Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что преобладающая часть азота в почве находится в форме органических соединении, которые до 20—40% представлены белковыми веществами и аминокислотами (Вгетпег, 1965).
Своим происхождением они связаны с растительными* и животными остатками, микробной массой. Белок попадает в почву также с органическими удобрениями: при внесении навоза, различных компостов, при запашке зеленых удобрений. Белковые вещества входят в состав перегноя.
В почве непрерывно происходят процессы: синтеза и рас* пада белков. При этом динамика усвояемых форм азота тесно связана с разложением белков и аминокислот. Все эти процессы влияют на почвенное плодородие, развитие растений и их урожайность (Джуманиязов, Каэиев, 1975).
Одним из ведущих процессов в трансформации белковых веществ в почве является их протеолиз, осуществляемый как аэробными, так и анаэробными микроорганизмами. Трансформация белковых соединений аэробными микроорганизмами изучена достаточно подробно (Мишустин. Тимофеева, 1944; Красильников, 1958; Пошон, Баржак, 1960; Сапожников и др., 1973; Илялетдинов,. 1976 и др.). Несмотря на обширную литературу, посвященную трансформации белковых веществ микроорганизмами, роль анаэробных бактерий рода Clostridium в разложении укззанных соединений остается невыясненной. Между тем представители рода Clostridium широко распространены в природе. Они выделены из многих естественных субстратов, но наиболее часто они обнаруживаются в почве. Эт(*,раэнообразная группа микроорганизмов включает сахзро*. пектино-, пурино- и лротеолитнческие анаэробы. Наиболее подробно изучены сахаролнтические кло-стридии {Мантейфель. 1939; Френкель, 1956; Дуда, 1964; Гудков, 1965; Емцев, 1974 и Др.).
Протеолитические Clostridium относятся к числу малоизученных микроорганизмов. Эти анаэробы исследовались до настоящего времени главным образом в медицинской микробиологии и ветеринарной практике как возбудители раневых
„1
ннфекиий, пищевых отравлений и других клостридиозов (Львов, 1960;.Тарков, 1961; Парцвання, 1971).
Однако в последние годы протеолитические анаэробы привлекли внимание и почвенных микробиологов. Было показано, что большинство бактерий рода Clostridium находится в почве в состоянии вегетативных клеток и поэтому они могут участвовать в ряде важных биохимических процессов, вероятно, также и в процессах протеолиза белковых веществ, обогащая таким образом почву доступным для растений азотом (Емцев, 1974; Соболева и др., 1977; Skinner, 1968, 1979). Все это обусловливает необходимость,изучения этой группы микроорганизмов.
Цель и задачи исследования. Целью исследования было изучение эколого-физиологических особенностей протеолити-ческих Clostridium и выяснение их роли в трансформации белковых веществ в почве.
Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить распространение протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium в почвах Советского Союза.
-
Выделить из различных почв чистые культуры. протеолитических Clostridium и изучить их морфологические, куль* туральные и физиологические свойства.
-
Исследовать влияние экологических факторов на фи-зиолого-биохимическне особенности протеолитических Clostridium.
-
Выяснить участие протеолитической группы бактерий рода Clostridium в трансформации белковых веществ в почве.
Научная.новизна, В работе впервые получены количественные данные о наличии протеолитических анаэробов рода Clostridium в основных типах почв СССР. Были выделены нз различных почв разнообразные представители протеолитической группы Clostridium, активно трансформирующие белковые вещества. У изученных видов Clostridium: CI. sporogenes, CI. bifermentans, СІ. subterminate впервые установлено изменение фнзиолого-биохимических особенностей (изменение протеолитической активности, метаболитов реакции Стикленда, продуктов брожения белков и др. свойств) в зависимости от эколого-географическнх факторов. Также впервые выявлена трансформация белков в почве анаэробными микроорганизмами и показана ее зависимость от почвенно-климатических условий. Выявленная исследованиями способность протеолитических анаэробов рода Clostridium; трансформировать белковые вещества в почве, а также определение факторов, обусловливающих интенсивность это-
го процесса, позволяет говорить о возможности направленного регулирования разложения органических азотсодержащих веществ с целью интенсификации высвобождения минеральных форм азота для повышения урожайности сельскохозяйственных культур.
Практическая ценность. Результаты исследований могут быть использованы для разработки практических рекомендаций эффективного применения органических удобрений: в сельском хозяйстве, в частности, в районах орошаемого земледелия...
Кроме того, результаты методических разработок, осуществленных при выполнении диссертационной работы, могут использоваться в лабораториях микробиологии научно-исследовательских институтов сельского хозяйства, пищевой промышленности, а также в медицинских учреждениях.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на Республиканской конференции «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур» (Каунас, 1978) и на Всесоюзной научно-технической конференции по улучшению работы в подборе, расстановке, воспитанию и подготовке молодых кадров в свете решений XXV съезда КПСС (Углич, 1978).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.
Объем работы. Диссертация изложена на 157 страницах
машинописного текста, включая 6 рисунков,- 10 фотографий,
50 таблиц. Список использованной литературы содержит 305
наименований, в том числе 129 зарубежных. '
Автор выражает глубокую благодарность канд. бнол. наук А. В. Гудкову и канд. техн. наук М. С. Уманскому за помощь в работе и ценные консультации.
Распространение протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium изучали в различных почвах СССР—в дерново-подзолистой почве, черноземе, светло-каштановой почве, а также в сероземе.
Для количественного учета протеолитических Clostridium было испытано 6 питательных сред. Наиболее приемлемой оказалась среда следующего состава: желатина —10%; пептон— 3%, цистеин — 0,05%; смесь микроэлементов по Федорову (1957) — 1-мл/л среды; дрожжевой экстракт — 7 мг/l л среды, нейтральрот —0,004%; мясной бульон—до 1000 мл. рН 7,2—7,4%. Определение численности протеолитических анаэробов производили методом предельных разведений лу-
тем посева почвы из водной суспензии на питательные среды с предварительной обработкой почвы по Д. Г. Звягинцеву (1969). Повторность четырехкратная. Наблюдения за ростом и учет проводили каждые сутки в течение 7—10 дней по следующим показателям: 1) снижению гНг среды (восстановление нейтральрота Clostridium приводит к флуоресценции среды, которая приобретает золотисто-желтую окраску); 2) разжижению желатины; 3) наличию газообразования, при этом отмечали очень сильный гнилостный запах; 4) по микроскопической картине (присутствию клеток, типичных для протеолнтических Clostridium).
Выделение чистых культур указанных анаэробов проводили на предложенной нами селективной среде для протеолнтических анаэробов (ССПЛ) следующего состава: гидролизат казеина — 50%; пептон — 3%; дрожжевой автолизат —4%; хлорид натрия — 0,3%; ацетат натрия — 0,1%; смесь микроэлементов по Форду (Ford, 1962) — 10 мл/л; агар — 2—3%; дистиллированная вода до 1000 мл; нейтральрот—1 мл 4%-ного водного раствора на 1 л среды. Ацетат натрия введен в качестве стимулятора роста споровых анаэробов. рН 7,2—7,4. Селективные условия создавали внесением в среду смеси двух антибиотиков: иеомишша и лолимиксина М в концентрациях 50 мкг/мл и 50 ед/мл соответственно, которые стерилизовали фильтрацией" и вносили в среду перед употреблением.
Изолирование протеолнтических Clostridium в чистую культуру осуществляли двумя способами: 1) с помощью накопительных культур, которые получали в среде Кигт-Та-роцци с 2-кратным пересевом по методу И. С. Скалона (1960) с пастеризацией при температуре 85 в течение 10—15 мин. и без пастеризации; 2) путем прямого посева почвенной разводки (пастеризованного и непастеризованного варизнтов) на чашки Петри со средой ССПА.
Выделение .чистых культур анаэробов из накопительных проводили в трубках Венона (Бычковская, 1966) и в чашках Петри в анаэростатах, в которых создавали вакуум с остаточным давлением в Ю-1 мм рт. ст. В некоторых случаях их заполняли COj, Nj, а для поглощения неудаленного Оа помещали щелочной раствор пирогаллола. В качестве поглотителя влаги использовали прокаленную окись алюминия. Температура инкубации посевов 37е.
Морфологические особенности выделенных культур изучали в СДЛ (Гудков, .1966), среде Китт-Тароцци ив безуглеводной среде, в которой источником азота служили пептон и смесь аминокислот деминерализованного гидролнзата казеина. Данная среда представляет собой среду ССПЛ, из которой исключены селективные агенты — смесь антнбиоти-4
ков, н именуется'нами в дальнейшем средой СПЛ (средой для протеолнтических анаэробов).
Микроскопию проводили с помощью микроскопа МБИ-1 с фазово-контрзстной насадкой, а также просматривали оттененные и негатнвноокращенные препараты целых клеток в электронном микроскопе марки «JEM-7» (Япония) или «BS-513» (ЧССР).
Культур ал ьные свойства Clostridium изучали при выращивании в средах Китт-Тароццн, СПЛ, СДЛ, мозговой среде с железом,.среде Виллиса и Хоббса (Willis, Hobbs, 1959), кровяном агаре (Лабинская, 1978). С целью идентификации у выделенных лротсолнтических анаэробов был изучен ряд физиологических свойств: разжижение желатины (Clarke, 1955); рост в лакмус-молоке (Beerens et al, 1962); ферментация различных источников углерода; редукция нитратов (Козлов, 1950); образование HSS; индола (Биргер, 1907); ацетон на (Федоров, 1957), лнполитические свойства (Gon-zaller, Sierra, 1961; Лобырева, 1973; Dole, 1970).
Протеолитнческую активность выделенных культур Clostridium определяли по нарастанию количества .тирозина в процессе протеолиза растворов казеина и гемоглобина. Содержание тирозина определяли с реактивом Фолнна—Чио-кальтео (Foliri, Ciokalten, 1927). Интенсивность окраски окрашенных растворов измеряли на спектрофотометре фирмы «Gilford» при длине волны света 570 им.
Трансформацию белковых веществ анаэробами характе-рнзопалн по трем показателям: изменению содержания в питательной среде белков, пептидов и свободных аминокислот (Клнмовский и др., 1968). Определение белков и пептидов проводили по бнуретовой реакции (оптическую плотность растворов определяли при длине волны света 584 нм), свободные аминокислоты определяли по нингндрнновой реакции при длине волны 570 нм. Оптическую плотность устанавливали на спектрофотометре фирмы «Gilford» с проточной кюветой (США). Разделение свободных аминокислот в культу-ральной жидкости проводили методом нисходящей хроматографии на бумаге (Пасхина, 1954).
Определение трансформации белковых веществ методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПЛЛГ) проводили по Мауреру (1971).
Разделение белковых веществ проводили в 7,5% ПЛЛГ (рН 8,3—8,9) в аппарате для электрофореза «модель 96» Реанал, Венгрия. По окончании электрофореза гелевые колонки фиксировали уксусной кислотой и окрашивали амидо-шварием для выявления позиций белков. Для определения интенсивности окраски белковых фракций окрашенные геле-
вые колонки спектрофотометрировалн при 605 им на спектрофотометре «Gilford».
Из продуктов брожения белков определяли летучие жирные кислоти (ЛЖК) методом газовой хроматографии, основанном на их выделении из образца при паровой дистилляции, концентрации, перевода их в метнловые-эфиры и разделения газовой смеси на отдельные компоненты на газожнд-костном хроматографе «Chrom-41» с пламенно-ионизационным детектором на стальной спиралевидной колонке длиной 1 м. Твердый носитель — иеллит 545. Жидкая подвижная фаза—смесь реоплекса 400 с 2%-ным раствором фосфорной кислоты. Температура термостата — 80. Идентификацию ЛЖК проводили по времени удерживания: пики метиловых эфнров ЛЖК располагаются в порядке возрастания молекулярного веса.
Определение спиртов в культуральной жидкости протео-литических клостридий проводили газохроматографически на ҐЖХ ЛХМ 8 МД с пламенно-ионизационным детектором на двухметровой стальной колонке (Новгородова и др., 1978). Твердый носитель — целлит 545: Жидкая неподвижная фа-за-рр'-оксидипропноннитрил (10%). Газ*носитель— азот, скорость его 30 мл/мин. Температура хроматографии — 20С. Идентификацию спиртов проводили по времени выхода стан* дартных алкилнитритов, которые готовили в аналогичных условиях, используя водные 0,1%-ные растворы спиртов.
При исследовании реакции Стикленда у протеолитических Clostridium определяли следующие метаболиты: аммиак — колориметрически-с реактивом Несслера и летучие жирные кислоты.
При изучении температурных характеристик рост культур фиксировали по оптической плотности, измеренной на спектрофотометре фирмы «Gilford» (СШЛ) при длине волны 570 им.
Для изучения роли протеолитических Clostridium в превращении белковых веществ в почве нами были проведены модельные опыты. Трансформация указанных соединений изучалась в дерново-подзолистой почве, черноземе и светло-каштановой почве. Схема опытов предусматривала варианты с инокулировзнием стерильной почвы чистыми культурами протеолитических Clostridium и с внесением различных бе-локсодержащих субстратов (казеина, альбумина животного происхождения, зеленой массы клевера, навоза). В качестве дополнительного источника органического вещества в некоторых вариантзх вносили глюкозу. О разложении в почве белковых веществ судили по выделению N—ЫгЦ азота. Кроме того, проводили количественный учет- протеолитических Clostridium, определяли содержание свободных амнно-
кислот; летучих жирных кислот; измеряли рН. почвенной суспензии. Количественный учет проводили методом предельных разведений с предварительной обработкой почвы по Д. Г. Звягинцеву (1969) на модифицированной нами среде TGTSM-тринти казеин-глюкоза-тирозин-сульфит среде (Вее-
rens, Garcia, 1970).
Фракцию N—NH< азота определяли колориметрически с реактивом Несслера в вытяжке, полученной при обработке почвы 2%-ііьім раствором КС1 (Лринушкина, 1970).
Изучение состава свободных аминокислот в почве проводили после их экстракции 20%-ным этанолом и водой (Gilbert, Altman, 1966) методом бумажной хроматографии.
Определение рН проводили потенциометрнческн в почвенной суспензии, приготовленной при отношении почвы к воде 1 :2.5Ч
В ряде случаев при составлении калибровочных графиков данные обрабатывали на ЭВМ «Textronic» фирмы «Gilford». (США).