Введение к работе
Актуальность темы диссертации
В настоящее время широкое распространение получили внутрибольничные инфекции, вызываемые различными видами патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Чаще всего они вызываются золотистым стафилококком, синегнойной палочкой, кишечной палочкой, стрептококками групп А, Д, К, бактероидами (Акатов А.К. с соавт.,1980; Колесов А.П.с соавт., 1989; Ха-теневер М.Л. с соавт., 1975; Flnegold S.М., 1982). Известно, что эти возбудители обладают широким спектром ферментов инвазии и агрессии. Ими выделяются гиалуронидаза, лецитиназа, плазмокоагулаза, бета-лактамазы, протеиназы,. каталаза, гепа-риназа, ДНК-аза и т.д. Данные энзимы значительно ухудшают течение патологического процесса, ускоряют микробное распространение, инактивируют вводимые антибиотики и дезинтокси-кационные средства. С другой стороны, эти ферменты являются маркерами данных штаммов возбудителей (Безбородов A.M. с соавт. ,1984; Воропаева С.Д.. 1980; Генералов И.И. с соавт. ,1992; ДарбееваО.С. с соавт.,1988).
До настоящего времени для микробиологического исследования ДНК-азной и гепариназной активности применялись лишь качественные и полуколичественные методы. Необходимо отметить, что способы, используемые с этой целью, сложились еще в 50-60-х годах и в настоящее время недостаточно удовлетворяют поставленным задачам из-за их невысокой чувствительности, а, следовательно - большой продолжительности выполнения.
Многочисленные данные (Колуканов И. Е.,1992; Кочеровец В.И., с соавт.,1986; Joubert J.J.,1985; Sotophernandez J.L., et al.,1988; Waller J.R.,et al.,1985) свидетельствуют о необходимости продолжения разработки простых и высокочувствительных количественных способов определения ДНК-азы и гепариназы. В свою очередь, количественный характер методов дает возможность дифференцировать объекты по ДНК-азопродуцирующей и гепа-риназопродуцирующей способности (например - микроорганизмы). Стафилококк представляется здесь наиболее значимый возбудителем, т.к., во-первых, он является частым этиологическим фактором внутрибольничных инфекций (Акатов А.К., с соавт.,1980), а
во-вторых - обладает выраженной ДНК-азной активностью (Коче-ровскийЮ.Э., с соавт.,1986; Петровский С.,1987; Langlois В.Е.. et al.,1989).
Поскольку ДНК-аза и гепариназа представляют собой деполи-меразы, то акт их каталитического действия на молекулу полимера приводит к скачкообразному изменению состояния субстрата, поскольку средняя молекулярная масса его при этом снижается вдвое. Этот переход можно обнаружить, присоединив к субстрату легко детектируемую метку (колориметрическую или флюоресцентную) с последующим отделением распавшихся молекул от непрореа-гировавших. Если использовать это свойство, то можно резко повысить чувствительность способов с одновременным приданием им количественного характера. Кроме того, используемая метка должна быть дешевой, безопасной и легко доступной.
Этим условиям соответствует выбранный нами флюорохром риванол (2-этокси-б,9-диаминоакридина лактат), вызывающий сгуст-кообразование с субстратом (ДНК) обратно ее деполимеризации соответствующим ферментом.
В свою очередь, для исследования гепариназной активности существует возможность удаления нераспавшегося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением этонием (1,2-эти-лен-бис-(И-диметил-карбдецилоксиметил-) аммония дихлоридом) с последующим определением уроновых кислот в надосадочной жидкости карбазоловым методом.
Все это создает необходимые предпосылки для разработки простых чувствительных количественных методов определения как ДНК-азной, так и гепариназной активности бактерий. Создание таких методов позволило бы точно оценить продукцию данных ферментов агрессии, изучить их использование в качестве диагностических критериев, исследовать их вклад в патогенез соответствующих инфекций, а также разработать мероприятия по коррекции таких инфекционных процессов при помощи антиферментной терапии.
Связь работы с научными программами и темами
Работа является частью научных исследований по теме социального заказа здравоохранения Республики Беларусь "Комп-
лексное изучение течения и распространения госпитальных инфекций в лечебных учреждениях Республики Беларусь".
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилась разработка новых методов определения ДНК-азы и гепариназы для оценки продукции этих ферментов патогенности микроорганизмами-возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
разработать количественный способ определения ДНК-азной активности биологических объектов;
-
при помощи данного способа изучить термостабильную и термолабильную эндонуклеазную активность стафилококков, выделенных от различных контингентов обследуемых;
-
разработать способ определения гепариназной активности микроорганизмов;
-
проанализировать взаимоотношения между продукцией этих ферментов и другими энзимами, выделяемыми возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний и их осложнений.
Научная новизна полученных результатов
Впервые разработан высокочувствительный способ определения ДНК-азы, основанный на сгусткообразовании риванолом дезоксирибонуклеиновой кислоты обратно" пропорционально ее деполимеризации, позволяющий зафиксировать до 2 нг энзима в пробе, коэффициент вариации метода до 9%.
Впервые разработан метод определения гепариназной активности микроорганизмов, основанный на удалении нераспавше-гося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением этони-ем с последующим определением уроновых кислот в супернатанте карбазоловым методом.
Предлагаемые диагностические критерии (продукция термостабильной эндонуклеазы, плазмокоагулазы и лецитиназы) позволяют с вероятностью до 99, 8% дифференцировать золотистый и эпидермальный стафилококки.
Практическая значимость полученных результатов
Результаты исследования внедрены в бактериологической лаборатории Витебской областной клинической больницы, эпидемиологическом отделе Витебского областного центра гигиенн и эпидемиологии, а тагасе используются в учебном процессе на кафедре микробиологии с иммунологией и вирусологией Витебского медицинского института.
Разработаны и издаются методические рекомендации МЗ Республики Беларусь по определению ферментов агрессии и инвазии микроорганизмов.
Оформлено 2 заявки на изобретения "Способ определения ДНК-азной активности" и "Способ определения гепариназной активности бактерий". По первому изобретению получено положительное решение патентного ведомства Республики Беларусь от 16.08.1994г. По второму получена приоритетная справка от 13.10.92 г. N 5064948 патентного ведомства Российской Федерации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Определение ДНК-азной (ТНК-азной) активности, основанное на образовании сгустка дезоксирибонуклеиновой кислоты риванолом обратно пропорционально ее деполимеризации, делает возможным быстро количественно оценить продукцию этого фермента бактериями.
-
Определение гепариназной активности бактерий, основанное' на удалении нераспавшегося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением с последующим определением уроновых
кислот в супернатанте карбазоловым методом, позволяет выявлять гепариназопродуцирующих представителей аэробной и анаэробной микрофлоры среди возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.
Личный вклад соискателя
Все исследования, проведенные в рамках диссертационной темы, выполнены самостоятельно.
Апробация результатов диссертации
Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены: на ежегодных научных конференциях Витебского мединститута, а также представлены на 1 Пленуме общества иммунологов Республики Беларусь (Могилев, 1993 г.); на 20 Пленуме правления общества хирургов Республики Беларусь (Новополоцк,1994); и на 2 Европейском съезде химиотерапевтов "Химиотерапия в инфекционных болезнях" в г. Коимбра, 1994г., Португалия.
Опубликованность результатов
По результатам исследования опубликовано 8 научных работ. Оформлено 2 заявки на изобретения. Разработаны и издаются методические рекомендации МЗ Республики Беларусь по определению ферментов агрессии и инвазии микроорганизмов. Получено 2 удостоверения на рационализаторские предложения.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 97 страницах машинописи, иллюстрирована 18 таблицами и 14 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 86 отечественных и 104 иностранных источников.