Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 34
1.1. Мембранные технологии для санитарного контроля воды 35
1.1.1. Использование мембранной фильтрации для контроля качества источников водоснабжения при микробиологических исследованиях санитарного надзора, и определяемые показатели 35
1.1.2. Классификация фильтрующих мембран. Фильтрующие мембраны, изготовленные на различной сырьевой и технологической основе 40
1.2. Метод мембранной фильтрации воды 42
1.2.1. Мембранные фильтры для пробоподготовки и методов обнаружения бактерий в воде 42
1.2.2. Фильтрующие материалы для пробоподготовки воды микрофильтрацией и ультрафильтрацией к детекции вирусов .47
1.3. Характеристика и детекция модельных микроорганизмов 51
1.3.1. Свойства кишечной палочки .51
1.3.2. Характеристика ротавирусов .54
Результаты собственных исследований
Глава 2. Изучение эффективности и оценка параметров различных мембран, определяющих возможность их использования для санитарно бактериологических и санитарно-вирусологических исследований водных объектов 57
2.1. Определение фильтрующих материалов, синтезированных из различных материалов, с разным диаметром пор, обладающих наибольшей эффективностью при извлечении E. coli из воды 57
2.1.1. Изучение эффективности сорбции модельного микроорганизма E. coli M17-02 из воды фильтрующими материалами 57
2.1.2. Определение фильтрующих материалов, синтезированных из различных материалов, с разным диаметром пор, обладающих наибольшей эффективностью при извлечении E. coli из воды 62
2.2. Изучение эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды с использованием различных пористых микрофильтрационных материалов, режимов фильтрации и методов детекции 67
2.2.1. Параметры фильтрующих материалов, определяющие возможность их использования для санитарно-вирусологических исследований 68
2.2.2. Изучение сорбции и элюции ротавирусов из воды различными микрофильтрационными материалами 69
Глава 3. Применение мембран при проведении санитарно-бактериологических и санитарно-вирусологических исследований водных объектов 75
3.1. Апробация фильтрующих материалов для обнаружения кишечных микроорганизмов бактериальной и вирусной природы в водных объектах окружающей среды 75
3.2. Характеристика санитарно-бактериологических и санитарно вирусологических показателей качества воды акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива 76
Глава 4. Разработка макета комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных бактерий и вирусов в водных объектах 89
Заключение 95
Выводы 106
Практические рекомендации 108
Перспективы дальнейшей разработки темы .109
Список сокращений 110
Благодарности .112
Список литературы 113
Приложения 133
- Использование мембранной фильтрации для контроля качества источников водоснабжения при микробиологических исследованиях санитарного надзора, и определяемые показатели
- Изучение эффективности сорбции модельного микроорганизма E. coli M17-02 из воды фильтрующими материалами
- Характеристика санитарно-бактериологических и санитарно вирусологических показателей качества воды акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива
- Разработка макета комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных бактерий и вирусов в водных объектах
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Решение проблемы обеспечения населения безопасной в эпидемическом
отношении доброкачественной водой является одной из важных задач в системе
санитарно-эпидемиологического надзора. Актуальность темы исследования
связана с нарастающим влиянием антропогенных факторов контаминации водных
объектов окружающей среды возбудителями кишечных инфекций
(Онищенко Г.Г., 2005; Онищенко Г.Г. и соавт. 2007, 2014; Рахманин Ю.А. и соавт., 2006, 2016; Кафтырева Л.А. и соавт., 2012; Попова А.Ю., 2014; Малышев В.В. и соавт., 2003, 2015, 2017).
Около 80% всех острых кишечных инфекций у взрослых и детей в мире
обусловлено контактом с инфицированной микроорганизмами водой или
нарушением санитарно-гигиенических норм при е использовании
(Покровский В.И. и соавт., 1999; Тихомирова О.В. и соавт., 2003; Железова Л.И. и соавт., 2015; Мурзабаева Р.Т. и соавт., 2015; Гречанинова Т.А. и соавт., 2016).
Основными мероприятиями, направленными на снижение риска водного пути передачи кишечных патогенов, являются своевременные профилактические мероприятия, основанные на оценке качества воды по микробиологическим критериям (Рахманин Ю.А. и соавт., 2001; Alonso E. et al., 2001; Недачин А.Е. и соавт., 2005; Сбойчаков В.Б., 2007).
В практику санитарной микробиологии вс шире внедряются технологии мембранной фильтрации для решения задач, которые трудно или экономически нецелесообразно решать другими методами. Основное применение фильтрующих мембран в санитарной микробиологии воды — это концентрирование микроорганизмов на их поверхности (Барсов К.К., 1932; Kittigul L. et al., 2001; Малышев В.В. и соавт., 2016; Рахманин Ю.А. и соавт., 2016).
Проблема обеспечения качественной питьевой водой крайне важна для Вооружнных сил Российской Федерации, других силовых структур. Необходимость проведения лабораторного контроля качества воды в отрыве от базовых лабораторий в эпидемических очагах, при чрезвычайных ситуациях (катастрофы, наводнения, землетрясения, пожары), локальных вооруженных конфликтах, террористических актах и других ситуациях стоит в основе разработки и применения доступных, специфических, простых, надежных методов пробоподготовки и детекции кишечных бактерий и вирусов (Бокарев М.А., 2007; Малышев В.В., 2003; 2016).
Совершенствование методов санитарно-микробиологических исследований воды, за счет использования фильтрующих материалов, эффективных по извлекаемости микроорганизмов из воды, и современных методов их детекции, повысит оценку качества воды по микробиологическим критериям, будет способствовать снижению рисков водного пути передачи кишечных патогенов и минимизации заболеваемости населения острыми кишечными инфекциями.
Степень разработанности темы исследования
Необходимость комплексного лабораторного обследования водных
объектов с определением бактериологических и вирусологических показателей
связана с эпидемиологическими рисками водного пути передачи кишечных
патогенов и установлением их этиологической структуры. Метод мембранной
фильтрации для санитарно-микробиологического исследования воды
используется и в России, и во многих странах мира. Этот метод рекомендован ВОЗ (WHO, 2004), методическими документами Роспотребнадзора РФ в качестве основного метода пробоподготовки воды (МУ 4.2.1018-01, МУК 4.2.1884-04). Постоянно развивающаяся техника мембранно-сорбционной фильтрации и синтез новых модифицированных мембран позволяют считать этот метод наиболее перспективным. При этом основой в выборе фильтрующих материалов служит такой параметр, как эффективность извлекаемости микроорганизмов из воды.
Появление новых мембран из разных синтетических материалов требуют дополнительного микробиологического изучения (Недачин А.Е. с соавт., 2005). Отсутствие достоверной информации об их эффективности приводит к расхождению между результатами санитарно-микробиологических исследований качества воды и реальной контаминацией воды бактериями и вирусами, что может быть причиной искажения эпидемиологического значения воды при анализе причин и условий возникновения заболеваний кишечными инфекциями.
Повышение требований к лабораторному контролю качества воды в стационарных и полевых условиях, при чрезвычайных ситуациях, отсутствие новых практических и теоретических исследований о пробоподготовке воды методом мембранной фильтрации, недостаток информации о материалах фильтрующих мембран и факторах, влияющих на результаты извлечения бактерий и концентрирования вирусов из воды, а также их детекции, с учетом значительной актуальности острых кишечных инфекций с водным путем передачи патогенов, явились основой настоящего исследования.
Цель исследования — определить микробиологическую значимость пробоподготовки воды фильтрующими материалами при проведении санитарно-микробиологического контроля водных объектов с использованием современных методов детекции.
Задачи исследования:
1. Оценить эффективность извлекаемости Escherihia coli из воды
различными микрофильтрационными мембранами, методами вакуумной и
напорной фильтрации.
-
Исследовать результативность концентрирования ротавирусов в режимах вакуумной и напорной фильтрации в воде с использованием разных микрофильтрационных мембран, в том числе капроновых мембран с положительным зарядом.
-
На основании использования различных методов обнаружения маркеров ротавирусов (антигенов и рибонуклеиновой кислоты) в элюатах воды оценить эффективность реакции агглютинации латекса и метода иммунохроматографического анализа в детекции вирусной контаминации воды.
4. Изучить эффективность применения фильтрационных мембран для
пробоподготовки и обнаружения санитарно-показательных и патогенных
микроорганизмов в водных объектах окружающей среды в натурных
исследованиях.
5. Разработать макет комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных
микроорганизмов в воде в полевых условиях и оценить его работу.
Научная новизна
Впервые в экспериментальных условиях на основе изучения извлекаемости E. coli из воды современными фильтрующими материалами со средним диаметром пор 0,45 мкм и 0,2 мкм показана различная эффективность мембран из ацетата целлюлозы, нитрата целлюлозы, смеси сложных эфиров целлюлозы, полиамида при вакуумной и напорной фильтрации. Приведены данные о меньшей эффективности удержания E. coli фильтрующими мембранами из ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы со средним диаметром пор 0,2 мкм, в сравнении с теми же мембранами со средним диаметром пор 0,45 мкм. Установлено влияние микрофильтрационных полиамидных мембран на процессы изменчивости E. coli в виде R-модификации колоний на среде Эндо и уменьшения ферментативной активности.
Впервые научно обоснована наибольшая эффективность концентрирования
ротавирусов вакуумной фильтрацией из воды, в сравнении с напорной
фильтрацией, что было подтверждено микробиологическими методами
(полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ,
иммунохроматографический анализ, реакция агглютинации латекса).
Разработан макет переносного малогабаритного комплекта для
пробоподготовки и детекции кишечных микроорганизмов в воде, который
включает установку для проведения микробиологического анализа водных сред и
установку для концентрирования ротавирусов и бактериофагов из природных
водных источников (получено уведомление о положительном результате
формальной экспертизы заявки на изобретение, регистрационный № 2017108402
от 14.03.2017 г. и решение о выдаче патента на полезную модель,
регистрационный № 2017108400 от 14.03.2017 г.). Разработанный макет
комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных микроорганизмов в воде
позволяет проводить санитарно-бактериологический и санитарно-
вирусологический контроль водных объектов на месте отбора проб, что сокращает время получения предварительного результата по определению Е. coli до 12 часов и детекции ротавирусов до 2,5-3 часов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Новые данные об эффективности фильтрующих материалов в отношении извлекаемости E. coli и концентрирования ротавирусов из воды позволяют повысить эффективность использования мембранных технологий в санитарно-микробиологических исследованиях воды. Полученные результаты различной эффективности фильтрующих материалов при напорной и вакуумной фильтрации для пробоподготовки санитарно-микробиологических исследований воды обосновывают необходимость использования фильтрующих материалов с применением вакуумной фильтрации.
Новые сведения о влиянии микрофильтрационных полиамидных фильтров с размером пор 0,2 мкм, при извлечении E. coli из воды, на процессы изменчивости E. coli имеют эпидемиологическое значение, так как изменение ее типичных свойств искажает результаты оценки реальной микробной загрязненности воды.
Использование инновационных экспериментальных микрофильтрационных мембран из капрона с положительным зарядом (Капрон+, 0,2 мкм) для концентрирования ротавирусов из воды в режиме вакуумной фильтрации позволило получить их концентрацию большую, чем при использовании известных в практике фильтрующих мембран из полиамида на порядок; в результате проведена эффективная детекция в элюатах ротавирусных маркеров (антигены) экспресс-тестами (метод иммунохроматографического анализа и реакция агглютинации латекса).
Полученные результаты экспериментальных исследований эффективности микрофильтрационных материалов для концентрирования ротавирусов из воды свидетельствуют о возможности применения простых и относительно недорогих методов детекции (иммунохроматографический анализ, реакция агглютинации латекса) при проведении санитарно-вирусологических исследований воды.
Применение разработанного макета комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных микроорганизмов в воде дает возможность проводить оценку безопасности водопользования населения, военнослужащих Вооружнных сил Российской Федерации, других силовых структур с достаточной эффективностью и низкими экономическими затратами в полевых условиях, в различных экстремальных ситуациях, в разных климатогеографических зонах, и осуществлять мониторинг водных объектов окружающей среды с необходимой кратностью исследований.
Материалы исследования реализованы в следующих формах:
- подготовлено учебное пособие «Использование мембранных технологий в
санитарной микробиологии» (в соответствии с Планом редакционно-издательской
деятельности Главного Военно-медицинского управления Минобороны России на
2016 год от 31.12.2015 г.);
- подготовлен раздел проекта методических рекомендаций для
Вооруженных сил РФ по инновационной пробоподготовке возбудителей острых
кишечных инфекций в водных объектах окружающей среды с помощью
фильтрационных мембранных технологий и методов детекции.
Основные положения диссертационной работы внедрены в учебный
процесс на кафедрах: микробиологии; общей и военной эпидемиологии; общей и
военной гигиены (с курсом военно-морской и радиационной гигиены)
федерального государственного бюджетного военного образовательного
учреждения высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (акт внедрения № 194 от 14.07.2017 г.). Предложенные методики по экспресс-детекции маркеров (антигены) возбудителей острых кишечных вирусных инфекций и подсчету E. coli в пробах воды внедрены в повседневную работу ФГКУ «985 ЦГСЭН» Минобороны России (акт внедрения № 3 от 22.02.2017 г.), в практику работы Центра исследования воды МУП города Череповца «Водоканал» (акт внедрения № 1 от
17.02.2017 г.) и Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра
экологической безопасности Российской академии наук (акт внедрения № 1 от 20.03.2017 г.).
Методология и методы исследования
Методология настоящего исследования определена проблемами,
связанными с необходимостью усовершенствования приемов и методов санитарно-микробиологического контроля воды различных водных объектов. Диссертационное исследование выполнено в соответствии с паспортом научной специальности 03.02.03 – микробиология, области исследований: п.п. 2, 3, 10.
Предметом изучения были пористые микрофильтрационные материалы в виде дисков из различных синтетических полимеров. Анализ научной литературы, посвящнной оценке извлекающих свойств мембран, используемых для извлечения Е. coli и концентрирования ротавирусов из воды, проведн на основе формально-логических методов исследования. В работе использованы бактериологические, молекулярно-генетические, электронно-микроскопические, иммунологические и статистические методы исследования.
Объем проведенных исследований
Проведены следующие экспериментальные исследования: определение эффективности извлечения фильтрующими материалами (ФМ) E. coli из воды — 1830, определение эффективности концентрирования ротавирусов — 4840. Изучена эффективность применения мембран в натурных исследованиях, с использованием ФМ исследовано 282 пробы воды на определение санитарно-бактериологических и санитарно-вирусологических показателей качества воды. А также проведен ретроспективный анализ лабораторных данных, полученных из гидролого-гидрохимических и санитарно-бактериологических станций акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива за период 2006–2014 гг. — 2304 пробы воды (Таблицы 1 и 2).
Таблица 1 — Направления, объем, объекты и методы бактериологических исследований
Таблица 2 исследований
и
методы вирусологических
Направления, объем, объекты
Штаммы микроорганизмов
При проведении экспериментальных исследований по изучению
эффективности извлечения бактерий на ФМ, выполненных на различной сырьевой и технологической основе, в качестве бактериальной модели использовали штамм E. coli М17-02 (номер штамма в «ГКПМ - Оболенск» В-2929, ФБУН ГНЦ ПМБ). Штамм E. coli М17-02 рекомендован для контроля эффективности ФМ методическими указаниями МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды».
Исследования по изучению эффективности концентрирования вирусов на фильтрующих мембранах проводили на модели ротавирусов человека HRV/SPb/884/10/05 из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава РФ. Вирусы были выделены на культуре МА104 и прошли 5 пассажей.
Фильтрующие мембраны предоставлены ЗАО «Владисарт» (Россия) (Таблицы 3 и 4).
Таблица 3 – Типы и характеристики фильтрующих мембран для извлечения Е.cоl i М17-02
Таблица 4 – Типы и характеристики фильтрующих мембран для
концентрирования ротавирусов из воды
Изучали эффективность пористых микрофильтрационных мембран в виде дисков диаметром 35 мм в отношении извлечения из воды Е. coli, а также диаметром 142 мм в отношении концентрирования ротавирусов.
Методы исследования
В работе использовали методики: извлечение бактерий из воды
бактериологическим посевом методом мембранной фильтрации;
концентрирование вирусов напорной и вакуумной мембранной фильтрацией проб воды с последующим определением вирусных маркеров. Фильтрацию жидкостей проводили на специальных фильтрационных установках, состоящих из разного типа устройств, напорного или вакуумного насосов, и оснасток для мембран. В пробоподготовке воды на бактериологические показатели использовали приборы для фильтрации ПВФ-35 (ЗАО «Владисарт», Россия), ПВФ 35/4Б (ООО НПП «БМТ», Россия). С целью концентрирования вирусов использовали установку, которая включала фильтродержатель АСФ-011 для плоских фильтров диаметром 142 мм (ЗАО «Владисарт», Россия).
Бактериологические исследования проводили при оценке эффективности фильтрующих мембран в отношении извлечения бактерий. Эффективность извлекаемости E.coli из воды мембранными фильтрами определяли путем сравнения числа колоний микроорганизмов, выросших на стандартной питательной среде (агар Эндо, ООО «НИЦФ», г. Санкт-Петербург, ТУ 9385-053-39484474-2012) в результате прямого поверхностного посева суспензии культуры E. coli М 17-02, и числа колоний, выросших на этой же среде в результате бактериологического посева способом мембранной фильтрации, при соблюдении требований методических указаний МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» и ГОСТ 31955.1-2013 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет E. coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации».
Эффективность концентрирования ротавирусов мембранными фильтрами, изучали путем исследования полученных фильтратов и элюатов, после фильтрации через мембраны модельных водоемов, на наличие их маркеров — антигенов (Рота-Аг) и рибонуклеиновой кислоты (РНК) ротавирусов. Определяли эффективность сорбции по наличию маркеров вирусов в исходной взвеси, и их
присутствию или отсутствию в фильтрате; эффективность элюции — по наличию
или отсутствию маркеров в элюате. Для обнаружения вирусных маркеров
использовали методы: полимеразная цепная реакция со стадией обратной
транскрипции (ОТ-ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА),
иммунохроматографический анализ (ИХА), реакция агглютинации латекса (РАЛ).
Молекулярно-генетические исследования на выявление и дифференциацию РНК ротавирусов методом ОТ-ПЦР проводили с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс ОКИ скрин-FL» («Интерлабсервис», Москва) в соответствии с инструкцией производителя на детектирующем амплификаторе «ДТ-322» («ДНК-Технология», Россия) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Иммунологические методы применяли для определения антигенов. Антиген ротавирусов определяли методом ИФА на фотометре для микропланшет «BioRad-680» (США) тест-системой «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» («Вектор-БЕСТ», Россия), а также иммунохроматографическими тестами SIMPLE/STICK ROTA-ADENO и SIMPLE/STICK ROTA-NORO (ESPANA), и в РАЛ — диагностикумом латексным для выявления ротавирусного антигена «Ротаскрин-латекс-тест» (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) в соответствии с инструкциями производителей.
Электронной микроскопией подтверждали наличие вирусных частиц ротавирусов в модельных водоемах и полученных элюатах. Режимы электронно-микроскопического исследования кишечных вирусов отработаны на электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония) в соответствии с методиками, описанными в руководстве Doane F.W., 1994 г.
Апробацию микрофильтрационных мембран из нитрата целлюлозы и
капрона с положительным зарядом проводили при исследовании проб,
отобранных на гидролого-гидрохимических и санитарно-бактериологических
станциях акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от
наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива в 2015 году в
режиме ежемесячного мониторинга. Определяли показатели бактериальной
контаминации воды: общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные
колиформные бактерии (ТКБ), E. coli, колифаги, патогены — возбудители
кишечных инфекций рода Salmonella, а также маркеры вирусов — антиген и РНК
ротавирусов группы А, антиген и РНК вируса гепатита А. Санитарно-
микробиологические исследования проводили в соответствии с санитарными
правилами и нормами по гигиеническим требованиям к качеству поверхностных
вод СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных
вод», методическими указаниями МУ 4.2.1884-04 «Санитарно-
микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды
поверхностных водных объектов» и МУК 4.2.2029-05 «Санитарно-
вирусологический контроль водных объектов».
Статистические методы обработки данных
Обработку полученных данных в экспериментальных и натурных исследованиях проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Office 2007. Использованы приемы описательной статистики с определением числовых характеристик сгруппированных данных (определение средней арифметической
величины х. Проверку гипотез проводили с определением стандартной ошибки среднего значения т*. Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стьюдента для вероятности 95%, результаты считали достоверными при р<0,05. Применяли графический анализ связей методом построения гистограмм между различными показателями данных лабораторных исследований.
Личное участие автора в получении результатов
Личное участие соискателя заключалось в формулировании проблемы,
постановке цели и задач исследования, их решении, анализа литературных
данных, планировании и проведении экспериментов, статистической обработке и
анализе полученных результатов. Автором выполнен весь объем
бактериологических, иммунологических, молекулярно-генетических
исследований. Подготовка модельных растворов, пробоподготовка, мембранная фильтрация воды, микробиологические исследования Е. сoli, рода Salmonella, колифагов и др.; обнаружение антигенов ротавирусов методами: ИФА, ИХА, РАЛ; молекулярно-генетические исследования (выделение РНК, постановка, учет и интерпретация результатов ОТ-ПЦР) проведены соискателем самостоятельно в лаборатории кафедры микробиологии Военно-медицинской академии имени СМ. Кирова и микробиологической лаборатории ФГКУ «985 ЦГСЭН» Минобороны России.
Работы по повышению эффективности реакции агглютинации латекса для выявления ротавирусного антигена проведены совместно со специалистами ЗАО «ЭКОлаб» Е.А. Амелиной, И.А. Ермолаевой, О.Н. Леонтьевой под руководством профессора С.Г. Марданлы. Электронная микроскопия проведена в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России совместно с |к. б. н. А.К. Сироткиным] и д. м. н. В.В. Малышевым.
Отбор проб в акваториях Невской губы и восточной части Финского залива, комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений выполнен совместно со специалистами НИЦЭБ РАН к. б. н. А.Н. Шаровым и к. ф-м. н. А.В. Ивановым.
Разработка макета универсального комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных микроорганизмов в воде, а также оценка работы его отдельных блоков и тестов, проведены совместно с профессором кафедры микробиологии, д. м. н. В.В. Малышевым и заведующим кафедрой микробиологии, д. м. н., профессором В.Б. Сбойчаковым Военно-медицинской академии имени СМ. Кирова, генеральным директором ЗАО «Владисарт», к. т. н. Е.Е. Каталевским и специалистом предприятия - И.М. Куликовым.
Положения, выносимые на защиту:
1. При проведении санитарно-микробиологических исследований воды для обнаружения и количественного учета колиформных бактерий и Е. coli с помощью бактериологического посева методом мембранной фильтрации аналитически более эффективны мембраны из ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы со средним размером пор 0,45 мкм, из имеющихся эфирцеллюлозных материалов с различным диаметром пор (0,2 мкм и 0,45 мкм) и других.
-
Установлена наибольшая эффективность концентрирования ротавирусов при вакуумной мембранной фильтрации, чем при напорной фильтрации, с использованием микробиологических методов (ПЦР, ИФА, ИХА, РАЛ) определения ротавирусных маркеров.
-
Показана возможность применения экспресс-тестов (метод иммунохроматографического анализа и реакция агглютинации латекса) для обнаружения маркеров ротавирусов (антигены) в элюатах воды при проведении санитарно-микробиологических исследований с использованием экспериментальных положительно-заряженных мембран из капрона с диаметром пор 0,2 мкм в режиме вакуумной фильтрации.
Степень достоверности и апробация результатов
О достоверности результатов свидетельствует использование
сертифицированных микробиологических, иммунологических, молекулярно-генетических методов исследования, которые характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, а также поверенного оборудования. Объем проведенных исследований позволил провести статистическую обработку полученных данных.
Апробация диссертации проведена на межкафедральном совещании
федерального государственного бюджетного военного образовательного
учреждения высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации от 22 марта 2017 года, протокол № 3.
Материалы исследования доложены на: Российско-Китайской научно-
практической конференции по медицинской микробиологии и клинической
микологии (Санкт-Петербург, 2015 г.; 2016 г.); Всероссийской научно-
практической конференции «Новые методы экспресс-диагностики
микроорганизмов в медицине, фармации, ветеринарии и экологии» (Санкт-
Петербург, 2015 г.); научно-практической конференции «Лабораторная
диагностика в решении проблем современной клинической медицины» (Санкт-
Петербург, 2015 г.); заседании отделения Всероссийского научно-практического
общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и
Ленинградской области (Санкт-Петербург, 2016 г.); «3-м Азиатско-
Тихоокеанском конгрессе по военной медицине» (Санкт-Петербург, 2016 г.); II
Национальном конгрессе бактериологов «Состояние и тенденции развития
лабораторной диагностики инфекционных болезней в современных условиях»
(Санкт-Петербург, 2016 г.); «Международной конференции по медицине
катастроф и военной медицине» (Дюссельдорф, 2016 г.); трехстороннем форуме
«Gulf of Finland Trilateral Scientific Forum» (Хельсинки, 2016 г.); Юбилейной
научно-практической конференции, посвященной 15-летию образования НИЦ
ВМедА имени С.М. Кирова «Современные проблемы охраны здоровья
военнослужащих» (Санкт-Петербург, 2016 г.); Научной конференции,
посвященной тематике водоснабжения и водоотведения малых и средних
городов: «Практические вопросы снижения себестоимости и улучшения качества
предоставления услуг в условиях природно-климатических изменений»
(Череповец, 2017 г.); Российской научно-практической конференции
«Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Санкт-Петербург, 2017 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Инновации в медицинской, фармацевтической, ветеринарной и экологической микробиологии» (Санкт-Петербург, 2017 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ: 3 статьи опубликованы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК, и 7 тезисов в рецензируемых изданиях.
Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста, иллюстрированы 10 таблицами и 31 рисунком. Диссертация состоит из введения, включающего методы исследования, обзора литературы, 4 глав описания результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспектив дальнейшей разработки темы, списка сокращений, списка литературы, приложений. Список литературы включает 160 работ, из них 103 отечественных и 57 иностранных публикаций.
Использование мембранной фильтрации для контроля качества источников водоснабжения при микробиологических исследованиях санитарного надзора, и определяемые показатели
Водным путем может передаваться большое количество возбудителей таких кишечных инфекций, как: холера, брюшной тиф и паратифы, сальмонеллез, дизентерия, гепатит А, полиомиелит, а также других инфекционных заболеваний: лептоспироз, сибирская язва, туляремия, туберкулез, сап, Ку-лихорадка, различные грибковые заболевания и др. [41; 54; 69; 159]. Безопасность воды различных водных объектов в эпидемическом отношении определяется ее соответствием нормативам по микробиологическим и паразитологическим показателям [83–85].
При санитарной оценке воды важное значение имеет содержание в ней патогенных микроорганизмов [1; 11; 19]. Однако их определение — дорогостоящее, трудоёмкое и длительное; санитарно-микробиологические исследования воды начинают с косвенной индикации возможного присутствия патогенов, определяя общее микробное число и концентрацию санитарно показательных микроорганизмов [86]. Наличие или превышение в нормированных объемах проб воды концентрации следующих индикаторов фекального загрязнения: общих колиформных бактерий (ОКБ), термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) и E. сoli, говорит о возможном присутствии возбудителей ОКИ; что используется для контроля эпидемической безопасности объектов водопользования. Для поверхностных источников водоснабжения, централизованных систем питьевого водоснабжения и нецентрализованного водоснабжения определяют число КОЕ ОКБ и ТКБ в 100 мл воды [83–85]. Так как бактерии родов Serratia, Citrobacter семейства Enterobacteriaceae, входящие в группу ОКБ, могут обитать в воде водоемов [22], для определения фекального загрязнения имеет значение число E. coli в воде, а также соотношение E. coli с числом ОКБ. Наличие более 100 КОЕ Е. coli в 100 мл пробы воды, и соотношение числа ОКБ и Е. coli менее 10, свидетельствуют о несоблюдении требований к очистке сточных вод, о недавнем поступлении фекального загрязнения, о незавершенных процессах самоочищения, и т.п.
Надежность показателя Е. coli определяет его использование для оценки качества воды поверхностных водоёмов и при выборе источника водоснабжения в соответствии с МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов» [61].
Для определения нормированных показателей ОКБ и ТКБ методическими указаниями МУ 4.2.1018-01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды» метод мембранной фильтрации воды определен как основной [62]. В соответствии с методическими указаниями МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» необходимость количественной оценки полученного результата и оценка точности количественного результата санитарно-бактериологического исследования воды имеют особенности при определенной специфике объекта микробиологических исследований — микроорганизма, обладающего индивидуальными (родовыми, видовыми и др.) свойствами, особенностями жизнедеятельности в условиях водной среды; на что указывают в своих работах К. Барсов (1932 г.) и В. Сбойчаков (2007 г.) [6; 59; 86]. Оценка достоверности результатов метода мембранной фильтрации воды, как количественного метода, остается актуальной до настоящего времени. Так, К. Барсов (1932 г.) указывает на неравномерное распределение бактерий во всех взятых для анализа объемах воды [6]. В методических указаниях МУ 2.1.4.1057–01 определены объективные факторы, влияющие на результат анализа и обусловливающие разброс данных: неравномерность распределения микроорганизмов при анализе двух одинаковых объемов одной пробы воды; образование, из-за способности микроорганизмов адсорбироваться на взвешенных веществах, трудноразделимых в процессе взбалтывания комплексов, которые регистрируются при посевах как один микроорганизм; влияние сопутствующих микробов-антагонистов; затормаживание способности к развитию микроорганизма под воздействием неблагоприятных условий водной среды, т.е. его "стрессовое" состояние [59]. В результате различные факторы, независящие от исследователя, создают проблемы в оценке точности количественного результата и обусловливают погрешность микробиологических методов, достигающую сотен процентов, на что также обращено внимание в МУ 2.1.4.1057–01 [59].
Практика санитарного надзора за состоянием водных объектов окружающей среды, за циркуляцией патогенов в водных объектах свидетельствует о необходимости лабораторных исследований не только на бактериологические показатели, но и на присутствие переносимых водой вирусных патогенов [43; 52; 72; 105; 111; 113, 115; 145].
Отмечена низкая информативность использования результатов исследований только на бактериологические показатели в процессе эпидемиологического анализа водных вспышек в руководстве ВОЗ; нередко не совпадают периоды ухудшения качества воды по бактериальным и вирусным показателям, что также отмечено в работах зарубежных, а также отечественных исследователей Сергевнина В.И. и соавт. (2003 г.), Бокарева М.А. (2007 г.) [11; 80; 91; 136]. По сравнению с бактериями, такими как E. coli, выживаемость в воде вирусов (аденовирусов, энтеровирусов, вирусов гепатита А и гепатита Е, норовирусов и саповирусов, ротавирусов) определена ВОЗ как длительная (более 1 месяца); концентрация их достигает 30–60 на литр; при этом вирусы обладают большей устойчивостью к хлору [80].
Как индикаторы загрязнения воды сточными водами и вероятного вирусного присутствия, при оценке качества воды различных водных объектов, служат колифаги [83; 84; 97]. Определение контаминации воды непосредственно вирусными патогенами (такими, как энтеровирусы, ротавирусы, вирус гепатита А) в поверхностных водоисточниках, в соответствии с санитарными правилами и нормами СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод» [84], а также в других водных объектах [83], как по эпидемическим показаниям (в соответствии с нормативными документами), так и при ведении мониторинга за распространением возбудителей кишечных вирусных инфекций, рекомендованного руководством ВОЗ [80], в силу ряда причин пока не доступно для многих ведомственных микробиологических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, участвующих в контроле качества воды [50].
Непосредственное выделение возбудителей вирусных инфекций культуральным методом (на культуре клеток) осуществляется только лабораториями учреждений, имеющих разрешение, выданное в установленном порядке. Лабораториям территориального уровня требуются более доступные методы для эффективного санитарно-вирусологического контроля за объектами водопользования [50].
Санамян А.Г. (2005 г.) в своей работе упоминает об отсутствии в России длительное время унифицированных методов санитарно-вирусологических исследований воды [81]. Колифаги в сточных водах концентрировали с помощью марлевых подушечек или тампонов, погружаемых в струю воды на 3-7 суток, а для открытых водоёмов использовали адсорбцию на анионитах (АВ-17- 8 и др.) [81; 93]. Для концентрирования вирусов из питьевой воды централизованных систем водоснабжения применяли метод, предложенный Т.В. Амвросьевой с соавт. (2002 г.), с использованием ловушечного устройства с сорбентом [2]. За рубежом широко применяли метод растворимых ультрафильтров, ультрацентрифугирование, метод разделения фаз, электрофорез, эстрагирование, адсорбцию на твердых частицах, колоночную хроматографию, адсорбцию на мембранных фильтрах [19; 81; 125; 128].
Методическими указаниями МУК 4.2.2029-05 «Санитарно вирусологический контроль водных объектов» рекомендовано осуществлять предварительную оценку возможного вирусного загрязнения водных объектов с использованием косвенных показателей вирусного загрязнения — колифагов; при превышении колифагов в нормируемом объеме воды проводят прямое определение вирусов (энтеровирусов и аденовирусов) с использованием «культуральных» методов, а также выявление в пробах антигенов и РНК труднокультивируемых в клеточных культурах вирусов (вируса гепатита А, ротавирусов) и методами ИФА и ПЦР со стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Наличие антигена или РНК определенного вируса в соответствии с МУК 4.2.2029-05, как ориентировочная оценка, свидетельствует о циркуляции данного возбудителя на изучаемой территории и возможном водном пути передачи в реализации эпидемического процесса инфекции возбудителя, циркулирующего на данной территории [63].
Изучение эффективности сорбции модельного микроорганизма E. coli M17-02 из воды фильтрующими материалами
Оценивали мембраны из материалов: ацетат целлюлозы (ФМАЦ-0,2 мкм и ФМАЦ-0,45 мкм), нитрат целлюлозы (ФМНЦ-0,2 мкм и ФМНЦ-0,45 мкм), смесь сложных эфиров целлюлозы (ФМСЕ-0,45 мкм), полиамид (ФМПА-0,2 мкм).
В эксперименте исследовали пробы из модельных водоемов с внесенной в него суточной культуры E. coli М17-02. Применяли для работы методики, рекомендованные документами: ГОСТ 31955.1-2013 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации» и МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» [27; 59]. Пробы с разведениями E. coli в объемах по 100,0 мл фильтровали на устройствах для фильтрации воды. Модельные водоёмы фильтровали через ФМ вакуумной и напорной фильтрацией. Фильтрующий материал, после пролива воды, переносили на чашки Петри со средой Эндо и инкубировали в течение (21+3) ч при 37 С0. Определяли общее количество колоний, выросших на фильтрах, в сравнении с прямым посевом. Результаты выражали числом колониеобразующих единиц (КОЕ) E. coli на фильтре.
Результаты роста E. coli на исследуемых фильтрующих мембранах и на чашках Петри со средой Эндо прямым посевом после инкубации в течение (21+3) ч при 37 С0 представлены на рисунке 1.
Графическая обработка полученных результатов сорбции E. coli выявила наибольшую сорбцию бактерий на поверхности мембран ФМАЦ-0,45 мкм, ФМНЦ-0,45 мкм, ФМПА-0,2 мкм при вакуумной и напорной фильтрации, а также на мембранах ФМНЦ-0,2 мкм при напорной фильтрации; что достоверно больше, чем при прямом посеве (p 0,001). Определена низкая сорбционная способность при различных условиях фильтрации ФМ из смеси эфиров целлюлозы (ФМСЕ-0,45 мкм), что достоверно меньше, чем выделение E. coli при прямом посеве (p 0,001). Примеры роста E. coli на фильтрах ФМАЦ-0,45мкм и ФМСЕ-0,45 мкм на рисунке 2.
Затем определяли количество типичных колоний, выросших на фильтре, в сравнении с прямым посевом. Имеются статистически значимые различия среднего числа общего количества колоний E. coli и среднего числа типичных колоний на всех испытуемых ФМ, в сравнении с прямым посевом (Таблица 5).
К нетипичным колониям E. coli на среде Эндо отнесены: бледно-розовые, без отпечатка на обратной стороне фильтра, не характерные для лактозоположительных бактерий; или мелкоточечные колонии, не характерные для колиформных бактерий в соответствии с МУК 4.2.1884-04 и ГОСТ 31955.1-2013 [27; 61].
Выявлены особенности роста E. coli на ФМ из ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы со средним диаметром пор 0,2 мкм, а именно, наряду с типичными колониями был отмечен рост мелких колоний (Рисунок 3), которые в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01 не учитываются.
Мелкие темно-красные колонии на среде Эндо по МУК 4.2.1884-04 [61] требуют дополнительного подтверждения на принадлежность к колиформным бактериям.
На мембранах ФМАЦ-0,2 мкм и ФМНЦ-0,2 мкм при вакуумной фильтрации и ФМАЦ-0,2 мкм при напорной фильтрации среднее число общего количества колоний было достоверно меньше, чем при прямом посеве (Рисунок 4).
Среднее число типичных колоний на этих мембранах, было достоверно меньше, и при вакуумной, и при напорной фильтрации.
На фоне большого количества удержанных E. coli, присутствовали мелкоточечные колонии на фильтрах ФМНЦ-0,45 при вакуумной фильтрации.
Рост колоний E. coli, сорбированных на поверхности ФМ из полиамида (ФМПА-0,2 мкм) характеризовался диссоциацией колоний в R-форму, процент диссоциации составил 100% при n=30, p 0,001, в сравнении с прямым посевом. Все колонии были бледно-розовые, без металлического блеска; такие колонии не учитываются в соответствии МУ 2.1.4.1057-01, МУК 4.2.1884-04 и ГОСТ 31955.1-2013 [27; 59; 61]. Диссоциация колоний E. coli в R-форму на поверхности мембраны ФМПА-0,2 мкм затрудняла подсчет общего числа колоний (Рисунок 5).
В результате исследований наибольшая сорбция E.coli из воды была получена на мембранах ФМАЦ-0,45 мкм, ФМНЦ-0,45 мкм и ФМПА-0,2 мкм, в то же время выявлено выраженное влияние мембраны из полиамида на процессы изменчивости кишечной палочки.
Характеристика санитарно-бактериологических и санитарно вирусологических показателей качества воды акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива
Исследовали пробы воды, отобранные на гидролого-гидрохимических и санитарно-бактериологических станциях акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива в 2015 году. Кроме того, проводился ретроспективный анализ результатов ежемесячных санитарно-микробиологических исследований воды, полученных на гидролого-гидрохимических и санитарно-бактериологических станциях акваторий КЗС и Невской губы и восточной части Финского залива с 2006 по 2014 годы.
Плановые исследования проводили в соответствии с ФЗ «Об охране окружающей среды» № 7-ФЗ от 10.01.2002 (в действующей редакции); ФЗ «Об экологической экспертизе» от 23.11.1995 г. № 174-ФЗ (в действующей редакции); программой «Программа регулярных наблюдений за водным объектом и его водоохраной зоной», утвержденной ФКП «Дирекция КЗС Минрегиона России» 17.09.2012 г. и согласованной с Невско-Ладожским бассейновым водным управлением Федерального агентства водных ресурсов 18.09.2012 г.
Отбор проб воды на санитарно-бактериологические и санитарно-вирусологические показатели производился на 17 станциях ФКП «Дирекция КЗС Минрегиона России»: у створа КЗС на 10 станциях (В-1, В-2, В-3, В-4, В-5, В-6, Д2, С-1, Д7, С-2), на расстоянии 500 м от КЗС со стороны Невской губы на 4 станциях (НГ-1, НГ-2, НГ-3 и НГ-4), на расстоянии 500 м от КЗС со стороны Финского залива на 3 станциях (ФЗ-1, ФЗ-2 и ФЗ-3); на одной фоновой станции в Невской губе (С"2); и на 11 станциях ГСН (1, 2, 30, 7, 9, 10, 11, 39, 42, 15, 17). Расположение станций приведено на рисунке 17.
В связи с большим объемом исследований пробы воды станций санитарного надзора были сгруппированы в 5 групп:
I - северная часть акватории НГ (С"2,1, 2, 7, 42);
II - северный участок КЗС (В -3, В-4, В-5, В-6, Д7, С -2 НГ-3 и НГ-4, ФЗ-2 и ФЗ-3, 15);
III - южный участок КЗС (В-1, В-2, Д2, С-1, НГ-1, НГ-2, ФЗ-1;
IV - южная часть акватории НГ (10, 11, 30);
V - (9, 39, 17).
При исследовании проб в 2015 г. выявлена контаминация воды с максимумом в мае – июне. Изменения показателей имели сезонный характер и соответствовали многолетней динамике за последние десять лет.
Характеристика показателей качества воды акваторий комплекса защитных сооружений Санкт-Петербурга от наводнений, Невской губы и восточной части Финского залива в 2015 году и соответствие требованиям СанПиН 2.1.5.980-00 [61]
В 2015 году уровень ОКБ на станциях наблюдений не превышал допустимые пределы, установленные для водоемов в черте населенных мест. Число КОЕ ОКБ изменялось от 0,1 до 0,31 от предельного порога числа КОЕ ОКБ для поверхностных водоисточников (Рисунок 18).
Уровень ТКБ на станциях наблюдений в январе и феврале не превышал допустимые пределы, изменяясь от 0,5 до 0,7–0,9 от предельного порога числа КОЕ ТКБ. В остальные периоды число КОЕ ТКБ изменялось от 0,5 до 2,8 от предельного порога, с максимальными изменениями в мае и июне во всех контрольных группах и повышением в декабре до 2,4 на южном участке КЗС (Рисунок 19).
В январе число КОЕ ТКБ в пробах воды, отобранных на станциях южного и северного участка КЗС, изменялось от 0,5 до 1,2 (максимум на ст.В-1 и В-6 КЗС) от предельного порога числа КОЕ. Патогенная микрофлора не обнаружена. Максимальный уровень колифагов обнаруживался на ст. В-3и Д 7 северной границы КЗС (группа II). Обнаружены маркеры кишечных вирусов (Рота-Аг и антиген ВГА) на ст. В-1 южной границы КЗС (группа III). В феврале число КОЕ ТКБ в пробах воды, отобранных на станциях групп I–II изменялось от 0,5 до 1,3 от предельного порога числа; на ст. 17 от 0,5 до 2,2 (группа V) — на фоне максимального уровня колифагов на ст. 17. На ст. В-1 группы III и ст. В-6 группы II НГ обнаружены патогенная микрофлора — сальмонеллы и антиген ротавирусов.
В марте число КОЕ ТКБ в пробах воды, отобранных на станциях северного и южного участка КЗС, изменялось от 0,5 до 2,4 от предельного порога числа КОЕ (с максимумом на ст. В-1 южной части, ст. В-6 северной части КЗС). Уровень колифагов — 0–100 БОЕ. На ст. В-1 выделены патогенная микрофлора — сальмонеллы, Рота-Аг и антиген ВГА. На ст. В-6 — Рота-Аг и антиген ВГА.
В апреле число КОЕ ТКБ в пробах воды изменялось от 0,5 до 2,2 от предельного порога числа КОЕ (с максимумом на ст. В-1 группы III южной части КЗС от 0,5 до 2,6). Уровень колифагов составил 0–100 БОЕ, с максимумом на ст. В-1, В-2 группы III и В-5 группы II. На ст. В-1 выделены патогенная микрофлора — сальмонеллы, Рота-Аг и антиген ВГА. На ст. В-2 обнаружен Рота-Аг.
В мае отмечалось увеличение число КОЕ ТКБ в пробах воды на станциях КЗС и в акватории Невской губы, изменяясь от 0,5 до 4,4 допустимого уровня, на ст. С-1 группы II от 0,5 до 6,2. В районе южного участка КЗС — на ФЗ-1 группы III и ст.17 группы V выявлены сальмонеллы, на ФЗ-1 — Рота-Аг и антиген ВГА.
В районе северного участка КЗС — на ст. НГ-4 выявлены сальмонеллы, на НГ 4 и В-5 — антигены ротавирусов и ВГА. У северной части Финского залива во всех пробах (ст. 2 I группы) и на ст. 30 у его южной части выявлены Рота-Аг и антиген ВГА. В мае уровень колифагов составил 0–100 БОЕ, с максимумом на ст. С-1 В июне значения числа КОЕ ТКБ изменялись от 0,5 до 1,4 на южном участке и до 2,3 на северном участке КЗС. На станциях ст. 17 группы V КЗС показатель отношения E. coli к ТКБ менялся от 5 до 25 %, что свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. В пробах воды Невской губы на ст. 9, 17 группы V, на ст. С-1 группы III обнаружена патогенная микрофлора — сальмонеллы.
В июле число КОЕ ОКБ и ТКБ в пробах воды на станциях северного участка КЗС оставалось на уровне от 0,5 до 1,5 ПДК (ст. В-5, В-6, ст.42 до 2,5). В районе КЗС патогенная микрофлора не выявлена. На станциях дельты Невы и Невской губы уровень ТКБ изменялся от 0,5 до 1,2 от нормального уровня. В НГ выделена патогенная микрофлора — сальмонеллы (ст. 2).
В июле уровень колифагов составил 0–66 БОЕ, с максимумом на ст. В-1, Д2. Маркеры кишечных вирусов в пробах воды обнаружены на ст. 1, С”2 группы I, В-1 группы III (обнаружены Рота-Аг и антиген ВГА).
В августе уровень ТКБ на северном участке был в пределах нормы, кроме ст. В-5, В-6 (до 2,2); на станциях южного участка изменялся от 0,5 до 1,2; на ст. 9 в центральной части Невской губы — от 0,5 до 2,5. В районе КЗС патогенная микрофлора выявлена на ст. В-2, НГ-2, В-6 , у северной части Невской губы на ст.2.
В августе уровень колифагов составил 0–66 БОЕ, с максимумом на ст. 9 группы V, НГ-4, В-6 группы II, НГ-2, НГ-1 группы III. Маркеры кишечных вирусов (Рота-Аг и антиген ВГА) обнаружены в пробах воды на ст. ФЗ-3, НГ-3, В-6 группы II, ФЗ-1, НГ-2, В-2 группы III.
В сентябре уровень числа КОЕ ТКБ в пробах воды, отобранных на станциях дельты Невы и северной части Невской губы, изменялся от 0,5 до 4,9 от нормального уровня (с максимумом ст.1, ст.2, ст.7 группы I). В районе Невской губы патогенная микрофлора выявлена на ст.2 и ст.9. На станциях северной и южной части КЗС уровень ТКБ изменялся от 0,5 до 2,7. Уровень колифагов составил 0–100 БОЕ, с максимумом на ст. 30 группы V. Маркеры кишечных вирусов были обнаружены в пробах воды на ст. С”2, В-1, С-1, Д2 ст.9 (обнаружены Рота-Аг и антиген ВГА).
В октябре уровень бактериального загрязнения Невской губы незначительно превышал допустимые пределы, установленные для водоемов в черте населенных мест. Уровень числа КОЕ ТКБ изменялся от 0,5 до 2,3 от нормального уровня в пробах воды, отобранных на станциях северного участка КЗС (ст. С-2) и у южного участка КЗС до 2,5 (ст. В1, НГ-1). В районе южного участка КЗС патогенная микрофлора не выявлена. В северной части КЗС на ст. НГ-4 и в Невской губе на ст. С”2, ст.9 обнаружена патогенная микрофлора — сальмонеллы. Уровень колифагов менялся от 0–100 БОЕ, с максимумом на ст. ФЗ 3 группы II, НГ-1, НГ-2 группы III. Рота-Аг и антиген ВГА обнаружены в пробах воды на ст. С”2 группы I, НГ-4, ФЗ-2 группы II, ФЗ-1, Д2, НГ-1, В-1 группы III.
В ноябре уровень бактериального загрязнения превышал допустимые пределы, установленные для водоемов в черте населенных мест. Значения числа КОЕ ТКБ в пробах воды, отобранных на станциях северного и южного участка строительства, изменялись от 0,5 до 1,2 (ст. В-6 и НГ-4) и 0,5 до 2,8 (ст. В-1 и НГ-1). В изучаемой акватории патогенная микрофлора обнаружена на ст. В-6. Уровень колифагов составил 0–100 БОЕ, с максимумом на ст. В-1. Рота-Аг и антиген ВГА были обнаружены в пробах воды на ст. В-1.
В декабре уровень числа КОЕ ТКБ в пробах воды, отобранных на станциях северного и южного участка строительства, были в пределах нормы, за исключением ст. В-1 групы III — изменения до 4,6 от нормального уровня; ст.В-6 группы II — до 1,2. В районах Невской губы уровень бактериального загрязнения не превышал допустимые пределы, установленные для водоемов в черте населенных мест. На ст. В-1В выявлена патогенная микрофлора. Маркеры кишечных вирусов обнаружены на ст. В-1, ст. В-2, ст. В-6 (обнаружены Рота-Аг и антиген ВГА).
Полученные показатели бактериального и вирусного загрязнения в 2015 году отличались от среднемноголетних показателей; основные показатели графически представлены на рисунках 21–25.
Разработка макета комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных бактерий и вирусов в водных объектах
В основу создаваемого макета универсального комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных бактерий и вирусов в воде была заложена идея разработки мобильного, малогабаритного оборудования для детекции кишечных микроорганизмов на месте отбора проб при проведении санитарно-бактериологического и санитарно-вирусологического контроля водных объектов. Работа проведена в соответствии с Техническим заданием на составную часть научно-исследовательской работы «Обоснование направлений повышения эффективности экспресс диагностики острых кишечных инфекций вирусной этиологии в Вооруженных силах РФ», шифр «Вирион», утверждённым в мае 2014 года и дополнением № 1, утверждённым в мае 2016 года.
При разработке макета комплекта учитывали проблемные вопросы пробоподготовки и разработанных методов санитарно-микробиологического контроля воды, существующие на сегодняшний день. Для исследований воды на кишечные бактерии методом мембранной фильтрации необходимо стационарное рабочее место, оборудование для вакуумной фильтрации проб воды, наличие свежеприготовленных питательных сред и стационарного инкубатора для культивирования бактерий. Санитарно-вирусологические исследования требуют специального оборудования, и часто, наличия дефицитных реактивов; кроме того, пробоподготовка необходимого объема воды требует сравнительно длительного времени фильтрования. При этом методика обработки исследуемых проб заключается в фильтровании определённого объёма исследуемой воды (не менее 10 л) через сорбирующий или фильтрующий материал, смыв (элюцию) отфильтрованного концентрата буфером, повторное концентрирование (фильтрование) смыва и затем анализ вторичного концентрата методом ПЦР или иным способом [63].
С использованием материалов диссертации разработаны отдельные элементы макета переносного комплекта, где предусмотрено многократное их использование в полевых условиях. Все элементы укладки при необходимости могут быть заменены, или доукомплектованы. Для забора проб воды и создания вакуума при концентрировании могут использоваться ручной или электрический насос.
Выбор схемы проведения санитарно-бактериологического исследования проб воды
Исследование воды на санитарно-бактериологические показатели включает следующие этапы:
1. Фильтрация на месте отбора пробы воды через стерильные ФМ на установке фильтрации воды со специальными воронками. В зависимости от ожидаемой степени обсеменённости исследуемого образца для анализа отбирается проба 100,0 мл или 500,0 мл воды.
2. Инкубирование ФМ с концентратом на питательной среде. Предлагается использовать стерильные картонные подложки с питательной средой в чашках Петри из нержавеющей стали, либо одноразовые пластиковые чашки, для обнаружения кишечной палочки и колиформных бактерий, а также специальный малогабаритный термостат.
3. Подсчет типичных колоний кишечной палочки, определение биохимических свойств. По характеру и количеству выросших колоний делается вывод о степени обсеменённости исследуемого образца.
4. При необходимости транспортировка рабочих чашек с ФМ в укладке до стационарной лаборатории.
Так как для выделения кишечных бактерий необходимо подращивание их на питательной среде в термостате, что требует специального и громоздкого оборудования, а результат может быть получен только через несколько часов, рассматривается возможность использования индикаторного картона для обнаружения кишечной палочки и колиформных бактерий. Работа в этом направлении требует дополнительных исследований.
Выбор схемы проведения санитарно-вирусологического исследования воды
Основные этапы пробоподготовки и санитарно-вирусологического исследования образцов воды представлены на рисунке 27.
1. Фильтрация пробы воды на месте отбора. Предполагается использовать ручной или электрический насос для забора воды (Рисунок 28).
Всасывающий шланг во избежание забивания насоса комплектуется сетчатым фильтром.
Фильтрующая платформа для концентрирования кишечных вирусов уменьшена в диаметре до 90 мм и представляет собой быстросборный (на скобе) двухпластинчатый держатель из нержавеющей стали (Рисунок 29), в который заправляется стерильная микрофильтрационная мембрана.
2. Элюция вирусов с мембраны. Мембранный фильтр после завершения фильтрования помещается в металлическую, из нержавеющей стали, чашку Петри, куда вносится элюирующий буферный раствор для смыва вирусов.
3. Определение вирусных маркеров (антигенов) проводится в полевых условиях. Несколько капель смывной жидкости (элюат) из чашки Петри дозатором наносится на специальный планшет (Рисунок 30).
Затем вносится несколько капель латексного диагностикума (в таком же объеме) и смешивается с исследуемым материалом. При наличии вирусов в элюате (положительная проба) в течение 2–5 минут (не более 10 минут) на чёрном поле планшета обнаруживаются хлопья агглютината — в присутствии гомологичного иммунореагента происходит агглютинация. При отрицательном результате реакции суспензия остается гомогенно мутной, без глыбок агглютината, и участков просветления. Параллельно ставят контрольные реакции, позволяющие исключить возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Результат РАЛ носит только качественный характер. Для получения полуколичественных результатов и оценки степени вирусной контаминации используют разведения элюата.
Одновременно несколько капель элюата наносится на иммунохроматографические полоски, результат сравнивается с контролями; время получения ответа не более 10 минут.
Макет комплекта включает устройства и материалы для санитарно-бактериологических и санитарно-вирусологических исследований (Рисунок 31).
Для санитарно-бактериологических исследований воды предусмотрены: устройство с воронками для фильтрации проб 100,0 мл, 350,0 мл или 500,0 мл с вакуумным насосом; емкости для фильтрата; питательные подложки для культивирования микроорганизмов; мини-термостат (370 С); комплект микрофильтрационных мембран для извлечения бактерий.
Для концентрирования кишечных вирусов из воды предусмотрены: вакуумный электрический насос; вакуумный ручной насос; шланг для забора воды, снабженный сетчатым фильтром; фильтрующий аппарат; комплект микрофильтрационных мембранных фильтров диаметром 90 мм; металлический бюкс для проведения элюции вирусов с мембраны; ёмкость с буферным раствором для смыва; планшеты для детекции вирусных маркеров; емкость для фильтрата; рН полоски.
Дополнительные инструменты и принадлежности: дозаторы переменного объема, наконечники, емкости и полиэтиленовые пакеты для сброса, пробирки, микропробирки в штативах, соединительные трубки, ножницы, пинцеты, газовая горелка, фонарь, таймер, ветошь, специальная одноразовая одежда, средства индивидуальной защиты, средства очистки и стерилизации; инструкции по порядку работы с комплектом и др.
Весь комплект оборудования предлагается разместить в укладке — чемодане из прочного пластика, предназначенного для доставки в необходимое место любым транспортом или вручную. Предполагается использовать вышеуказанный комплект в любых регионах, где есть необходимость контроля качества воды в полевых условиях, в том числе в условиях Арктики, разместив его компоненты и содержимое в пластиковом термоконтейнере с термодатчиком.
Таким образом, разработаны отдельные элементы макета переносного комплекта для пробоподготовки и детекции кишечных бактерий и вирусов, где предусмотрено многократное их использование в полевых условиях при проведении санитарно-микробиологических исследований водных объектов. Все элементы при необходимости могут быть заменены, или доукомплектованы.