Введение к работе
Актуальность проблемы. Сложившаяся эпидемиологическая ситуация с дифтерийной инфекцией требует активизации дальнейшего совершенствования ускоренных методов диагностики и разработки надежных методов эпидемиологического надзора за возбудителем заболевания.
Традиционно используемая схема бактериологического анализа при дифтерийной инфекции по продолжительности занимает 3-5 суток, что не позволяет своевременно подтверждать клинический диагноз и проводить необходимые мероприятия в очагах дифтерийной инфекции и в клинике.
К настоящему времени хорошо изучен и
охарактеризован основной фактор патогенности
Cotynebacterium diphtheriae - дифтерийный токсин, который детерминируется геном tox, интегрированным в хромосомальную ДНК коринебактерий в составе лизогенных фагов. Также известно, что в популяции C.diphtheriae встречаются, так называемые, потенциально-вирулентные штаммы, имеющие в геноме последовательность /ax-гена, но не продуцирующие токсин [N.Groman,1953,1983]. Получение информации о распространении и генетической структуре таких штаммов определит их эпидемиологическую значимость и позволит лучше понять механизмы формирования популяции токсигенных микроорганизмов.
Интенсивное развитие молекулярно-биологических
методов исследования предоставляет возможность
применить принципиально новый подход, основанный на
определении специфических нуклеотидных
последовательностей генетических детерминант факторов патогенности, в диагностике дифтерийной инфекции и в изучении генотипических признаков C.diphtheriae.
Представляется перспективным использование метода
гибридизационного анализа со специфическими ДНК-
зондами, которые способны связываться с
комплементарными последовательностями нуклеиновой
кислоты (НК) в геноме изучаемого микроорганизма с
образованием двуцепочечных структур. Возникновение таких структур позволяет сделать заключение о присутствии искомой последовательности в изучаемом образце.
Целесообразно применять несколько (набор) ДНК-зондов. В этом случае появляется возможность выбора наиболее чувствительного и специфичного зонда для выполнения гибридизации с диагностическими целями и получения более полной информации о генотипических признаках микроорганизма (определения не одной, а нескольких генетических детерминант) для изучения штаммов в процедуре гибридизационного анализа.
В 1991 г. М. Pallen разработал метод полимеразнои
цепной реакции (ПЦР) для дифференциации токсигенных и
нетоксигенных штаммов C.diphtheriae в чистой культуре.
Реакция основана на накоплении (амплификации)
специфических последовательностей НК до количества,
необходимого (достаточного) для детекции. Использование
принципа этого метода явилось основой для создания новой
технологии ускоренной диагностки возбудителя
дифтерийной инфекции.
Цель: на основе технологий ДНК-ДНК гибридизации и полимеразнои цепкой реакции разработать и адаптировать для практического использования: 1) метод для определения генетических детерминант токсинообразования у штаммов Corynebacterium diphtheriae и 2) ускоренный метод диагностики дифтерийной инфекции.
Задачи исследования;
-
Создать полный набор специфических ДНК-зондов для детекции /ox-гена дифтерийного токсина и его фрагментов (А и В) для использования последних в процедуре гибридизации;
-
Оптимизировать технологию ДНК-ДНК гибридизации для обнаружения последовательности фрагментов А, В и АВ (целого гена) ґолс-гена дифтерийного токсина с использованием набора специфических зондов;
-
Разработать диагностический метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий обнаружить токсигенные коринебактерии в клиническом материале;
-
Определить чувствительность, специфичность и прогностическую значимость положительных и отрицательных результатов методов ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР для правильной интерпретации результатов исследования.
Научная новизна работы:
Разработана оригинальная диагностическая технология на основе ПЦР для дифференциации токсигенных штаммов C.diphtheriae, адаптированная к условиям практических лабораторий.
Создан штамм-продуцент специфического ДНК-зонда к фрагменту В гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина.
Создан полный набор специфических ДНК-зондов для детекции последовательности фрагментов А, В и АВ (целого гена) fox-гена дифтерийного токсина.
Оптимизирован метод ДНК-ДНК гибридизации с использованием созданного набора специфических ДНК-зондов к фрагментам А, В и АВ гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина, для изучения генома коринебактерии на наличие указанных генетических детерминант токсинообразования. Определены параметры, определяющие эффективность метода: чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов.
Практическая значимость работы:
-
В Коллекцию штаммов ГИСК им. Тарасевича депонирован штамм-продуцент зонда toxB' для обнаружения фрагмента гена дифтерийного токсина методом гибридизации (Справка № 00-13/15 от 07.09.1993);
-
Метод для обнаружения токсигенных штаммов C.diphtheriae, основанный на полимеразной цепной
реакции, адаптированный для практического применения включен в «Лабораторное Руководство по диагностике дифтерийной инфекции» (Москва, 1995 г.). Метод позволяет получить результат в течение 24 часов о наличии токсигенных коринебактерий в исследуемом образце.
Основные положения, выносимые на защиту;
-
Разработан ускоренный метод на основе ПЦР для обнаружения токсигенных C.diphtheriae в клиническом образце, позволяющий получить результат через 24 часа от начала исследования;
-
Создан полный набор специфических ДНК-зондов к фрагментам А, В и АВ гена, детерминирующего синтез дифт%дайного токсина;
-
Оптимизирован метод ДНК-ДНК гибридизации с . использованием набора специфических ДНК-зондов для определения генетических детерминант токсигенности.
Апробация работы проведена на заседании секции Ученого Совета МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» (Протокол № 2 от 15.03.95). Основные положения диссертационной работы доложены на Международном совещании «Эпидемия дифтерии в Европе» (С- Петербург, 1993), научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики» (Пермь, 1993), на Первом международном совещании Лабораторной рабочей группы по дифтерии (Лондон, 1994).
Публикации: по материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ.
Структура и объем диссертации:
Работа изложена на 111 страницах машинописи, включает 90 страниц текста, 25 таблиц и рисунков и
состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 55 отечественных и зарубежных литературных источников.