Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1 Основные сведения о лицензированных сибиреязвенных вакцинах и экспериментальных препаратах, допущенных до клинических испытаний
1.2 Адъюванты как иммуностимулирующие компоненты вакцин -классификация, основные свойства, механизм действия и взаимодействие со структурами врожденного иммунитета 25
1.3 Методические подходы к стабилизации вакцин, использование консервантов 38
Собственные исследования 47
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Материалы 47
2.1.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе 47
2.1.2 Питательные среды и реактивы 47
2.1.3 Лабораторные животные 48
2.2 Микробиологические методы исследования 48
2.2.1 Получение посевной культуры рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo- 48
2.2.1.1 Получение бактериальной культуры I пассажа 49
2.2.1.2 Получение бактериальной культуры II пассажа
2.2.2 Культивирование рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo - 49
2.2.3 Контроль чистоты посевной культуры штамма-продуцента B. аnthracis 50 2.2.4 Отделение клеточной биомассы и стерилизация куль-турального фильтрата или супернатанта 50
2.2.5 Подготовка иммунизирующего и тест-заражающего штаммов B. anthracis 51
2.2.6 Определение показателей роста микробных клеток 51
2.2.7 Контроль специфической стерильности препаратов 52
2.3 Биохимические и биофизические методы исследования 52
2.3.1 Выделение и хроматографическая очистка протектив ного антигена из культурального фильтрата рекомби нантного штамма-продуцента B. anthracis 52
55TПА-1Spo
2.3.2 Выделение и очистка белка S-слоя ЕА1 из клеточных стенок рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo- 53
2.3.3 Белковый электрофорез 55
2.3.4 Определение концентрации белковых препаратов 55
2.3.5 Определение рН растворенного препарата прототипа вакцины 55
2.3.6 Атомно-силовая микроскопия 55
2.4 Иммунохимические методы исследования 56
2.4.1 Определение титров антител в сыворотках иммунизированных животных с использованием твердофазного иммуноферментного анализа 56
2.4.2 Иммуноблот 56
2.4.3 Определение уровня продукции протективного антигена рекомбинантным штаммом 56
2.5 Иммунологические методы исследования 56
2.5.1 Иммунизация лабораторных животных 56
2.5.2 Определение значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных животных 57
2.5.3 Определение ЛД50 тест-заражающего штамма для иммунизированных линейных мышей и морских свинок, индексов иммунитета антигенных препаратов 57
2.5.4 Выделение лимфоцитов тимуса и селезенки 58
2.6 Методы определения потенциальной токсичности биопрепаратов 58
2.6.1 Определение аномальной токсичности биопрепаратов
в экспериментах in vivo 58
2.6.2 Морфологические исследования 58
2.6.3 Гистологические исследования 59
2.7 Молекулярно-генетические методы исследования 59
2.7.1 Выделение РНК из лимфоцитов тимуса и селезенки и обратная транскрипция
2.7.2 Проведение полимеразной цепной реакции 60
2.8 Биотехнологические методы 60
2.8.1 Получение лиофилизата прототипа вакцины 60
2.8.2 Синтез и очистка CpG-ОДН 61
2.8.3 Определение потери массы при высушивании 62
2.9 Статистические методы 62
Глава 3. Определение возможности использования штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- в качестве единого источника иммуногеных антигенов сибиреязвенного микроба – протективного антигена и белка S-слоя EA1 63
Глава 4. Определение способности адъювантов: гидроокиси алюминия, монофосфорилированного липида А и CpG-ОДН повышать иммуноло гическую эффективность сибиреязвенных антигенов, выделенных из рекомбинантного штамма-продуцента 71
4.1 Влияние исследуемых адъювантов на экспрессию толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета 72
4.2 Иммунологическая эффективность сочетания рекомбинантного протективного антигена с различными вариантами синтезированных CpG-ОДН 74
4.3 Сравнение эффективности препаратов, включающих рекомби нантный протективный антиген и один из адъювантов: гидро
окисью алюминия, монофосфорилированным липидом А и CpG-ОДН 77
Глава 5. Изучение влияния полученных из рекомбинантного штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- антигенов и их сочетания с адъювантами на органы и ткани иммунизированных животных 83
5.1 Морфометрическое и гистологическое исследование органов и тканей лабораторных животных, иммунизированных протек-тивным антигеном 84
5.2 Морфометрическое и гистологическое исследование органов и тканей лабораторных животных, иммунизированных рекомби-нантным протективным антигеном в сочетании с белком ЕА1 90
5.3 Изучение влияния адъюванта CpG 2006 и его комбинации с альгидрогелем на органы и ткани иммунизированных лабораторных животных 94
Глава 6. Получение прототипа вакцины сибиреязвенной химической, соответствующего требованиям к иммунобиологическим препаратам 100
6.1 Стабилизация белковых молекул в составе прототипа вакцины сибиреязвенной химической 100
6.2 Технологическая схема получения прототипа вакцины сибиреязвенной химической и определение его соответствия требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам 108
6.3 Перспективы дальнейшего изучения прототипа вакцины сибиреязвенной химической 116
Заключение 123
Выводы 135
Список принятых обозначений и сокращений 137
Список использованной литературы
- Адъюванты как иммуностимулирующие компоненты вакцин -классификация, основные свойства, механизм действия и взаимодействие со структурами врожденного иммунитета
- Культивирование рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo
- Определение значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных животных
- Иммунологическая эффективность сочетания рекомбинантного протективного антигена с различными вариантами синтезированных CpG-ОДН
Введение к работе
Актуальность исследования. Сибирская язва – особо опасная инфекционная болезнь, вызываемая грамположительным спорообразующим микроорганизмом – Bacillus anthracis. Причиной заболевания людей традиционно является контакт с заболевшим животным в процессе ухода, вынужденного убоя или разделки туши. Ежегодно в Российской Федерации регистрируют от 1 до 20 случаев заболеваний людей сибирской язвой. В 2014 году отмечено 7 случаев кожной формы болезни в пяти субъектах Южного, Приволжского и Центрального федеральных округов (Рязанова А.Г. и др., 2015). Сибирская язва потенциально опасна в плане возникновения чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения трансграничного характера (Еременко Е.И. и др., 2013). Не исключена вероятность совершения биотеррористических актов с использованием спор данного высокопатогенного микроорганизма (Brachman P., 2002; Grundmann O., 2014). Проведение противосибиреязвенной вакцинации декретированного контингента позволяет значительно снизить риск возникновения случаев особо опасной инфекции.
Степень разработанности темы исследования. Профилактика сибирской язвы на территории Российской Федерации проводится с использованием живой вакциной на основе атте-нуированного штамма B. anthracis СТИ-1 (Онищенко Г.Г., Кожухов В.В., 2010). За рубежом лицензированы химические вакцины - AVA (anthrax vaccine adsorbed, синоним BioThrax, США) и AVP (anthrax vaccine precipitated, Великобритания) (Chitlaru T. et al., 2011; Friedlander A., Little S., 2009). Разработана вакцина сибиреязвенная комбинированная сухая для подкожного применения (Кожухов В.В. и др., 2002; Садовой Н.В. и др., 1998; Шевцов А.Н. и др., 2007). Все перечисленные препараты относятся к первому и второму поколению сибиреязвенных вакцин. Технологии их производства основаны на применении аттенуированных спорообразующих штаммов B. аnthracis.
Один из возможных альтернативных путей - использование продуктов геномных технологий. В основе вакцинных препаратов нового поколения лежит протективный антиген, полученный из генно-инженерных штаммов. Отдельные представители из созданных за рубежом прототипов сибиреязвенных вакцин успешно прошли все фазы доклинических исследований, единицы находятся на начальных этапах клинических испытаний (Bellanti J. et al., 2012; Brown B. et al., 2010; Campbell J. et al., 2007; Watkinson A. et al., 2013). В ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разрабатывается прототип сибиреязвенной химической вакцины, включающий в качестве им-муногенных компонентов рекомбинантный протективный антиген (рПА) и белок поверхностного S-слоя ЕА1. Продуцентом рПА является генно-инженерный аспорогенный штамм B. anthracis 55ТПА-1Spo- (Микшис Н.И., 2009; Шулепов Д.В., 2009). Белок ЕА1 традиционно выделяли из бесплазмидного производного вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 – СТИТ
(Гончарова А.Ю., 2007; Микшис Н.И., 2009; Попова П.Ю., 2012). Эксперименты на различных биомоделях показали высокую иммунологическую эффективность очищенного рПА (Микшис Н.И. и др., 2011). Индексы иммунитета рПА (при условии двукратной иммунизации) и вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 были сопоставимы. Введение рПА и белка ЕА1 не приводило к угнетению функций иммунокомпетентных органов (Попова П.Ю., 2012). Вместе с тем, пато-морфологические исследования органов и тканей лабораторных животных, иммунизированных полученными из штамма В. anthracis 55TПА-1Spo- антигенами, не проводились. Отечественных аналогов создаваемого прототипа рекомбинантной сибиреязвенной вакцины на настоящий момент не существует.
Разработка вакцинных препаратов на основе иммуногенных антигенов, синтезируемых рекомбинантными продуцентами, в значительной мере решает проблему остаточной вирулентности и реактогенности (Williamson D., Dyson E., 2015). Однако исследования последних десятилетий показали, что продукты геномных технологий обладают недостаточной иммуногенно-стью (Семенов Б.Ф. и др., 2009). Применение современных адъювантов в составе вакцин решает задачу оптимального представления антигенов иммунной системе, способствует формированию выраженного иммунного ответа с развитием гуморальных и клеточных иммунных реакций (Rueckert C., Guzmn C., 2012). При выборе адъюванта принимается во внимание его биосовместимость с организмом человека, способность стимулировать опосредованный через толл-подобные рецепторы (toll-like receptors, TLR) врожденный иммунитет (Alving С. et al., 2012). Наряду с веществами, повышающими эффективность вакцины, в композиционный состав входят вспомогательные вещества, которые обеспечивают сохранение их качества - стабилизаторы и консерванты. Правильный выбор среды высушивания и методических аспектов процесса лиофилизации позволяет увеличить срок годности препарата и свести к минимуму изменение основных характеристик (Chi E. et al., 2003; Kristensen D., Chen D. 2003).
Учитывая вышеизложенное, в данной работе будут проведены исследования по определению возможности использования штамма В. anthracis 55ТПА 1Spo- в качестве единого источника получения рПА и ЕА1, введению в композиционный состав эффективного и безопасного адъюванта, снижению риска деградации иммуногенных белковых молекул в процессе хранения. Необходимо будет также оценить иммунологическую эффективность разработанного прототипа вакцины сибиреязвенной химической и получить расширенную информацию о влиянии создаваемого препарата на макроорганизм.
Цель исследования: определение условий выделения из рекомбинантного штамма-продуцента В. anthracis 55ТПА-1Spo- препаративных количеств протективного антигена и белка ЕА1, повышение их иммунологической эффективности и стабильности, создание прототипа вакцины, отвечающего современным требованиям.
Задачи исследования:
-
Подобрать условия культивирования рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55ТПА-1Spo-, позволяющие объединить получение протективного антигена и белка ЕА1. Продемонстрировать воспроизводимость оптимизированного способа, определить его производительность и качество очистки сибиреязвенных антигенов.
-
Оценить иммунологическую эффективность полученных из штамма B. anthracis 55ТПА-1Spo- антигенов в сочетании с адъювантами различных классов: гидроокисью алюминия, монофосфорилированным липидом А и олигодезоксинуклеотидами CpG. Провести сравнение с протективной активностью вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.
-
Охарактеризовать структурные и функциональные изменения в органах и тканях лабораторных животных, иммунизированных полученными из рекомбинантного штамма B. anthracis антигенами рПА и ЕА1, в том числе, в сочетании с адъювантами различных классов. Провести сравнение с результатами воздействия на организм лабораторных животных иммунизации вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1.
-
Определить оптимальные подходы, обеспечивающие стабильность белковых компонентов прототипа вакцины сибиреязвенной химической. Разработать технологическую схему получения прототипа вакцины сибиреязвенной химической, включающей иммуногенные сибиреязвенные антигены, а также адъювант, стабилизатор и консервант.
5. Оценить соответствие прототипа вакцины сибиреязвенной химической требованиям,
предъявляемым к иммунобиологическим препаратам: иммунологическую эффективность, без
вредность и физико-химические свойства.
Научная новизна исследования:
На основе использования рекомбинантного штамма B. anthracis 55ТПА-1Spo- разработан и апробирован способ, объединяющий получение иммуногенных сибиреязвенных антигенов – протективного антигена (ПА) и белка ЕА1. Показано, что отсутствие селективного антибиотика в питательной среде на протяжении 24 часов выращивания штамма B. anthracis 55ТПА-1Spo- не оказывает негативного влияния на продукцию ПА. При использовании ре-комбинантного штамма достигается высокий выход обоих целевых продуктов. Продукция ПА более чем в 10 раз превышает аналогичный показатель, установленный для вакцинного штамма B. anthracis 55.
Проведено комплексное сравнение иммунологической эффективности препаратов, содержащих рПА, полученный из штамма-продуцента B. anthracis 55ТПА-1Spo-, и адъюванты различных классов: гидроокись алюминия (альгидрогель), монофосфорилированный липид А (MPL) и цитозин-гуанин олигодезоксинуклеотиды (CpG-ОДН). В экспериментах по определению протективной активности на модели мышей линии BALB/c (тест-заражающий штамм
B. anthracis 71/12) установлено, что все антигенные препараты по протективной активности не уступают вакцинному штамму СТИ-1. При этом наибольшей адъювантной эффективностью обладают MPL (отдельно и в сочетании с дикориномиколатом трегалозы и скваленом) и CpG 2006. Сравнение динамики титров специфичных антител у иммунизированных морских свинок на протяжении 8 месяцев наблюдения выявило преимущество адъюванта CpG 2006.
Проведено сравнение уровней экспрессии генов, кодирующих TLR 2, 4, 6 и 9 типов в клетках иммунокомпетентных органов линейных мышей, иммунизированных выделенными из штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- антигенами в сочетании с адъювантами различных классов: альгидрогелем, MPL и CpG 2006. Выявлено снижение экспрессии генов TLR 2, 4, 6 и 9 типов в клетках иммунокомпетентных органов линейных мышей, иммунизированных сибиреязвенными антигенами с альгидрогелем, по сравнению с интактными животными.
Показано, что выделенные из штамма-продуцента B. anthracis 55TПА 1Spo- сибиреязвенные антигены оказывают менее выраженное негативное воздействие на макроорганизм, чем вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1. При гистологическом исследовании отмечено развитие умеренной гиперпластической реакции в селезенке и лимфатических узлах на фоне незначительных и обратимых изменений со стороны внутренних органов. Установлено, что двукратная иммунизация морских свинок очищенными рПА и белком ЕА1 с адъювантом CpG 2006 или комбинированным адъювантом (альгидрогель + CpG 2006) приводит к формированию иммунобиологической перестройки в лимфоидных органах биомоделей, развитию слабо выраженной и обратимой стресс-реакции макроорганизма.
Разработана технологическая схема получения прототипа вакцины сибиреязвенной химической, содержащего иммуногенные антигены, адъювант, стабилизаторы и консервант. Показано, что лиофилизация в присутствии 1 % сахарозы и 3 % глицина не влияет на иммуноген-ную активность препарата и обеспечивает стабильность при хранении при температуре 4 С (срок наблюдения 1 год). Проведено комплексное исследование прототипа вакцины сибиреязвенной химической (лиофилизат для приготовления раствора для парентерального введения) на соответствие требованиям к лекарственным иммунобиологическим препаратам.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты подтверждают перспективность использования генно-инженерных микроорганизмов в создании средств специфической профилактики сибирской язвы; вносят вклад в расширение представлений о взаимодействии с макроорганизмом значимых антигенов B. anthracis - ПА и белка ЕА1, а также адъювантов различных классов - гидроокиси алюминия, MPL и CpG-ОДН. Выявленные закономерности и особенности их влиянии на развитие реакций врожденного и адаптивного иммунитета, на органы и ткани биомоделей способствуют совершенствованию методологии конструирования нового поколения вакцин для специфической профилактики сибирской язвы.
Материалы диссертационного исследования являются основой для разработки програм
мы доклинических исследований прототипа вакцины сибиреязвенной химической; лаборатор
ного регламента получения кандидатной вакцины, в основе которого лежит использование ре-
комбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo-; проекта опытно-
промышленного регламента получения кандидатной вакцины; проекта нормативной докумен
тации (фармакопейной статьи предприятия) на кандидатную вакцину. На основании проведен
ных экспериментов разработаны методические рекомендации: «Лиофилизация прототипа хи
мической сибиреязвенной вакцины» и «Получение синтетических CpG-соединений, используе
мых в качестве адьювантов», одобренные Ученым советом и утвержденные директором ФКУЗ
РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 23.10.2015 г.). Материалы диссертации используются
при чтении лекций на курсах профессиональной переподготовки и повышения квалификации
врачей и биологов по особо опасным инфекциям при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Методология и методы исследования. Методологию работы определяли соответственно поставленной цели. Применительно к проблематике диссертации использовали комплекс базовых методов исследования: микробиологических (культивирование штамма-продуцента, определение чистоты посевной культуры, контроль специфической стерильности препаратов, подготовка тест-заражающего штамма, определение ЛД50 тест-заражающего штамма), биохимических (выделение и хроматографическая очистка рПА и ЕА1, белковый электрофорез), иммунологических (иммунизация лабораторных животных, выделение лимфоцитов тимуса и селезенки), иммунохимических (ИФА, иммуноблот), биотехнологических (лиофилизация препаратов, синтез CpG-ОДН, разработка технологии получения кандидатной вакцины), биофизических (атомно-силовая микроскопия), патоморфологических (морфометрические и гистологические исследования органов и тканей), молекулярно-генетических (выделение РНК, обратная транскрипция) и статистических.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Оптимизированные условия культивирования штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- позволяют объединить получение протективного антигена и белка ЕА1. Реализация способа в лабораторных и производственных условиях обеспечивает высокий выход обоих целевых продуктов независимо от наличия в среде культивирования селективного антибиотика. Синтезированный в гомологичном штамме сибиреязвенный антиген, кодируемый рекомбинантной плаз-мидной ДНК, сохраняет свою биологическую активность.
-
Полученные из штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo- антигены в сочетании с адъювантами различных классов (альгидрогель, MPL и CpG-ОДН) вызывают развитие у лабораторных животных выраженного иммунного ответа. Протективность изученных антигенных препаратов соответствует протективности вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1. На основа-
нии результатов комплексного сравнительного анализа препаратов установлено преимущество адъювантов, способных взаимодействовать со структурами врожденного иммунитета - MPL и CpG-ОДН.
-
Очищенные антигены, выделенные из рекомбинантного штамма B. anthracis, отдельно и в сочетании с адъювантом CpG 2006 или комбинированным адъювантом (альгидрогель + CpG 2006), не оказывают токсического действия на органы и ткани иммунизированных животных. В отличие от вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 они не ассоциированы с гибелью биомоделей. Незначительные изменения, выявленные при гистологическом исследовании, являются отражением адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма и имеют тенденцию к нормализации. Реакция иммунокомпетентных органов соответствует умеренным проявлениям иммуногенеза.
-
Стабилизацию белковых антигенов в составе прототипа вакцины сибиреязвенной химической обеспечивает лиофилизация в присутствии 1 % сахарозы и 3 % глицина. На основании комплексного исследования прототип вакцины сибиреязвенной химической (лиофилизат для приготовления раствора для парентерального введения), содержащий рПА, белок S-слоя ЕА1, адъювант, стабилизаторы и консервант, соответствует требованиям, предъявляемым к лекарственным иммунобиологическим препаратам.
Степень достоверности и апробация работы. Степень достоверности результатов исследования основывается на использовании большого фактического материала, полученного с использованием современных научных методов на сертифицированном и прошедшем метрологическую поверку оборудовании. Приведенные данные получены в повторяющихся экспериментах и подвергнуты статистической обработке.
Материалы диссертации представлялись на XII Межгосударственной научно-практической конференции «Вклад государств-участников Содружества Независимых Государств в обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в современных условиях» (Саратов, 2014); 19-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2015); VII Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2015); Международной конференции «Перспективы сотрудничества государств – членов Шанхайской организации сотрудничества (ШОС) в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сочи, 2015); Международной конференции «Общие угрозы-совместные действия. Ответ государств БРИКС на вызовы опасных инфекционных болезней» (Москва, 2015); а также ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2013-2015).
Публикации и связь работы с научными программами. Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях, из них 3 статьи в рекомендованных ВАК изданиях.
Работа выполнена в рамках плановых НИР «Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы» (2009 - 2013 гг.), шифр 41-3-09, № гос. регистрации 0120.0853925, «Разработка живых рекомбинантных вакцин для специфической профилактики чумы и сибирской язвы» (2014 - 2016 гг.), шифр 49-3-14, № гос. регистрации 01201450346.
Личный вклад автора. Автором определены цель, задачи и дизайн исследования, выполнен аналитический обзор литературы, проведены необходимые научные эксперименты, осуществлена обработка, интерпретация и систематизация полученных данных. Гистологические исследования органов и тканей иммунизированных животных проводились совместно с заведующей отделом иммунологии ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», д.м.н. Бугорковой С.А.; CpG-ОДН синтезированы н.с. лаборатории генодиагностических препаратов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Степановым А.В., их характеристика, включая определение иммунологической эффективности и безопасности, проведена лично автором.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 48 отечественных и 128 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 157 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 7 таблицами и 34 рисунками.
Адъюванты как иммуностимулирующие компоненты вакцин -классификация, основные свойства, механизм действия и взаимодействие со структурами врожденного иммунитета
Вакцина сибиреязвенная живая сухая СТИ-1. Основу живой сибиреязвенной вакцины составляет штамм B. anthracis СТИ-1, у которого отсутствует способность синтезировать полиглютаминовую капсулу. Штамм был получен в 1940 г. Н.Н. Гинсбургом в результате аттенуации вирулентного изолята B. anthracis "Красная Нива", изолированного от лошади на Орловской биофабрике в 1934 г.. В 1942 г. вакцину СТИ-1 начали применять для иммунизации животных. Еще через год была показана ее слабая реактогенность для населения. В 1944 г. вакцину СТИ-1 применяли при ликвидации вспышки особого опасного заболевания в войсках на территории Ирана и Румынии, а начиная с 1951 г. Министерство здравоохранения рекомендует ее для иммунизации людей групп риска (Онищенко Г.Г. и др., 1999). Лицензия на производство сибиреязвенной вакцины для скарификационного применения была получена в 1953 г., для подкожного введения - в 1959 г. В бывшем СССР производство вакцины осуществлялось в Тбилисском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток. В России – в ФГУ "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны России" (г. Киров) и в филиале ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «ЦВТП БЗ» (г. Екатеринбург).
Крупномасштабные исследования препарата проводили на территории Молдавии (1951-1952 гг.) и Казахстана (1973-1975 гг.). На территории Казахской ССР было привито около 150 тысяч человек. В первом случае эффективность живой вакцины СТИ-1 составила 75 %, во втором - 84 % (Бургасов П.Н. и др., 1976). По результатам испытаний было сделано заключение о высокой иммунологической эффективности и довольно низкой реактогенности вакцины B. anthracis СТИ-1.
В настоящее время вакцина представляет собой споры аттенуированного штамма B. anthracis СТИ-1, лиофилизированные в 10 % водном растворе сахарозы. Технология производства вакцины включает глубинное культивирование микроорганизма в жидкой питательной среде. Вакцинации против сибирской язвы подлежат строго определенные контингенты населения, чья профессиональная деятельность связана с риском заражения.
Ранее вакциной СТИ-1 иммунизировали однократно. Отмечено, что после однократного подкожного применения вакцины СТИ-1 адаптивный иммунитет выявляется через месяц только у 50 - 60 % вакцинированных людей и сохраняется до 3 месяцев у 28 - 32 % привитых, а до 5 месяцев только у 15 % (Абалакин В.А., 1990; Сергеева Л.В., 1982). В связи с этим используемая в настоящее время схема вакцинации – первично двукратное введение вакцины в дозе 50 млн. спор (подкожное введение) с интервалом 20 - 30 суток и последующие ежегодные ревакцинации. Доза вакцины для скарификационнного применения составляет 500 млн спор в 0,05 мл. Внеплановую вакцинацию проводят подкожным способом. Специфическую профилактику сибирской язвы проводят с 14-летнего возраста (Под ред. Г.Г.Онищенко, В.В. Кожухова, 2010).
Допустимые реакции на введение вакцины - гиперемия, небольшая болезненность, инфильтрат диаметром до 50 мм на месте инъекции. Общая реакция возникает редко в первые сутки после прививки и проявляется незначительным повышением температуры, недомоганием и головной болью. Иногда может наблюдаться повышение температуры тела до 38,5 С и небольшое увеличение регионарных лимфатических узлов.
Опубликованных данных о рандомизированных клинических исследованиях живой сибиреязвенной вакцины очень мало. Имеющиеся сведения о клинических испытаниях вакцины (двукратная схема, 69 человек, 1988 г.) свидетельствуют, что общие реакции средней и слабой степени тяжести наблюдались в 1,5 % случаев. Тяжелых поствакцинальных осложнений и утраты трудоспособности зарегистрировано не было. У некоторых добровольцев повышение температуры тела возникало через 9 – 12 часов после вакцинации, достигало максимума через 24 часа и полностью исчезало к 48 часам. Клиническое обследование привитых людей не выявило стрессового и аллергизирующего воздействия препарата на организм. За длительный период применения живой сибиреязвенной вакцины не было сообщений о возникновении тяжелых побочных эффектов (Shlyakhov E., Rubinstein E., 1994; Shlyakhov E. et al., 1997). Следует отметить, что систематической отчетности о здоровье лиц, подлежа 19 щих вакцинации живой сибиреязвенной вакциной, в доступных источниках не приводится. Как следствие отсутствуют статистически достоверные данные о побочных действиях вакцины. Использование живой споровой вакцины регламентировано в России (штамм B. anthracis СТИ-1) и Китае (штамм B. anthracis А16R) для вакцинации населения групп риска. В большинстве других стран живая вакцина (на основе спор бескап сульного штамма B. anthracis Sterne 34F2 с адъювантом или без него) используется в ветеринарной практике. В России специфическую профилактику сибирской язвы у животных осуществляют препаратами, содержащими споры штаммов B. anthracis 55 ВНИИВВиМ или B. anthracis СТИ-1. Вакцина сибиреязвенная комбинированная сухая для подкожного применения разработана в ФГУ «33 ЦНИИ Минобороны России», получено несколько патентов РФ и сертификат на производство вакцины (Садовой Н.В. и др., 1998; Кожухов В.В. и др., 2002). Комбинированная вакцина состоит из спор вакцинного штамма
B. anthracis СТИ-1 и адсорбированного на геле гидроокиси алюминия культурально-го фильтрата штамма B. anthracis СТИ-1 (или B. anthracis 55), содержащего ПА. Препарат выпускается в жидкой форме и в виде лиофилизата, из которого готовится суспензия для подкожного введения. Рекомендовано однократное введение (Они-щенко Г.Г., Кожухов В.В., 2010).
Культивирование рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo
Стерильный культуральный фильтрат разводили в объемном соотношении 1:1 буфером, содержащим 50 ммоль раствора натрия хлорида, 25 ммоль диэтаноламина, 2 ммоль ЭДТА рН 8,9. Концентрацию проводили приблизительно в 20 раз путем фильтрации (оперативное давление около 250 кПа), применяя модуль Vivaflow 200 (Sartorius, Германия) с номинальной отсечкой по молекулярной массе 30 кДа. Предварительно проводили сборку фильтрационной установки, ее дезинфекцию и промывку. Диафильтрацию осуществляли на той же установке десятикратным объемом того же буфера, добавляя его в емкость с концентрируемым продуктом.
Дальнейшую очистку проводили на хроматографической системе BioLogic Duo FlowTM (Bio-Rad, США). Хроматографическую колонку 90 х 90 мм заполняли 100 мл смолы Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США), дегазировали и промывали равным объемом буфера, содержащего 1 моль раствора натрия хлорида. Затем колонку уравновешивали, пропуская со скоростью протока 10 мл/мин последовательно 10 объемов буфера, содержащего 25 ммоль диэтаноламина, 50 ммоль раствора натрия хлорида, 2 ммоль ЭДТА, pH 8,9 и 1 объем того же буфера с добавлением 30 ммоль раствора калия хлорида, pH 8,9. На колонку со смолой Macro Prep 50Q наносили сконцентрированный и диализованный культуральный фильтрат в объеме связывания смолы. Не связавшиеся с носителем белки (элюат) собирали. После чего смолу про 53 мывали буфером для диафильтрации, содержащим 30 ммоль раствора калия хлорида, в объеме, равном объему носителя. К элюату добавляли полученную пробу.
Полуфабрикат концентрировали в 10 раз как описано выше. Диафильтрацию осуществляли, последовательно используя: 10-кратный объема буфера, содержащего 50 ммоль раствора натрия хлорида, 25 ммоль диэтаноламина, 2 моль ЭДТА, рН 8,9 и 10-кратный объем буфера, содержащего 145 ммоль ацетата аммония, 2 ммоль ЭДТА, pH 10,0. После этого этапа препарат разливали по аликвотам и хранили при температуре минус 70 С.
На следующем этапе хроматографическую колонку 25 х 800 мм заполняли носителем для гель-фильтрации Sephacryl-HR300 (Bio-Rad, США) и уравновешивали 3 объемами буферного раствора, содержащего 0,1 моль основного триса, 1 ммоль ЭДТА, 50 ммоль раствора натрия хлорида, рН 8,0. Хроматографическую систему программировали на скорость протока 2 мл/мин. Препарат размораживали и наносили на колонку с носителем для гель-фильтрации порционно в объеме не более 3 % от объема геля. Концентрация белка в исходном препарате - не более 2,5 мг/мл. Контроль за выходом белков осуществляли спектрофотометрией (при длине волны 280 нм). Пробы, содержащие ПА, отбирали и после 10-15 циклов объединяли.
На последнем этапе осуществляли концентрирование ПА с использованием ультрафильтрационной мембраны Vivaflow 200 с номинальной отсечкой по молекулярной массе 30 кДа или с помощью концентраторов "Vivaspin-20" (Sartorius, Германия) с тем же диаметром пор. Препарат концентрировали приблизительно в 10 раз. Степень очистки ПА определяли по результатам электрофореза в денатурирующих условиях в 10 % полиакриламидном геле, концентрацию белка – по оптической плотности на спектрофотометре. Очищенный ПА хранили при температуре минус 70 С, лиофилизированный – при температуре от 0 до 8 С.
Выделение и очистка белка S-слоя ЕА1 из клеточных стенок реком-бинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo Выделение и очистку белка S-слоя ЕА1 из рекомбинантного штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- осуществляли по методике, предложенной А.Ю. Гончаровой (2007), с модификациями. Для выделения ЕА1 осажденную центрифугированием клеточную массу от мывали от остатков среды 0,85 % раствором хлорида натрия. 500 мл биомассы сме шивали с 50 мл экстрагирующего буфера, содержащего 5 ммоль триса-гидрохлорида, 1 % додецилсульфата натрия (SDS - sodium dodecyl sulfate), 5 ммоль 2-меркаптоэтанола. После чего прогревали на водяной бане при температуре 70 С в течение 30 минут, остужали и центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин и температуре 4 С.
Стерилизацию полученного супернатанта проводили на фильтрационной установке с использованием микрофильтрационной мембраны Vivaflow 200 с порогом отсечения 0,2 мкм при оперативном давлении около 250 кПа. Контроль специфической стерильности осуществляли путем высева по 0,1 мл на чашки с агаром Хоттин-гера и в пробирки с бульоном Хоттингера с последующей инкубацией при температуре 37 С.
На следующем этапе клеточный экстракт диафильтровали 10 объемами буфера, содержащего 0,1 моль триса-гидрохлорида, 2 ммоль ЭДТА, рН 8,0 с использованием модуля Vivaflow 200 с номинальной отсечкой по молекулярной массе 30 кДа. Полуфабрикат, содержащий ЕА1, сохраняли при температуре минус 70 С.
Очистку осуществляли на хроматографической системе BioLogic Duo FlowTM. Хроматографическую колонку 26 х 200 мм заполняли предварительно декантированным гидроксиапатитом (Sigma, США) и уравновешивали 10 свободными объемами буфера, содержащего 5 ммоль К2HPO4KH2PO4, рН 6,8, при скорости протока 10 мл/мин до регистрации стабильной базовой линии. Полуфабрикат размораживали и наносили на колонку. Используя 3 свободных объема колонки, создавали линейный градиент фосфата калия - от 0 до 1 моль К2HPO4KH2PO4. Контроль за выходом белков осуществляли спектрофотометрией (при длине волны 280 нм). Содержащие ЕА1 фракции отбирали и после 10-15 циклов очистки объединяли. Второй этап очистки проводили на том же носителе по аналогичной методике. Очищенный белок ЕА1 диафильтровали 10 объемами бидистиллированной воды при температуре 4 С с использованием модуля Vivaflow 200 (30 кДа). При необходимости препарат белка ЕА1 концентрировали, разливали по аликвотам и сохраняли при температуре минус 70 С, а после лиофилизации - при температуре 8 С.
Определение значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных животных
Полученные результаты, с одной стороны, подтверждают корректность оптимизированного метода синтеза и подлинность получаемых продуктов, с другой свидетельствуют о возможности иммунологической оценки на модели линейных мышей препаратов, содержащих в качестве иммуностимулятора CpG 2006. Важно, что замена коммерческих CpG-ОДН на синтезированные нами олигонуклеотидные последовательности с модифицированной основной цепью приводит к существенному экономическому эффекту (стоимость синтезированных CpG-ОДН в 6,8 раз меньше стоимости коммерческого адьюванта CpG 2006 (Invivogen, США)). В последующих гла 77 вах будут представлены результаты изучения адъюванта CpG-ОДН на макроорганизм. Сравнение эффективности препаратов, сочетающих рекомбинантный протективный антиген с одним из адъювантов: гидроокисью алюминия, монофосфорилированным липидом А и CpG-ОДН
Способность различных сочетаний рПА с адъювантами вызывать у лабораторных животных развитие адаптивного иммунного ответа в условиях однократной и двукратной иммунизации изучали на модели мышей линии BALB/c. В первом случае лабораторных животных иммунизировали однократно рПА с альгирогелем, MPL или CpG. В данном эксперименте MPL использовали в комбинации с дикориномикола-том трегалозы и скваленом (Sigma adjuvant system). Содержание рПА в одной дозе препарата составило 10 мкг, Sigma adjuvant system - 25 мкг, адъювант CpG 2006 добавляли из расчета 10 мкг на дозу. Для сравнения одну группу мышей иммунизировали одноратно вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1 в дозе 2 106 спор. Заражение тест-штаммом B. anthracis 71/12 (2-ая вакцина Ценковского) осуществляли на 21 сутки, использовали 4 заражающие дозы. В результате в группах мышей, иммунизированных рПА с MPL в составе Sigma adjuvant system, а также рПА с CpG 2006, зафиксировали одинаковые значения ЛД50 тест-заражающего штамма - 7,9 104 (15849501187) спор. Защищающая способность рПА, адсорбированного на альгид-рогеле, оказалась несколько ниже - 3,1 104 (7943501187) спор (рисунок 8).
Значения ЛД50 тест-штамма для мышей линии BALB/с, иммунизированных: 1 – рПА + CpG 2006; 2 - рПА + MPL; 3 - рПА + альгидрогель. Рисунок 8 - Сравнение протективной активности препаратов, содержащих рПА и различные адъюванты В группе мышей, иммунизированных однократно вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1, в поствацинальный период (до заражения штаммом В. anthracis 71/12) пало 2 особи (при вскрытии из крови и органов выделили кууль-туру В. anthracis ). Значение ЛД50 тест-заражающего штамма составило 3,1 104 (6310-158489)спор.
Проведенные ранее эксперименты на различных биологических моделях показали, что рПА обеспечивает оптимальную защиту при условии двукратного введения препарата (Попова П.Ю., 2012). На модели мышей линии BALB/c значение ЛД50 равное 7,9 104 (15849501187) спор отмечали в случае двукратной иммунизации рПА в сочетании с адъювантом Фрейнда (Попова П.Ю., 2012). В нашем исследовании двукратную схему иммунизации использовали, тестируя протективную активность рПА в сочетании с MPL (без дикориномиколата трегалозы и сквалена). Эффективность MPL оценивали в сравнении с полным адъювантом Фрейнда. Линейных мышей иммунизировали с интервалом в 2 недели. Полный адъювант Фрейнда использовали с рПА в объемном соотношении 1:1. Содержание рПА и MPL в препаратах составило 10 и 5 мкг, соответственно. На 21 сутки от последней иммунизации линейных мышей обеих групп заражали возрастающими дозами тест-штамм В. anthracis 71/12 (2-ая вакцина Ценковского). В результате при двукратной иммунизации рПА с MPL значение ЛД5о тест-заражающего штамма было 1,3 105 (317732004749) спор, а в случае иммунизации рПА с адъювантом Фрейнда в 4,6 раза меньше - 2,8 104 (5650178673) спор (рисунок 9).
Полученные результаты оценки протективности препаратов, представляющих собой сочетание рПА с адъювантами различных классов, коррелировали с данными, полученными при исследовании их влияния на экспрессию TLR, и указывали на преимущество MPL и CpG 2006. Защита лабораторных животных от заражения тест-штаммом В. anthracis 71/12, даже при однократной иммунизации рПА с тестируемыми адъювантами, была адекватна протективности вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1. В отличие от иммунизации сибиреязвенным штаммом иммунизация рПА с любым из адъювантов ни в одном эксперименте не приводила к гибели биомоделей.
Иммунологическая эффективность сочетания рекомбинантного протективного антигена с различными вариантами синтезированных CpG-ОДН
Как было определено выше, в качестве единого источника иммуногенных сибиреязвенных антигенов – рПА и ЕА1, использовали безопасный и высокоэффективный штамм-продуцент B. anthracis 55TПА-1Spo-. Выделение рПА осуществляли из стерильного культурального фильтрата, а белок ЕА1 экстрагировали из части концентрированной биомассы. Подробно этапы получения иммуногенных сибиреязвенных антигенов описаны в главах 2 и 3.
Используемые в качестве адъюванта последовательности CpG 2006 были синтезированы на автоматическом синтезаторе ДНК «АSМ-800» (Биоссет, Россия). Концентрация синтезированного продукта составила 48,39 ОЕ/мл или 1,6 мг/мл. Учет результатов электрофореза в 20 % полиакриламидном геле в денатурирующих условиях показал отличие окраски тиофосфорильных олигонуклеотидов от стандартных, что являлось подтверждением тиомодификации CpG-мотивов.
На следующем этапе осуществляли сведение компонентов вакцины. Компоненты вакцины смешивали таким образом, чтобы на 1 мг очищенного рПА приходилось 500 мкг белка ЕА1, 4 мг CpG 2006, 0,001 % формальдегида. Полуфабрикат стерилизовали через стерилизующие фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. В качестве криопротекторов использовали комбинацию 1 % сахарозы и 3 % глицина. Фасовку препарата в объеме 100 мл проводили с использованием автоматического дозатора во флаконы вместимостью 10 мл. В каждый флакон вносили по 2,5 см3 препарата. Данный объем эквивалентен 5 человеко-дозам. Одна человеко-доза прототипа вакцины для подкожного введения содержит в объеме 0,5 см3 (50 ± 2) мкг рПА, (25 ± 2) мкг белка ЕА1, (0,2 ± 0,05) мг CpG 2006, (5 ± 0,5) мг сахарозы, (15 ± 2) мг глицина и (0,001 ± 0,0005) % формальдегида.
Лиофильное высушивание препаратов проводили с максимальной температурой замораживания минус 40 С. Процесс высушивания - от температуры замораживания до температуры 28 С. Таким образом, определена технологическая схема получения прототипа вакцины сибиреязвенной химической (рисунок 29). Производство лицензированной жи 109 вой сибиреязвенной вакцины занимает около недели рабочего времени. Это связано с необходимостью получения споровой культуры вакцинного штамма. Процесс изготовления химической вакцины сложнее, но не более продолжителен. Его можно разбить на этапы, разорванные во временном отношении, без потери качества и эффективности вакцины. Очищенные антигены, произведенные по правилам GMP, могут храниться в лиофилизированном состоянии. При экстренной потребности в вакцине для ее выпуска выполняются только этапы сведения компонентов, стерилизации, лиофилизации и тестирования.
По разработанной технологии из 1 л исходной культуры можно получить как минимум 2000 человеко-доз препарата.
Визуально лиофилизированный препарат прототипа вакцины сибиреязвенной химической представляет собой пористую массу в виде таблетки молочно-белого цвета (рисунок 30). Содержимое флакона растворяется в течение 30 секунд в 0,9 % растворе натрия хлорида при встряхивании. Растворенный препарат - прозрачная жидкость без посторонних примесей и хлопьев, свободно проходит в шприц через иглу № 0840, рН - 7,2. Потеря массы при высушивании – не более 2 %.
В соответствии с требованиями к иммунобиологическим препаратам прототип вакцины сибиреязвенной химической тестировали на аномальную токсичность. Для этого белым аутбредным мышам вводили внутрибрюшинно 1 человеко-дозу, что соответствуют 5 дозам, определенным для этого вида лабораторных животных. Морским свинкам вводили подкожно 1 человеко-дозу, что эквивалентно 2 дозам для данной биомодели. В течение 7 суток проводили осмотр и взвешивание. Все животные остались живы, ни у одного не было выявлено видимых признаков интоксикации, масса тела в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной, за время наблюдения отмечен естественный прирост массы тела мышей и морских свинок. В месте введения препарата ни у одной биомодели не отмечали изъязвлений, абсцессов, некрозов, выраженного отека окружающей клетчатки и кровоизлияний.