Введение к работе
Актуальность темы. Особое место в повышении урожайности сельскохозяй-:твенных культур принадлежит выяснению взаимоотношений между микроорганизмами почвы и растениями, направленному управлению ими.
Адгезия микроорганизмов представляется важным этапом в жизнедеятельности иикроорганизмов. Она экологически оправдана - адгезия помогает микробам удержаться в почвенном профиле и не подвергаться вымыванию в нижележащие горизонты, адгезированные клетки оказываются на границе раздела твердого тела и кидкости, где сосредоточены основные питательные вещества.
Доказана роль адгезии и прикрепления для симбиотических и паразитических ззаимоотношений. Внимание к вопросу об адгезии микроорганизмов было при-злечено и в связи с тем, что стало ясно, что адгезия является одним из начальных этапов многих инфекционных болезней, и если предотвратить адгезию, то можно предотвратить и возникновение заболевания. Наиболее изученной является адгезия оизобий на корневых волосках бобовых растений и патогенных агробактерий к по-зерхности двудольных растений, отчасти изучена адгезия у азоспирилл и фитопато-"енных микроорганизмов.
Механизм прикрепления агробактерий к поверхности клеток однодольных эастений, в частности злаков, мало изучен. Долгое время существовала точка зрения, что агробактерий не способны к успешному взаимодействию с поверхностью эднодольных растений, поскольку на их поверхности отсутствуют соответствующие эецепторы. Однако в литературе описаны случаи прикрепления агробактерий к поверхности однодольного растения. Ряд авторов полагают, что агробактерий спо-:обны прикрепляться к клеткам однодольного растения, хотя и в ограниченном ко-пичестве (Draper, et а!., 1983. Graves et а!., 1988) .
В настоящее время опубликовано много данных, касающихся проблем взаимо-этношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. Однако, до сих пор зстаются невыясненными механизмы таких взаимоотношений, представляющие эольшой интерес, как в теоретическом, так и в прикладном аспектах.
Ощущается необходимость расширения круга объектов для изучения ассоциативного взаимодействия. Изучая свойства штамма Agrobacterium radiobacter 5D-1, выделенного из корней пшеницы М.И.Чумаковым (ИБФРМ, РАН), нами установлено положительное влияние штамма на содержание азота и веса надземной части ішеницьі. Обнаружена высокая активность продукции фитогормона ИУК, способность к продукции цитокининов. Мы пришли к выводу, что штамм A radiobacter 5D-1 является удобной моделью для изучения процесса ассоциативного взаимодействия.
Настоящая работа посвящена исследованию процесса прикрепления Agrobacterium radiobacter 5D-1 на корнях однодольных растений.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось
изучение условий и молекулярных механизмов взаимодействия клеток
^.radiobacter 5D-1 с корневой поверхностью злаков. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Отработать метод определения количества прикрепившихся бактерий к корням эднодольных растений. Определить оптимальные условия прикрепления агробакте-эий к поверхности растительных клеток.
I. Определить способность непатогенных агробактерий прикрепляться к корням эднодольных растений и сравнить временную динамику прикрепления непатогенных ігробактерий к корням однодольных растений с динамикой прикрепления патогенных агробактерий к поверхности двудольных растений.
. Изучить колонизацию поверхности различных сортов пшеницы и риса агробакте-иями.
-
Определить способность Aradiobacter 5D-1 конкурировать за места прикрепления с патогенами и ингибировать опухолеобразование.
-
Оценить роль липополисахаридов и поверхностных белков непатогенных агробак-терий в процессе прикрепления их к поверхности растительной ткани.
-
Изучить участие жгутиков и целлюлозных фибрилл в процессе прикрепления Aradiobacter 5D-1 к корням пшеницы.
-
Исследовать прикрепление к корням пшеницы транспозонных мутантов, дефектных по подвижности и продукции поверхностных полисахаридов.
Научная новизна работы. Впервые на пшенице показано сходство и различие молекулярных механизмов прикрепления патогенных и непатогенных агро-бактерий к поверхности однодольных растений.
Установлено, что временная динамика прикрепления непатогенных агробактерий к корням однодольных растений носит сходный характер с динамикой прикрепления патогенных агробактерий к поверхности клеток двудольного растения.
Установлено, что агробактерий прикрепляются с одинаковой активностью к различным сортам пшеницы и риса.
Впервые документально установлено, что непатогенные агробактерий способны прикрепляться к корням однодольных растений с образованием специальных структур, аналогичных структурам, которые образуются при взаимодействии ризобий с бобовыми и патогенных агробактерий с двудольными растениями.
Показано, что в прикреплении непатогенных агробактерий к корням пшеницы принимают участие бактериальные и растительные белки.
Впервые показано участие жгутиков агробактерий в прикреплении к корням пшеницы.
Экспериментально доказано, что в состав фибриллоподобных структур у непатогенных агробактерий входят вещества полисахаридной природы.
Практическая значимость. Изучение взаимоотношений растений и микроорганизмов представляет интерес в теоретическом и в практическом аспектах, поскольку выяснение механизма взаимодействия растений и микроорганизмов дает ключ к увеличению урожая, за счет повышения эффективности минерального питания и уменьшения потерь от болезней, вызванных фитопатогенами. В часности, доказана возможность предотвращения опухолей на томатах и подсолнечнике, вызванных патогенными агробактериями.
Изучение ранних этапов адсорбции и прикрепления агробактерий к поверхности корня растений позволяет' лучше понять механизм колонизации корней растений и последующую инфекцию.
Полученные результаты позволяют распространять подходы по трансформации, отработанные на двудольных, на однодольные растения.
Разработанный метод определения количества прикрепившихся бактерий использовался в НИР лаборатории физиологии растений НИИСХ Юго-Востока; при проведении полевых экспериментов в Поволжском научно-исследовательском институте животноводства и биотехнологии (программа по получению экологически чистой продукции) и при проведении НИР в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН по теме "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" (N гос. регистрации 01890017743).
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Разработка метода определения количества прикрепившихся бактерий к корням однодольных растений.
-
Определение способности непатогенных агробактерий прикрепляться к корням однодольных растений и ингибировать опухолеобразование у двудольных растений.
-
Определение роли бактериальных полисахаридов, липополисахаридов и по-іерхностньїх белков в процессе прикрепления непатогенных агробактерий к по-іерхности корней злаков.
-
Установление участия бактериальных жгутиков и фибрилл в процессе при-срепления Aradiobacter 5D-1 к корням пшеницы.
-
Изучение сортовой вариабельности при колонизации корней пшеницы и риса уробактериями.
Работа выполнена в группе почвенной микробиологии и биологического азо-а лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в соответствии с планом НИР по теме: "Выделение новых форм бактерий, ассоциированных со злаками и ізучение генетических основ их взаимодействия со злаками".
Данное исследование поддержано частично Российским фондом Фундаменталь-<ых исследований (грант 94-04-13373, 96-04-50697) и Российским Министерством <ауки и технической политики (грант "Ассоциативные бактерии").
Апробация работы. Основные результаты и положения работы были пред-:тавлены на: Всесоюзной научной конференции "Микробиология в сельском хо-іяйствє" (Пущино, Россия, 1992); VIII Восточно-европейском симпозиуме по биоло-ической азотфиксации "Nitrogenfix-92" (Саратов, Россия, 1992); VI Международном :импозиуме по Биологической азотфиксации у небобовых (Исмаилия, Египет, 1993); Іервом Международном конгрессе по полисахаридной инженерии (Трондхейм, Норвегия, 1994); Первой Европейской конференции по азотфиксации (Сегед, Зенгрия, 1994); Рабочем совещании "Азоспирияла V и близкородственные микроор-анизмы" НАТО (Шарвар, Венгрия, 1994); 9 Баховском коллоквиуме по азотфикса-<ии (Москва, Россия, 1995); X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Тетербург, Россия, 1995); Международном Рабочем совещании по ассоциативному ізаимодействию азотфиксирующих бактерий с растениями (Саратов, Россия, 1995); Международной конференции, посвященной памяти ак. Баєва А.А. (Москва, Россия, І996); VIII Международном конгрессе по молекулярному взаимодействию растений і микроорганизмов (Ноксивил, США, 1996); Второй Европейской конференции по ізотфиксации (Познань, Польша, 1996); VII Международном симпозиуме по азот-риксации небобовых (Фейсалабад, Пакистан, 1996) и на отчетных конференциях 1БФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ в отечественной и іарубежной печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, жлючающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования, из-тожения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 96 страницах, иллю-:трированна 12 рисунками и содержит 17 таблиц. Список использованных литера-урных источников включает 96 наименований, в том числе 80 зарубежных.