Введение к работе
Актуалми>ег*лро$яе*4ьи
Ботулизм тяжелое заболевание человека и животных нервно-паралитического характера, часто имеющее летальный исход. 8 1992 г. в России иареімсірироваие» fw>"ee 400 егг/гйспГ даїшогй оабшіевания.
Clostridium botulinum, анаэробные спорообразующие
микроорганизмы, продуцируют нейротоксины, являющиеся самыми сильными токсинами природного происхождения. В среднем, летальная доза для мышей составляет Ю пг ботулинического нейротоксина [ SakagucM G.,1983]. В настоящее время известно 7 серологически различных типов иейротоксинов: А, В, С. D, Е. F и G. Все они продуцируются различными штаммами С. botulinum, но имеют сходные размеры и молекулярную организацию. Это достаточно бопьшие белки, состоящие из 2 полипептидных цепей - легкой (50-59 xDa) и тяжелой (85-105 кОа). соединенных между собой как минимум одной дисульфидной связью t Smith LO.,1977 ]. Іюпадая в организм человека или животных, ботулинические нейротоксины действуют на уровне периферической нераной системы, где блокируют выделение медиатора - ацегилхолина [Sctlin L.C., 1981). Несмотря на то, что заболевание ботулизмом известно уже более 200 лет, в настоящее время детальный механизм действия нейротоксинов «едостаточмо изучен, в особенности на молекулярном уровне. Считается, что нейропаралитический эффект токсина достигается в результате прохождения им 3 стадий: связывания токсичной молекулы на поверхности пресинаптической мембраны, энергозависимого
проникновения части молекулы внутрь клетки и ингибирующей стадии ( Simpson L.L,1981].
Лекарств против ботулизма сейчас не существует. Полагают, что ботулизм человека вызывается 4 типами нейротоксинов А, В, Е и F. Кроме классических штаммов С. botulinum, как. было обнаружено, причиной ботулизма могут являться некоторые другие микроорганизмы, как, например, С. butyricum, продуцирующий иейротоксин типа Е [McCroskay LM.,1986], и С. barati, продуцирующий иейротоксин типа F I Hall J.D., 1985]. Сравнительно недавно были расшифрованы нуклеотидные последовательности генов нейротоксинов типов А [ Binz Т., 1990, Thompson D.E.,1990], В [ Whelan S.M.,1992], С [Hauser D..1990], D [ Binz T.,1990], E [Whelan S.M.,1992]. F {Thompson D.E., 1993].
Что касается диагностики ботулизма, то она имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как анаэробов и отсутствием селективных сред для них. Кроме того,- единственным методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботулинические нейротоксины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтрализации специфическими антитоксинами. Данный метод требует большого количества лабораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать не этичным. Помимо этого, биопроба также не всегда обеспечивает получение необходимой информации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не имеют лабораторного подтверждения. Разработанные на настоящее время иммунологические методы определения нейротоксинов не нашл*
широкого применения ввиду недостаточной чувствительности [ Oguma К.. 1980, Oguma К., 1984).
В последние годы для выявления целого ряда патогенных бактерий разработаны методы, основанные на использовании ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции, которые достаточно хорошо зарекомендовали себя в практике.
В связи со сказанным выше становится очевидной iir>r>fi*nrn»« Цели»_и_аадачи... иседедован иіи Целью настоящей работы являлась разработка молекулярно-биологических методов для идентификации С. botulinum. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1) Получение зонда для гибридизации, специфичного для гена нейротоксина С. botulinum типа А. Разработка метода ДНК-гибридизации для выявления С. botulinum А. Разработка метода ПЦР для идентификации С. botulinum типа А. Разработка метода ПЦР для идентификации С. botulinum типа В. Оценка возможности использования методов ДНК-гибридизации и ПЦР для тестирования биологических проб. Наїаиая^ои*зшЦиицаи>імес.кая^еішша,і.^абш*и. В данной работе показана возможность использования ДНК-зондов для идентификации Clostridium botulinum типа А. Методом гибридизации по Саузерну впервые было выявлено наличие 2 групп штаммов С. bolulinum А, различающихся по областям ДНК, расположенным перед геном нейротоксина. Эти данные могут быть, в частности, использованы при исследовании%лидемиологии ботулизма. В последние годы зарубежными учеными предприняты попытки адаптировать метод ПЦР для выявления С. bolulinum [ Szabo Е.А.,1992, 1993]. В России подобные исследования проводятся впервые. Разработан метод ПЦР для идентификации С. bolulinum типов А и В, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью (1 пг ДНК), который может быть использован в диагностических лабораториях для выявления данных микроорганизмов. Метод ПЦР прост в исполнении, обеспечивает быстроту получения результатов (5 часов от начала исследования) и особенно удобен в тех случаях, когда необходимо протестировать большое число проб. Полученные данные поданы в ГИСК им. Тарасевича для составления Временной фармакопейной статьи. На защиту выносятся следующие положения: 1. Метод ДНК-гибридизации для идентификации Clostridium Штаммы С. botulinum типа А можно разделить на группы при помощи гибридизации по Саузерну, используя полученный зонд. Метод полимеразной цепной реакции для выявления С. botulinum типов А и В. Апробация диссертационной работы проведена на научной конференции лаборатории клостридиозов 19 января 1995 г. Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 печатная работа. 0бьемл„сіруктура_лиссеріаиии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и 14>шюс1риг>«эн!! Т7 "p"C/"Kui.:u vi о іабіїицами. (;nwro< питерятури содержит 133 наименования.
botulinum типа А. .