Введение к работе
В проведенных в последние годы исследованиях, посвященных изучению микрофлоры кишечного тракта, большое внимание уделяется анаэробной 'рамположительной флоре, в том числе бифидобактериям, которые являются іреобладавдими микроорганизмами микрофлоры кишечника. В настоящее вре-ія доказана их защитная роль, антагонистическая, витаминообразующая и ферментативная функции (Gibson G., et.al.,1995).
Одним из патогенетических факторов, определяющих длительные ки-1ечные дисфункции является отсутствие или резкое снижение количества іифидобактерий в кишечнике детей и взрослых, что может служить критерієм при оценке степени и глубины дисбактериоза (Беюл Е.Ф.,1989). Поэтому в общепринятой методике исследований на дисбактериоз, количест-іенная оценка содержания бифидобактерий является обязательной.
Эффективность диагностики, профилактики и лечения дисбактериозов, і также научных исследований по этой проблеме в первую очередь опреде-шется качеством питательных сред для выделения и количественной ха-)актеристики бифидобактерий, наработкой биомассы производственных ітаммов бифидобактерий и контролем их жизнеспособности в готовых пре-іаратах (Ворошилина Н.Н. ,1975).
Известны среды, предложенные зарубежными авторами - среда для вы-іеления и учета бифидобактерий ( ВШ-25 - Munoa,Pares, 1988), среда [ля выращивания бифидобактерий ( TPY - Sgorbat, Scardov, 1982) и ряд іругих. Однако эти среды являются многокомпонентными, в их состав вхо-;ят дорогостоящие реактивы и основы (цистин, твин, фитон, триптиказа и IP.).
В нашей стране лучшей питательной средой для выделения бифидобактерий считается среда Блаурокка в модификации Г.И.Гончаровой (Гончаро-ia Г.И.,1987). Однако в связи с отсутствием возможности получать эту :реду, изготовленную промышленным способом, многие бактериологические іаборатории вынуждены готовить ее сами, используя нестандартную печень :ельскохозяйственных животных, подвергавшихся интенсивной и длительной >етеринарной обработке кормовыми антибиотиками. Это приводит к ухудшению качества питательных сред.
Исходя из литературных данных, теоретически обоснована и практи-іески подтверждена необходимость восстановления высокого уровня бифи-[офлоры в кишечнике больных (при дисбактериозах различной этиологии) v щоровых людей . Для этого рационально создание и применение бактери-шьных препаратов, содержащих бифидобактерий, так как именно эти пре-іаратьі способствуют восстановлению бифидофлоры и нормализации аутофло-
ры в целом, что обеспечивает эффективность терапии при различных фор мах патологических состояний кишечника (Гончарова Г.И. и соавт., 1987 Дорофейчук В.Г. и соавт., 1991, Saavedra J.,et.al., 1994).
Одним из самых эффективных средств коррекции дисбактериозов явля ется препарат ОифидумОактерин (Грачева Н.М. и соавт.,1986).
В настоящее время сферы его применения значительно расширены (комплексная терапия кишечных инфекций, гнойно-септические заболевания пневмонии, гепатиты и другие патологические состояния, осложненнь дисбактериозом) ( Коршунов В.М.,и соавт. 1986, Bertassoni М. et.al.,1994).
Это определяет необходимость поиска методов, повышающих эффектш ность наработки биомассы бифидобактерий и степень жизнеспособное! микробной популяции. Поэтому актуально изыскание оптимальных услові культивирования бифидобактерий, обеспечивающих получение максималы эффективного и стабильного препарата (Зацепин Ю.К.,1986 , Hages D. et.al., 1991)
До настоящего времени в производстве лечебных препаратов с бифі добактериями применяется метод периодического культивирования, которг имеет ряд недостатков. К этим недостаткам относятся большое количеств нежизнеспособных и покоящихся особей , постоянное и интенсивное накаї ливание продуктов жизнедеятельности, ингибирующих рост ( в частност] продуктов , вызывающих сильное закисление культуры). С другой стороні при периодическом культивировании популяция находится в состоянии, о: тимальном по количеству живых клеток, только в начале малого промежу! ка времени фазы экспоненциального роста. Получаемый таким образом пр парат представляет собой физиологически неоднородную популяцию бакт рий. Это отражается на жизнеспособности и выживаемости микробов, вв денных в кишечный тракт человека, что снижает терапевтическую ценное препарата. Более перспективным методом получения биомассы с заран заданными свойствами является процесс управляемого непрерывного кул тивирования, который позволяет получать биомассу со стабильными биол гическими свойствами ( Баснакьян И.А., 1992). Сведений о подобных пр цессах культивирования бифидобактерий в доступной нам литературе мы встречали .
Кроме того, в нашей стране до настоящего времени, не существу стандартной питательной среды для накопления биомассы бифидобактерий
Целью настоящей работы является разработка процесса непрерывного культивирования бифидобактерий и питательных сред для выделе-
і и наработки их биомассы. Задачи исследования:
-
Разработать сухую питательную основу, пригодную для конструирования питательных сред для культивирования бифидобактерий;
-
Разработать составы чувствительных питательных сред для выделения и культивирования бифидобактерий;
-
Изучить морфологические, культуральные, биохимические и физиологические свойства бифидобактерий при их выращивании в разработанных средах;
-
Изучить кинетику роста бифидобактерий в средах различного состава.
-
Сконструировать питательную среду для накопления биомассы бифидобактерий с оптимальным содержанием сухих питательных основ серии "Бактофок".
-
Изучить возможность применения сконструированной среды в процессах периодического и непрерывного культивирования бифидобактерий в колбах и в биореакторах.
-
Разработать процесс непрерывного культивирования бифидобактерий, наработать их биомассу и изучить ее свойства.
Научная новизна настоящей работы состоит в следующем:
1.Впервые разработаны стандартные сухие питательные основы, полу-энные из непищевого сырья (мясо-костного и печеночного фарша тюленя), ригодные для конструирования питательных сред для выделения и накоп-эния биомассы бифидобактерий.
2.Разработан процесс непрервного культивирования бифидобактерий, оказана целесообразность его применения при производстве биомассы, по войствам не уступающей или превосходящей биомассу коммерческого бифи-умбактерина.
3.Получены новые знания о физиологических и культуральных свойс-вах бифидобактерий при их выращивании в средах различного состава и в роцессе непрерывного культивирования в биореакторе.
Практическое значение работы определяется большой потребностью іедицинских учреждений в питательных средах для диагностики дисбакте-жозов, в том числе и в питательной среде для выделения бифидобакте-
)ИЙ.
В результате проведенных исследований разработана рецептура высо-
кочувствительной среды, обеспечивающей повышение точности микробиоло гических анализов на дисбактериоз ; отработана методика непрерывног управляемого культивирования бифидобактерии с использованием новой пи тательнои среды, что может позволить повысить выход и жизнеспособност биомассы при производстве бифидосодержавдх препаратов.
Положения, выносимые на защиту. 1.Новая питательная среда для вы деления бифидобактерии; 2. Новая питательная среда для культивировали бифидобактерии; 3.Процесс управляемого непрерывного культивировали бифидобактерии в разработанной среде.
Апробация работы. Диссертация апробирована на научной конференщ отдела микробиологии условно-патогенных бактерий НМВС им. И.И.Мечни кова РАМН 20 мая 1997 г, отдельные фрагменты работы доложены на конфе ренции молодых ученых НИИВС им.И.И.Мечникова (1995 г) и 5 Всероссийс кой конференции "Научные основы технологии промышленного производсті ветеринарных биологических препаратов" (1996 г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, получено авторское свидетельство N1705341 (список приводится в конце авторефе рата).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глг обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, вь водов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложе} на стр. \% машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 27 тг лицами.
В работе использовано 90 отечественных и 76 зарубежных источнике литературы.