов очищают методом аффинной хроматографии от эндотоксинов на колонке EndoTrapHD (Hyglos, Germany) согласно инструкции производителя. 8-й этап. Сведение компонентов технологического вспомогательного средства. Коктейль стерильных фильтратов фаголизатов с учетом конечного титра бактериофагов доводят до объема 100 мл, с помощью уравновешенного буфера (Hyglos) в стерильном флаконе. 9-й этап. Розлив. Асептический розлив и укупорка во флаконы по 100 мл с крышкой, содержащей контроль первого вскрытия. 10-й этап. Маркировка. Маркировка в соответствии с [29] включает следующие сведения о продукте: наименование, указание «не для розничной продажи», наименование и местонахождение изготовителя, объем, дату изготовления дату упаковывания, срок годности и условия хранения, номер партии. Критические контрольные точки на этапах создания технологического вспомогательного средства:
Контроль микробиологической чистоты флаконов и крышек для розлива. 5 флаконов из партии отбирают в боксе из двойного пакета. Заливают 10 мл стерильного МПБ (можно использовать LB-бульон, тиогликолевую среду). Флаконы закрывают, тщательно встряхивают, ставят в термостат при 37 С и 25 С на 48 ч. Затем, из каждого флакона, делают высев 0,1 мл на чашки с плотными питательными средами (кровяной агар, Сабуро) методом spot-теста. Инкубируют при 37 С 1 сутки на кровяном агаре и при 25 С - 3 суток на среде Сабуро. После инкубации контролируют наличие или отсутствие роста на чашках. Стерильным пинцетом выбирают 5 крышек из партии, замачивают в емкости с 250 мл стерильной жидкой питательной среды (МПБ, LB-бульон, тиогликолевая среда). Емкость закрывают, ставят в термостат при 37 С и 25 С на 48 ч , после чего повторяют методику высева и учета результатов в соответствие с процедурой, приведенной для флаконов.
Отработка метода промышленного фаг-опосредованного биопроцессинга на базе форелеводческого хозяйства
Далее бактериофаги, отобранные на основании их биологических свойств, подвергались молекулярно-генетическому и биоинформатическому анализу для исключения из состава будущего фагосодержащего технологического вспомогательного средства умеренных и содержащих в своем ДНК нежелательные гены фагов. Для получения полногеномных последовательностей ДНК бактериофагов использовали высокопроизводительное секвенирование второго поколения Ion Torrent Sequencing. Данные каждого раунда секвенирования были проанализированы методами биоинформатического анализа. Собранные полногеномные последовательности сравнивали с известными ДНК бактериофагов, депонированных в базе данных GenBank NCBI, а потенциальные продукты генов анализировались при помощи программного обеспечения PHACTS, позволяющего предсказать тип жизненного цикла бактериофага (умеренный или вирулентный). Молекулярно-генетическая характеристика подтвердила вирулентность и оригинальность выделенных бактериофагов Psp 6, Pf 1, Ah 1, Lm 1, Cf 1, Ro 1, гомология ДНК которых с близкородственными фагами составила от 0 до 95 %.
Таким образом, в качестве действующих веществ в готовую форму технологического вспомогательного средства объемом 100 мл были включены фаголизаты 6 перечисленных выше бактериофагов в титре не ниже 1011 БОЕ/мл каждого, вспомогательным компонентом продукта выбран уравновешивающий буфер следующего состава – 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 7,5, обеспечивающий как техническую возможность очистки коктейля бактериофагов от бактериальных токсинов методом аффинной хроматографии на колонке EndoTrap HD (Hyglos, Germany), так и стабильность титра фаговых частиц при хранении в течение 6 мес при температуре от 2 до 8 С. Физико химические показатели, включая содержание токсичных элементов и тяжелых металлов, разработанной рецептуры технологического вспомогательного средства полностью соответствовали нормативным параметрам ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств ». Контрольные мероприятия, обеспечивающие качество фагосодержащего продукта, легли в основу Технических условий 9197-0001-1966727-2017. Качество готовой формы технологического вспомогательного средства обеспечивалось разработанной пилотной технологией его получения, включавшей несколько стадий: от подготовки исходного сырья и материалов через наработку лиофилизированного посевного материала стартерных культур пары фаг-хозяин, получения отдельных фаголизатов, их сведения в коктейль и последующей стерилизующей фильтрации и очистки полуфабриката от токсинов до фасовки готовой формы во флаконы и укупорки в промаркированную потребительскую тару. Контрольные мероприятия, в том числе оценка микробиологической чистоты и специфической активности фагосодержащего продукта, осуществлялись на каждой из основных технологических стадий. Необходимо отметить отработку модифицированного способа получения высокоактивного фаголизата на плотной питательной среде, существенно сокращающего длительность этого технологического этапа относительно описанного в патенте на изобретение РФ №2525141, на 14 ч.
При проверке стабильности основного показателя качества разработанного технологического вспомогательного средства – его специфической антибактериальной активности, при температуре хранения от 2 до 8 С в течение 6 мес титр фаговых частиц по Грациа на штаммах-хозяевах падал не более чем на 1%, что позволило закрепить нам этот показатель в ТУ.
На основании многократно воспроизведенного технологического процесса была подготовлена и утверждена Технологическая инструкция, являющаяся, наряду с ТУ, рецептурой и проектом этикеточной надписи, неотъемлемой частью нормативно-технической документации.
На следующем этапе диссертационного исследования нами была проведена оценка безопасности технологического вспомогательного средства в опытах по изучению острой и хронической (подострой) токсичности на лабораторных животных. В результате проведенных экспериментов было показано, что при однократном введении максимальной дозы исследуемого фагосодержащего продукта признаков интоксикации у мышей не наблюдалось. Поведенческие реакции, внешний вид и привес мышей в экспериментальной и контрольной группах при длительном пероральном приеме технологического вспомогательного средства также не отличались. Для исключения вероятности возникновения побочных эффектов по влиянию бактериофагов на нормальную микрофлору кишечника in vivo (на модели беспородных белых мышей) дополнительно определяли изменение количества основных представителей микробиоценоза толстого кишечника на фоне 10-дневного внутрижелудочного введения фагового коктейля. Разработанная рецептура не влияет на нормальную микрофлору кишечника мышей.
Эффективность разработанного состава исходно оценивали по уровню его бактерицидного действия в модельных экспериментах на искусственно обсемененных микроорганизмами фрагментах охлажденной рыбы. Образцы, стерилизованные 70% спиртом, контаминировали суспензиями, содержащими штаммы L. monocytogenes, C. freundii, R. ornithinolytica, P. fluorescens, P. putida, A. hydrophila в различных сочетаниях (использовали как моно-, так и микст-контаминацию) в титре от 106 до 109 КОЕ/мл, а затем обрабатывали бактериофагом (или гомологичным заражающим культурам коктейлем бактериофагов) с титром от 109 до 1011 БОЕ/мл и проводили постоянный микробиологический мониторинг загрязненных поверхностей. Элиминация 99% микроорганизмов с поверхности образцов подтверждалась при условии множественности инфицирования фаг–бактерия-хозяин не менее 100:1 (100 фаговых частиц на 1 бактерию или, например, L. monocytogenes 106 КОЕ/мл – бактериофаг Lm 1 109 БОЕ/мл) и времени деконтаминации не менее 2 ч, при этом температурный режим мог варьировать от 2 до 25 С.
При переходе от лабораторных к промышленным методам фаг-опосредованной деконтаминации необходимо было определиться со способом нанесения фага на загрязненную микроорганизмами поверхность охлажденной рыбы. Нами рассматривались два варианта обработки тушек гидробионтов : полное погружение и аэрозольное нанесение. Сравнительный эксперимент продемонстрировал более высокий процент элиминации посторонней флоры с поверхности образцов при полном погружении последних, минимум на один порядок.