Введение к работе
Актуальность проблемы. Постоянная циркуляция возбудителя
дифтерия в окр)~:зюинч среде приводит к риску ВОЗ!ІИХНОЗЄШ!Я
~аболгз?Л!ія особенно среди ненммунных и лиц с ослабленным
иммушггстом (Н-Н.Коспокова, 1971; 1993; НЛ. Сухорукова, 1978;
л-л.й/япппокя и гпиит.. ivhi «. гі г-опгти«гітіі іі*гт-пяігиі». ияшліяя п і wii г---
j*»»j 'ЛОli^^V,ІГЯ ^ц-т-чч"-***! т"ч 2*ІНІ7в*ЇІ*т*-ІС,г'>ГО т^^с^с***' ГТТ!"'І"' *ММ""Ї1
ішфекшш. Показатели заболеваемости (ПЗ) по сравнению со средними многолетними показателями возросли в 1990 г. - в 1,6 р., в 1991 г. - в 2,6 р., в 1992 г. - в 5,2 р., з 1993 г. - в 20 р. (С.С. Маркина и соавт., 1993; ЕА.Котова и соавт., 1994).
В этой связи очевидна необходимость наблюдения за штаммами C.diphllieriae - изучения их токсигенных свойств для прогнозирования потенцивдьнон опасности и типирования для определения путей распространгш'я инфекции (Н.Н.Костюкова, ЛА. Фавсроза, 1968; В.В.Чсркзсова и соавт., 1975; С.С.Маркина, 1971; И.К.Мазурова, 1993; A.Saragca, P.Maximescu, 1969; AAjidronescu, 1993; A.Efslratiou et. al., 1994).
Традиционные методы диагностики и типирования C.diphtheriae, основанные на фенотипическом выражении биологических-свойств, не всегда дают объективную оценху циркулирующих штаммов. Например, некоторые иггаммы проявляют токснгешгую активность в реакции преципитации в геле (РП) только после многократных пассажей на питательных средах (И.К. Мазурова и соавт., 1989).
И 5 существующих систем тиш'ропания только метод биохимической дифференциации стабильно подразделяет C.diphtheriae на три биоварйанта, однако .этого недостаточно из-за высокой гетерогенности C.diphtheriae внутри каждого биоварианта. (AAnderson, 1993; Coyle, 1993; Bergey's manual, 1994). Другие системы типирования по фенотипическим признакам - серо- фаго- и корицинотипироваине часто не позволяют проводить внутривидовую дифференциацию C.diphtheriae по ряду причин. Серотип определяется поверхностными антигенами, подверженными изменчивости. Схіена антигенного состава приводит к появлению штаммов, для которых не разработаны серотиповые сыворотки (В.С.Суслова, 1964; МД.Крылова, !97б; В.В.Черкасова 1988; L.Gibson, G.Colman, 1973).\Лмеюшдшйся коллекциями фагов подразделяются на фаговарианты в основном штаммы биоварианта gravis, mitis - лишь в .незначительном проценте случаев (С.С.Маркина и соавт.,. 1983). Кориішцетгаїирование имеет ограниченное применение из-за громоздких
схем маркирования (Н.А.Кравченко, О-Д.Трофимова, 1980; 1981). Поэтому поиск принципиально иного методического подхода представлялся актуальным.
Современная микробиология интенсивно использует методы молекулярной биологии, которые могут по-новому раскрыть структурные особенности клетки и механизмы распространения патогенных микроорганизмов. В диагностике и наблюдении за рядом инфекций широкое распространение .получили молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей ' инфекционных заболеваний по особенностям нуклеотидного состава ДНК, вне зависимости от проявления биологических свойств (М-Р.Бобкова и соавт., 1985; АЛ.Гинцбург, 1989; P.Sadowsky et. al., 1979; T.Woods.et. al., 1982; A.Pap{seaheimer, 1983; N.Groman, 1984; F.Rubm et. al., 1985; RJtappuoli et. al., 1987; 1988; 1990; F.Tenover, 1988; 1993; B.Swaminathan, G.Matar, 1993).
Целью настоящей работы явилась разработка и использование 'молекулярно-генетическнх методов для индикации возбудителя дифтерийной инфекции по наличию гена дифтерийного токсина (ДТ) и для типирования C.diphtheriae на основе знания генетической структуры клетки.
Основные задачи исследования:
-
Разработать метод молекулярной гибридизации с ДНК-зондом, комплементарным гену ДТ, для . дифференциальной диагностики токсигенньіх и нетоксигенньк C.diphtheriae.
-
Адаптировать методы генотипирования - ресгрикционный анализ хромосомной ДНК, блот-гибридизацию со специфическим ДНК-зондом и универсальным рРНК-зондом (рнбопшнрование) и изучить возможности их применения для внутривидовой дифференциации C.diphtheriae.
3. Охарактеризовать штаммы C.diphtheriae с применением
разработанных молехулярно-генетических методов исследования.
Научная новизна работы.
Впервые применен молекулярно-генетический подход для изучения тохсигенных свойств и типирования штаммов C.diphtheriae. Разработан метод спот-гибридизации для' индикации 'Токснгенных C.diphtheriae. Проведен скрининг штаммов на наличие гена ДТ. Установлено, что при широком скрининге целесообразно использовать безвекторный ДНК-зонД, не содержащий нуклеотидных последовательностей векторной и фаговой ДНК.
Нмґгтся авторское свид.тггяъство "CttoccR кддакаяик токсигенных C.diphtheriae" (совместно с А.Ф.Бобковым, М I'tjCSkcso}., М.М.Гарагві.:м и пр.) Л5 ] б 1699 ] от I сентября 1990 г.
О.тргделены возможности методов генотіширования для
внутривидовой дифференциации штампов Cdipblherias.
Поопємонстонеовено преимущество риботипнрования - уішагрсгльного
Mciuuttс oiuuuivun '-. .f» і .;.,...: вд Avawnplu^aa.H.f,J.МА44,—. ZZ1C^~-ГТ'ГСПТ".
Впервые проведено изучение штаммов C.diphtheriae в рнботшінровании. Показано, что популяция C.diphtheriae гетерогеїша по генетической структуре. В годы подъема заболеваемости получают преимущественное распространение отдельные клоны, состоящие из генетически идентичных штаммов.
Практичепсая значимость работы.
Комплексное применен..: методов индикации роэбудчтеля дифтерии по токсину и гену токсинсобразования дает возможность в полном объеме ьыяалять зшщемическі опасные токсигенные штаммы. В практике диагностических и эпидемиологических исследований метод спот-пгбридкзации может быть рекомендован Центральным и Референс-лабораториям для изучения штаммов C.diphtheriae, показывающих сомнительные результаты в РП, РНГА и ИФА.
Метод риботипирования позволяет наблюдать за процессом формирования клонального состава популяции C.diphtheriae в динамике по годам на различіліх территориях. Интенсивное распространение определенных клонов может явиться прогностическим прішіаком, сзидегельстБующнм сб эпидемическом неблагополучии. Метод может быть рекомендован Рефереяс-лабораториям.
Сравнительное изучение C.diphtheriae бактериологчесхими, имунно-химическимн и молекулярно-генетическими методами дало возможность
совершенствовать лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.
Н а основе полученных данных составлены:
1. Методические рекомендации "Индикация дифтерийного токсина методами ИФА и РНГА (совершенствование лабораторной диагностики дифтерийной инфекции)", утв. МЗ РСФСР, 1991 г. (совместно с И.К.Мазуровой, Е.Е.Потемкиной, А.Б.Жебруном, В.В.Свнридовым и др.)..
2. Раздел "Методы тшшрования C.diphtheriae" для Руководства по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции по заказу Госкомсанэпиднадзора.
Настоящая работа является частью комплексных исследований, проведенных совместно с лабораторией биотехнологии' Инсппута вирусологии им. ДЛЛвановского (рук. д.б.н. проф. М.М.Гараев), лабораторией биотехнолопш С.-Петербургского НИИЭМ им. Пастёра (рук. д.бл. проф. А-Б.Жебрун), лабораторией моноклоналъных антител ЦНИИВС им. ИЛ.Мечникова (рук. kju.h. В.В.Свирндов), лабораторией диагностики дифтерийной инфекции МНИИЭМ им. ГЛРгбричевского (рук. д.мл. И.ІСМазурова). Исследования по риботипкрованию проводили в рамках международной программы, принятой на Международном совещании "Эпидемия дифтерии в Европе''' (С.Петербург, 1993).
Основные потгожения. выносимые на защиту.
-
Метод спот-гибридизации с безвекгерньга ДНК-зондом, строго специфичным гену ДТ, позволяет дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы C.diphtheriae.
-
Адаптировшшые для C.diphtheriae методы генотипирования г рестрикцаонный анализ хромосомной ДНК, ..блот-гябридизацпя со. специфическим ДНК-зондом и универсальным РНК-зондом обладают высокой дискрилиширующей способностью, что создает преимущество перед фенотипическими методами типирования.
-
Универсальность и высокая разрешающая способность выделяют рнбогипирование в ряду других молекулярно-генетических методов типирования, что позволило наблюдать за процессом формирования клонального состава популяции C.diphtheriae. ~
Апробация работьт. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета 'Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний" МНИИЭМ им. Г Л .Габричевского 28 декабря 1994 г.
Материалы работы доложены на конференциях молодых ученых МНИИЭМ им. Габричевского (1986; 1988), Юбилейной конференции С.-Петербургского НИИЭМ им. Пастера (1993), I Мегкдународном совещании рабочей лабораторной группы.ВОЗ по дифтерии. (Лондон,. 1994).
Публикации. По теые диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 1 авторское свидетельство.
Струкіура і, обі.^м работы. Диссертация написана по обьїчному !Г.ану її состоит in введения, обзора тггературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего іті источник . Работа иллюстрированна 15 рисунками, 20 таблицами, 8 фотографиями. Общий объем диссерташга /46 страниц .
Мзтериа'ш. ґгіуеренс-штаммьі: Cilipiilhenae J»v
Изучены штаммы с различных территорий РФ. циркулировавшие в 1985-1993 г.г. (коллекция лабораторий диагностики дифтерийной инфекции. МНИИЭМ. им. Г.Н.Габріпїевского). С применением мологулярно-генетических методов исследования проаналгаировано 195 штаммов, в иммуно-химичеекпх методах (РП, ИФА, РНГА) - 273 штамма.
Бактериальные плазмиды ptox4.1 и рА5, содержащие полную нуклео-тидную последовательность гена ДТ коринефага ср 984 сконструированы в лаборатории биотехнологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (А.Ф.Бобкоз и соавт., 1986; М.М.Гараев и соавт., 1990).
Методы исследования. Микробиологические » шшуно-химические истоды. Идеіггнфнкгщзо C.diphtheriae с опредслеішем кулътуралыю-биохимических и токсигенных свойств проводили согласно "Инструкции . по бактериологической и серологической индикации возбудителя дифтерии и его токсина"(приложение № 4 к приказу № 450 МЗ СССР, 1986 г.).
Молгкулярно-генетнческие методы. Хромосомігую ДНК C.diphtheriae выделяли фенольным методом (J.Shiller et. al., 1980) и в градиенте хлористого цезия (Т.Маниатис и соавт., 1984). При проведении риботипирования ДНК выделяли по универсальной методике (L.Graves, B.Swamiaathan, 1993). Выделение плазмидной ДНК E.coli проводили по методу (M.Bazaral, D.Helinski, 1968).
Элекгрофоретический анализ препаратов ДНК, препаративное
выделение индивидуальных фрагментов ДНК, гидролиз ДНК
специфическими эндонукпеазами, перенос фрагментов ДНК с агарозного
геля на нитроцеллюлозную мембрану по Саузерену, гибридизацию с 32Р-
мечеными ДНК-зондами осуществляли по методикам, описанным
Т.Маниатис и соавт., (1984). ч%
Радиоактивно-меченые зонды получали методом ник-трансляции (P.Pigby et. aL, 1977; Т.Маниатис и соавт., 1984). Биотинилирование ДНК-зонда проводили химической модификацией нуклеиновой кислоты с помощью фотоактивируемого реагента (А.В.Карпухин и соавт., 1991). Универсальный К.ДНК-зонд получали в реакции обратной транскрипции рРНК E.coli, мечение осуществляли дигоксигенинсм с использованием коммерческого набора реагентов Genus 2DNA Labeling Kit, "Boehringer".
Спот-гибриднзацию с радиоактивными зондами проводили, как
описано М.РЛЗобковой (1987), с биотиншшрованным зондом -
М.М.Гараевым и соавт. (1990). '
Риботшшровакне проводили по методике T.Popovic et. si., (1993), разработанной для микроорганизмов других видов.
Методы статистической обработки экспериментальных данных. Для оценки _ дискриминирующей. способности методов типирйвания.. C.diphtheriae рассчитывали индекс дискриминации (Д) (P.Himter, M.Gaston, .1988). При установлении наличия коррелятивной связи был применен принцип корреляции максимумов (В.Н.Вапник, А-Я.Червонинкис, . 1974; А.Т.Фоменко, 1990). Количественно коррелятивную связь характеризовали коэффициентом корреляции (И.П.Ашмарин,А.В.Воробьев, 1962).