Введение к работе
Актуальность проблемы. Производство рофилактических бактериальных препаратов является сложным ;ногофакторным процессом, в том числе и чумной живой вакцн-ы. Биотехнология ее хорошо разработана, но несмотря на четко егламентированные почти все этапы изготовления отмечается чень широкая вариабельность жизнеспособности коммерческих ерий чумной вакцины, от 25 до 50% (Ракігпшя Р т !Р22). ^Стмг--пого^^сп. "ї'.тгіоії "-"".".гм: 132 jubni-n-r ^т :.::-:сг;іа факюров. стречгпсщихся как в процессе её приготовления, гак и хранения \нисимова Т.И., Голубева В.К., 1966; Тннкер А.И. с соавт., 1966: Филиппов А.Ф., 1964 и др.). Общепринятым методом изучения живых (икробных клеток является культуральный, основанный на способ-ости их расти на искусственных питательных средах. Считается, то такие особи наиболее полноценны, хотя известно, что популяция леток чумной вакцины ЕВ неоднородна и содержит микробы, кото-ым присущи элементы жизнедеятельности, но они потеряли способ-ость к образованию колоний на агаре (Тинкер А.И.. 19"!). Поэтому ажной проблемой остается дальнейшее исследование изменений по-уляции штамма ЕВ. особенно, в зависимости от факторов, связанных производственным циклом.
Многочисленные данные литературы показывают, что все этапы производства вакцинных препаратов в тон или иной степени оказывают губительное влияние на микроорганизмы. В то же" время анализ показывает, что наиболее вредным поздейсгвиям подвергаются иоіраничньїе системы клетки, коюрые играют важную роль и жизнеобеспечении микробов (Стейннер Р. с соавт., 19"^9: КагаваЯ.. 1985 и др). Подтверждением сказанному служат данные В. Калаус, 3Лавличек (1987), показывающие, что основной мишенью для повреждений являются клеточная стенка (КС) и цитоплазматнческая мембрана (ЦПМ). При этом М.Д.Нуснмов (1982; считает, что при разрыве ЦПМ еще возможны репарационные процессы, но при разрыве КС обязательно происходит их гибель. По мнению Д.Н .Островского с соавторами (1983) нарушение структуры и функции прямо или косвенно отражается на жизнеспособности микробов, вплоть до необратимых процессов, приводящих к летальному их исходу.
Р.И. Кузьмина с соавторами (1987) считают, что учет повреж дения мембранных структур, определяемых электронномикроско пически, может служить надежным ориентиром при выборе способг и режима криоконсервации и сушки. Однако следует учитывать, чтс проблема повреждений клеток после различных физических воздей ствий изучена широко, но аналогичных исследований, связанных с лиофилизацией мало (Плешакова Т.В., 1992). Это в полной мере относится и к биотехнологии чумной вакцины. За более чем 50-летнш период ее разработки такого рода исследования практически отсутствуют, хотя они представляют не только теоретический интерес, не и сугубо практическое значение, поскольку позволяют более объективно оценить качество популяции вакцинного штамма, выявить наличие и роль поврежденных и разрушенных клеток, определить наиболее уязвимые места биотехнологического процесса и разработать информативный тест для отработки оптимальных режимов производства препарата. Этим и определяется актуальность проблемы.
Цель работы. Разработать с помощью электронно-микроскопического исследования тест количественного определения поврежденных бактериальных клеток чумного вакцинного штамма ЕВ. изучить условия их образования в процессе производственного цикла,регидратации препарата и хранения суспензии.
Задачии сследования:
-
Дать ультраструктурную характеристику повреждений бактериальных клеток штамма ЕВ.
-
Разработать объективный и информативный количественный тест повреждения КС и ЦПМ микробов чумной вакцины ЕВ.
-
Изучить влияние некоторых этапов производства чумной вакцины ЕВ на повреждаемость микробных клеток.
-
Исследовать значение процесса регидратации сухой таблетки и условий хранения суспензии на повреждение клеток вакцинного штамма ЕВ.
-
Выработать рекомендации для использования теста повреждения КС и ЦПМ в процессе отработки и совершенствования биотехнологии чумной вакцины.
Науч-н ая новизна. Впервые показано, что в
процессе производства чумной вакцины ЕВ происходит повреждение КС и ЦПМ микробных клеток. Установлена зависимость между количеством поврежденных клеток и степенью воздействия некоторых этапов биотехнологии препарата. Быстрая воспроизводимость ре-і
ультатов позволяет предложить дополнительньш экспресс-метод :онтроля качества полуфабрикатов. Разработанный способ и поученные результаты существенно расширили представления о не->днородности популяции клеток чумного вакцинного штамма ЕВ и юзволяют дать более полную качественную характеристику исполь-уемому препарату. Полученные результаты могут быть использова-іьі в качестве положительного примера для разработки аналогичного методического приема в процессе создания или совершен-твования других бактеоиалкнкії nQvini..n..« ггргп^рйтсіі.
П у Л К L И Ч Є с к- л и » Є !! !! С С Т I.
На основании результатов исследования разработаны:
-
"Способ определения степени повреждения бактериальных леток" с помощью электронной микроскопии в процессе производ-тва для экспресс-анализа состояния клеток и отработки биотехноло-ических режимов приготовления бактериальных вакцин. Способ ащищен авторским свидетельством N 1598653 от 8 июня 1990 г.
-
Методические рекомендации "Способ количественного опре-(еления поврежденных бактериальных клеток вакцинного штамма іВ", утвержденные 28 мая 1992 г. Ученым Советом СНИПЧИ. Ука-анные методические приемы широко применяются в производствен-юй и научной деятельности лаборатории чумных вакцин Ставро-юльского научно-исследовательского противочумного института.
-
Данные исследований использованы, как дополнительный бъективный тест при составлении изменений к регламенту произ-юдства чумной живой сухой вакцины на внедрение тномочсвиновой реды высушивания с увеличением срока годности препарата до 5
[ЄТ.
Апробация работы: материалы диссертации доложены и бсуждены на:
-
Межведомственной научной конференции "Актуальные во-[росы профилактики особо опасных инфекционных заболеваний" Киров, 1991).
-
Совместном совещании "Вопросы стандартизации получения і оценки качества чумных к сибиреязвенных вакцин" (Киров, 1992).
-
Российской научной конференции "Иммунология и специ->ическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993).
-
Межгосударственной научной конференции "Профилактика и іерьі борьбы с чумой" посвященной 100-летию открытия возбудите-и чумы (Алматы, 1994).
Заказ № 928
5. Итоговой научной конференции, посвященной 100-летию от крытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994).
Публикации: основное содержание работы отражено в < опубликованных статьях.
Объем и структура ра б о ты. Диссертация состоит и: введения, Г гаавы обзора литературы, 5 глав собственных исследо ваний, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллю стрирована 21 таблицей и 20 рисунками. Библиографически» указа тель содержит 242 литературных источника, в том числе 192 рабо: отечественных и 50 зарубежных авторов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Способ количественного определения поврежденных бактери альных клеток чумного вакцинного штамма ЕВ до и после лиофили зации.
-
Влияние этапов производства чумной вакцины ЕВ (условш культивирования биомассы, защитные среды и т.д.) на повреждае мость микробных клеток.
-
Значение процесса регидратации сухой таблетки чумной вакцины ЕВ, длительности и температуры хранения суспензии для образования поврежденных микробов.
4. Характеристика популяции клеток в прививочной доз
чумной вакцины ЕВ, основанная на определении структурных и ме
таболических повреждений микробов.