Введение к работе
Актуальность проблемы. Мелиоидоз - особо опасная инфекция людей и животных, регистрируемая в эндемичных регионах Юго-Восточной Азии и Австралии (Smith M.D.et al., 1995, Dance D.A., 2000, Puthucheatry S.D., Vadivelu J., 2002).
Возбудитель заболевания Burkholderia pseudomallei выделяют из внешней среды регионов, расположенных в зоне 20 севернее и южнее экватора (Sexton М.М. et al., 1993, Brook M.D. et al., 1997, Trakulsomboon S. et al., 1999). Инфицирование происходит при попадании микроорганизма в раны или повреждения кожи, а также при вдыхании контаминированной им пыли (Leelarasamee A., Bovornkitti S., 1989; Hirst H.G.et al., 1992; Leakey A.K. et al., 1998).
Частота возникновения заболеваний мелиоидозом существенно выше в Юго-Восточной Азии и северных провинциях Австралии по сравнению с другими регионами приэкваториальной зоны (Chaowagul W. et al., 1989; Leelarasamee A., Bovornkitti S., 1989; Dance D.A., 1991, Currie B.J. et al., 1993, Coenye Т., LiPuma J.J., 2003). Наиболее высокий уровень заболеваемости отмечен в ряде районов Таиланда, где В pseudomallei является причиной 20 % септицемии и приблизительно 40-70 % летальных исходов вследствие бактериального сепсиса (Chaowagul W. et al., 1989, Dance D.A., 1991; Puthucheatry S.D., Vadivelu ]., 2002).
Группами риска приобретения мелиоидоза считают лиц, временно находившихся в эндемичных регионах (туристов, бизнесменов, представителей воинских контингентов) (Dance D.A., 1990, Yabuuchi Е., Arakawa М., 1993).
Вопросы защиты населения от инфицирования В pseudomallei приобретают все большую актуальность не только в зонах ее эндемичного распространения, но и в странах, где наличие этой инфекции ранее не отмечали. Это связано с возросшим уровнем миграции населения, интенсификацией туристических и деловых поездок, повышающих вероятность завоза инфекции в различные страны, в том числе в Россию, из зон ее распространения.
Наибольшую опасность появления массовых заболеваний людей связывают с угрозой возникновения чрезвычайных ситуаций, обусловленных применением потенциальных биологических агентов, в число которых входит и возбудитель мелиоидоза [Руководство ВОЗ, 2001, Coenye Т., LiPuma J.J., 2003].
В pseudomallei вызывает целый спектр многообразных клинических форм заболевания, трудно поддающихся лечению, характеризующихся высокими показателями рецидивирования, несмотря на длительное лечение, и высоким уровнем летальности (Smith M.D. et al., 1987, Leelarasamee A., Bovorukitti S., 1989, White N.J. et al., 1989, Punyagupta S., 1989, Chaowagul W. et al., 1993, Yabuuchi E., Arakawa M., 1993, Ip M.L.et al., 1995, Sirisinha S.et al., 2000, Currie B.J. et al., 2002, Puthucheatry S.D., Vadivelu J., 2000, 2002, Samuel M., Ті T.Y. 2002).
Средства специфической профилактики мелиоидоза отсутствуют (Brett P. J., Woods D. Е., 2000). Поиск альтернативных средств профилактики и лечения мелиоидоза ведется постоянно. Предметом обсуждения специалистов все чаще становятся вопросы использования иммуноглобулиновых препаратов для пассивной защиты от инфицирования В. pseudomallei (Bryan L.E. et al., 1994, Brett P.J. et al., 1994, Brett P.J.,Woods D.E., 1996).
Сведения о протективном потенциале мелиоидозных антител ограничены, а их роль в защите от В. pseudomallei до конца не определена (Charuchai-montri С. et al., 1992, Pethanjanapong V. et al., 1992, Chenthamazakshan V. et al., 2001). Практически важной представляется проблема использования для создания пассивного иммунитета высокоактивных моноклональных антител (МКА) заданной специфичности (Новицкая И.В. с соавт., 1989, 1994, 1995, Тихонов Н.Г. с соавт., 1991, Brett P.J., 1997, Steinmetz I. et al., 2002, Jones S. et al., 2002, Bottex С et al., 2005).
Принимая во внимание важность проблемы защиты населения от мелиоидоза, в том числе вопросов серопрофилактики и серотерапии этой инфекции, было определено направление исследований по изучению роли антител в защите макроорганизма от В. pseudomallei в эксперименте.
Цель работы - изучение протективного потенциала поли- и моноклональных иммуноглобулинов против антигенов Burkholderia pseudomallei, экспонированных на поверхности бактерий.
Задачи исследования:
тиражирование in vitro и in vivo гибридом-продуцентов МКА к антигенам В pseudomallei, накопление препаративных количеств МКА, их характеристика;
получение высокоактивных поликлональных кроличьих антител к антигенам В. pseudomallei и определение спектра их специфической активности;
оценка бактериостатических свойств мелиоидозных поли- и моноклональных антител различной эпитопной направленности и разработка теста задержки роста В pseudomallei, предварительно опсонизированных антителами, на плотной питательной среде;
оптимизация условий постановки опсоно-фагоцитарной реакции на этапах оценки протективного потенциала МКА различной эпитопной направленности, изучение влияния опсонизации В. pseudomallei на антифагоцитарную активность микробных клеток возбудителя мелиоидоза;
изучение протективных свойств мелиоидозных МКА in vivo.
Научная новизна
Получены новые данные о роли гуморальных антител в защите макроорганизма от возбудителя мелиоидоза. Проведено комплексное исследование протективных свойств поликлональных и моноклональных иммуноглобулинов, взаимодействующих с антигенами, локализованными на поверхности В. pseudomallei, изучено влияние антител различной эпитопной направленности на процесс иммунного фагоцитоза, представлены доказательства эффективности пассивной защиты мышей от экспериментального мелиоидоза.
Впервые определены оптимизированные условия оценки бактериостати-ческого потенциала мелиоидозных антител в тесте задержки роста бактерий на плотной питательной среде. Показано, что предварительная опсонизация В psendomallei антителами приводит к нарушению функций роста и размножения микроорганизмов.
Оптимизированы условия постановки опсоно-фагоцитарной реакции с применением широкого набора МКА различной эпитопной направленности, позволяющей исследовать один из механизмов иммунного фагоцитоза при экспериментальном мелиоидозе. Установлено, что предварительная опсонизация В. psendomallei моноклональными антителами снижает антифагоцитарную активность бактерий, приводя к увеличению числа поглощенных клеток по сравнению с контролем, повышает активность фагоцитов мыши. Проведен сравнительный анализ различных типов МКА в блокировании эпитопов, экспонированных на поверхности микробных клеток В. pseudomallei, выявлены те варианты МКА, использование которых в данной реакции, обеспечивает эффективность процесса поглощения тест-объектов фагоцитами мыши в первые три часа после заражения.
Показано, что превентивное введение моноклональных иммуноглобулинов различной эпитопной направленности оказывает существенное влияние на течение экспериментального мелиоидоза. Эффективность превентивного введения in vivo моноклональных иммуноглобулинов в режиме экстренной профилактики зависит от особенностей штамма В. pseudomallei и от величины инфицирующей дозы. Установлено, что ряд МКА, взаимодействующих с эпи-топами Аг 8, Аг 6 и эпитопами, экспонированными как на Аг 8, так и Аг 6, достоверно увеличивают сроки средней продолжительности жизни экспериментальных животных и повышают показатели выживаемости особей до 50 -100 %.
Практическая ценность
Полученные данные представляют интерес для сотрудников специализированных лабораторий, занимающихся вопросами иммунопрофилактики особо опасных инфекционных заболеваний, и могут быть использованы в научно-исследовательской работе при разработке профилактических средств защиты от В. pseudomallei.
Тест задержки роста бактерий, предварительно опсонизированных антителами, адаптирован к работе с возбудителем мелиоидоза. Условия проведения исследования, направленного на оценку бактериостатического потенциала МКА различной эпитопной направленности, отражены в «Методических рекомендациях по оценке бактериостатических свойств мелиоидозных моноклональных антител in vitro» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 27.12.2000 г., протокол № 14 и утверждены директором института). Предлагаемый способ рекомендован в качестве дополнительного метода исследования, позволяющего достаточно просто произвести отбор различных типов МКА, взаимодействующих с эпитопами, экспонированными на поверхности микробных клеток В. pseudomallei, блокирование которых иммуногло-
булинами в присутствии или отсутствии комплемента приводит к нарушению функций роста и размножения В pseudomallei in vitro. Получаемые сведения о бактериостатическом потенциале МКА узкой специфичности облегчают целенаправленный отбор средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.
Оптимизированные условия постановки опсоно-фагоцитарной реакции, обобщенные в «Методических рекомендациях по применению опсоно-фагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала МКА различной эпитопной направленности» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 23.06.2004, протокол № 6 и утверждены директором института), позволяют исследовать один из механизмов иммунного фагоцитоза при экспериментальном мелиоидозе. Данный способ пригоден для анализа уровня функциональной активности фагоцитов хозяина в отношении В. pseudomallei, предварительно инкубированных с антителами.
Практически значимыми являются характеристики индивидуальных образцов моноклональных антител, применявшихся в работе, в части их бакте-риостатического потенциала, эффективной опсонизации В pseudomallei, снижающей антифагоцитарную активность бактерий, и способности защищать от патогена при введении их мышам в режиме экстренной профилактики. Апробированные схемы пассивной иммунизации животных могут быть востребованы профильными специалистами при разработке средств защиты от возбудителя мелиоидоза.
Материалы диссертационной работы включены в цикл лекций по диагностике, лечению и профилактике особо опасных инфекций на курсах подготовки специалистов: «Курсы первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям» при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Основные положения, выносимые на защиту
Опсонизация микробных клеток В. pseudomallei антителами нарушает их функции роста и размножения. Критерием эффективности опсонизации В. pseudomallei антителами in vitro служит относительный показатель подавления роста бактерий на плотной питательной среде.
Дополнительным способом отбора образцов иммуноглобулинов, рассматриваемых в качестве средств пассивной защиты от экспериментальной инфекции, является определение показателей бактериостатической активности антител в тесте задержки роста В pseudomallei, опсонизированных антителами, на плотной питательной среде.
Опсоно-фагоцитарная реакция, адаптированная к работе с В pseudomallei, позволяет оценивать функциональную активность фагоцитов мыши в отношении возбудителя мелиоидоза, предварительно опсонизированного антителами in vitro.
Применение МКА различной эпитопной направленности в режиме экстренной профилактики инфекции изменяет течение экспериментального
мелиоидоза, увеличивая сроки средней продолжительности жизни животных и процент выживших особей в опытных группах по сравнению с контролем. Эффективность превентивного введения МКА in vivo зависит от их протек-тивного потенциала, особенностей штамма В pseudomallei и инфицирующей дозы патогена.
Объем и структура диссертации