Введение к работе
Актуальность проблемы. Последнее десятилетие XX века характеризуется появлением возвращающихся инфекций (re-emerging infection), среди которых значительный удельный вес занимают риккетсиозы (N. V. Rudacov et al. 1997).
Риккетсиозы являются важной проблемой инфекционной патолоппі всех стран мира, в том числе России и стран СНГ' (Цой Д. Ч., Рапопорт, 1995; Abramson М.А., Sexton D.J., 1995; Dupont Т.Н. et al., 1995: Rehacek J., 1996; Tarasevich et al, 1991; Walker D.H., 1996; Kazar J., 1996; Klimchuk N. D., 1996; Raoult D., Dupont H.T., 1993).
По материалам официальной статистики и данным литературы, в России отмечается увелігчение уровня заболеваемости следующими риккетсио-зами: эпидемическим сыпным тифом, клещевым риккетсиозом Северной Азии, Астраханской пятнистой лихорадкой, коксиеллезом, т.е. инфекциями, имеющими тенденцию к эпидемическому распространению (Конькова С.А. и соавт., 1994, Тарасевич И. В. и соавт., 1990; Тарасевич И. В. и соавт., 1995; Dodonov М. М. et al., 1990; Eremeeva М. Е. et al., 1994; Rudakov N.V., 1996; Tarasevich I. V. et al., 1997).
Создавшаяся эпидемическая ситуация по сыпному тифу, осложненная массовой миграцией населения, ухудшением социально-экономических условий его жизни и ростом педикулеза (Фролова А.И., 1997), требуют повышения эффективности эпиднадзора за указанным риккетсиозом (Абдуллаев Ф.А. и соавт., 1994; Додонов М.М., 1991; Лукин Е.П., 1996; Паутов В.Н., 1994; Tarasevich I. V., 1996).
Значительно возросла заболеваемость риккетсиозами группы клещевой пятнистой лихорадки. На территории России появились ранее неизвестные очаги Астраханской пятнистой лихорадки (Tarasevich I.V. et al., 1991, 1997; Лукин Е.П. и соавт., 1996).
На 650% по сравнению с 1979 г. увеличилась заболеваемость клещевым риккетсиозом Северной Азии (Рудаков Н.В. 1995; Rudakov N. V. et al., 1997).
Активизируются очаги коксиеллеза, которые выявлены в 37 регионах России (Рудаков Н.В., 1995; Токаревич Н.К., 1997; Rudakov N, V., 1996).
Исходя из этого, важную роль в повышении эффективности эпидемического надзора и совершенствовании предупредительных мероприятий в отношении сыпнотифозной инфекции, клещевого риккетсиоза и коксиеллеза играет уровень их клинической и эпидемиологической диагностики.
Следует подчеркнуть, что диагностика вышеперечисленных риккет-сиозов в современных условиях значительно затруднена в силу мозаичностн их клинических проявлений и увеличении числа стертых и бессимптомных форм инфекции.
В этой ситуации первостепенное значение приобретают серологические методы исследования, являющиеся единственными надежными критериями доказательства риккетсиозной природы инфекции, позволяющие изучать напряженность иммунного ответа, осуществлять межвидовую дифференциальную диагностику и оценивать иммунологическую структуру населения с целью их прогнозирования (Додонов М.М., 1991; Конькова С.А. и соавт., 1994; Лукин Е.П. и соавт., 1996; Рудаков Н.В., 1994; Ястребов В.К., 1995; Wisseman С. Н., 1973).
Создание и использование в практике конкурентноспособных диагностических препаратов по распознаванию риккетсиозов следует рассматривать как один из решающих факторов, которые определяют своевременность и эффективность всего комплекса необходимых противоэпидемических мероприятий на территории России и сопредельных государств (Додонов М. М. и соавт., 1994; Рудаков Н.В. и соавт., 1994; Фетисова Н.Ф. и соавт., 1994; Хазова Т.Г. и соавт., 1996; Tarasevich I.V., 1996).
Следует подчеркнуть, что существующие эмпирически созданные в 40-50 годы диагностические препараты на основе интактных клеток и их экстрактов в современных условиях далеко не всегда удовлетворяют нужды практики, так как обладают недостаточной чувствительностью, неоднородны по своему составу и содержат значительное количество компонентов среды культивирования, что является одной из причин появления неспецифических реакций при применении диагностических препаратов.
В настоящее время практическое здравоохранение испытывает острую необходимость в высокоспецифичных и активных препаратах для диагностики клещевого риккетсиозов Северной Азии, Астраханской пятнистой лихорадки.
Еще острее обстоит вопрос с серодиагностикой коксиеллеза, для распознавания которого отсутствует коммерческий выпуск диагностических препаратов.
В этой связи актуальной задачей является разработка на основе поверхностных белковых антигенов препаратов нового класса, пригодных для диагностики риккетсиозов группы сыпного тифа, группы клещевой пятнистой лихорадки, коксиеллеза в современных условиях.
Определенные перспективы в этом направлении открывают успехи молекулярной биологии по изучению антигенных структур риккетсии (Amano К. et al., 1995; Anacker R.H. et al., 1986; Eremeeva M. E. et al., 1996; Toman R, 1996; Weiss E., 1987; Yu X. et al., 1990).
Установлено, что поверхностные белковые структуры риккетсии и основной белок 1 R. prowazekii обладают выраженной иммуногенностью и протективной активностью, что определило использование их в качестве кандидатов в вакцины (Голиневич Е.М., 1976; Лукин и соавт., 1967; Еремеева М.Е., 1990; Dasch G.A., 1981; Dasch G.A. et al., 1984; Dasch G.A. et al., 1985).
Оценивая общую направленность работ, посвященных изучению поверхностных белковых антигенов риккегсий в качестве диагностических препаратов, следует отметить, что они до сего времени носили аналитический характер и не вышли за рамки экспериментальных лабораторных исследований (Зезеров Е.Г. и соавт.. 1986; Логинов B.C. и соавт., 1982; Лукин Е.П. и Воробьев А.А., 1967; Beati L., Raoult D., 1996; Walker D. H., DaschG.A., 1995; Walker D.H., 1996; Weiss E. etal., 1987).
В литературе мы не встретили данных, касающихся производства препаратов на основе поверхностных белков риккетсий для диагностики рик-кетсиозов.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Выделение и характеристика функциональных свойств поверхностных белковых антигенов R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica, С. burnetii и создание на их основе препаратов для диагностики и профилактики риккетсиозов.
Основные задачи исследования
-
Разработка технологии получения риккетсий, которые сохраняли бы основные антигенные структуры нативной риккетсиальной клетки и не содержали компонентов среды культивирования.
-
Разработка методики выделения поверхностных белковых антигенов риккетсий (периферических, мембранных и пидоспецифических) и сравнительный их иммунохнмический анализ.
3. Изучение гемосенсибилизирующих свойств поверхностных белко
вых антигенов, конструирование антигенных эритроцитарных диагности-
кумов и сравнительная оценка их активности и специфичности, диагности
ческой ценности.
4. Изучение сорбционных свойств поверхностных белковых антигенов
и разработка на основе альтернативного антигена и аффинноочищенных
Р(аЬ)2-фрагментов антител против иммуноглобулинов человека иммуно-
ферментной тест-системы для выявления антител к R.prowazekii, R.typhi,
R.sibirica.
5. Сравнительная оценка возможности использования поверхностных
белковых антигенов и Fab и Р(аЬ)2-фрагментов специфических антител
разной видовой принадлежности в ИФМА и разработка на ігх основе им-
мунофлуорометрической тест-системы для определения риккетсий (R.
prowazekii, R. sibirica, С. burnetii).
6. Изучение возможности использования полученных антигенов в ка
честве инактивированной комбинированной сыпнотифозной вакцины. Оцен
ка иммуногенных, протективных и реактогенных свойств вакцины.
Научная новизна исследований
1. Впервые разработана безэфирная технология получения инактиви-рованных риккетсий (R. prowazekii. R. typhi, R. sibirica. С. burnetii), обеспечивающая получение антигенов, максимально очищенных от компонентов среды культивирования и сохранивших основные полииентиды, характерные для нативной клетки. Оригинальная технология основана на сочетанием использовании мембранной фильтрации и дифференциального центрифугирования. Новизна проведенных исследований подтверждена патентом № 2062110 "Способ получения диагностикума риккетсиального Провачека корпускулярного" и положительным решением о выдаче патента № 94-020953/14 ( 020722) "Способ получения диагностикума риккетсиального си-бирика корпускулярного".
При изучении методами электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга зафиксировано наличие 6 основных полипептидов наружной мембраны, из которых специфической активностью обладали полипептиды с молекулярной массой 94 и 31 кДа.
, 2..Впервые разработана методика получения видоспецифических антигенов R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica R.ASF. С помощью электрофореза в ПААГ в них идентифицированы полипептиды с молекулярной массой 135 и 94 кДа, специфическая активность которых подтверждена в иммуноблоттин-ге.
3. Установлена высокая гемосенсибилизирующая активность видоспе
цифических антигенов, определившая возможность их использования в каче
стве сенситина для конструирования видоспецифических АЭД с целью обна
ружения специфических риккетсиозных антител.
Впервые с помощью разработанных ВАЭД показана возможность проведения межвидовой дифференциации риккетсиозных сывороток в РИГА.
Новизна проведенных исследований подтверждена патентом №2062111 "Способ получения диагностикума эритроцитарного сыпнотифозного антигенного сухого".
-
Впервые определена возможность конструирования иммунофлуоро-метрической тест-системы с использованием оригинальных риккетсиальных антигенов (R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica ) и Р(аЬ)2-фрагментов соответствующих им специфических иммуноглобулинов кролика, а также Fab-фрагментов специфических антител лошади, меченных хлоридом европия. Показана перспективность ее использования для определения антигенов риккетсий. Результаты исследований легли в основу разработки технологии на получение данной тест-системы и оформления НТД. Проведена наработка 3-х экспериментально-производственных серий.
-
Впервые экспериментально обосновано создание иммуноферментной тест-системы для определения специфических антител к риккетсиям группы сыпного тифа и группы клещевой пятнистой лихорадки. В основу ее конст-
рупрования положены оригинальные антигены и индикаторные аффинно-очищенные Р(аЬ);-фрагменты антител против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена. На препарат разработана Н'І Д и приготовлены экспериментально-производственные серии тест-системы.
-
Отработаны схемы иммунизации по получению антириккетсиальных и антивидовых (против иммуноглобулинов человека и кролика) сывороток на лошадях. Показана возможность их использования в качестве диагности-ческігх сывороток, а также для изоляции и приготовления индикаторных Fab-Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулинов, меченных изотиоцианатом флуо-ресцеина или хлоридом европия (авторские свидетельства № 1503509, приоритет от 3 августа 1987 г. и №»1519369, приоритет от 30 марта 1987 г.). Применение моно- и бивалентных фрагментов иммуноглобулинов в таких высокочувствительных тестах как ИФА и ИФМА позволило значительно повысить специфичность указанных методов.
-
Разработана методика приготовления простого в использовании иммуносорбента для удаления неспецифических примесей из исследуемых биоматериалов на основе геля гидрокиси алюминия и белковых лигандов ,иммобилизованных на носителе с помощью поперечно-сшивающих реагентов. Показано, что данный иммуносорбент обеспечивает полное освобождение от перекрестно- реагирующих примесей и нежелательных компонентов, повышая тем самым специфичность иммунореагента.
8. Впервые для оценки качества полученных антивидовых сывороток
(сывороток против иммуноглобулинов человека, лошади, кролика) использо
ваны "корпускуляризованные" антигены, представляющие собой формали-
низировашше и танизированные эритроциты барана, нагруженные соответ
ствующими видами иммуноглобулинов. Показана высокая активность и
специфичность разработанных тест-антигенов в непрямом МФА.
9. Впервые в эксперименте показано, что полученные корпускулярные
антигены R. prowazekii в сочетании с поверхностным белковым антиге
ном риккетсий обладают выраженными протективными, иммуногепными
свойствами и низкой реактогенностью.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Корпускулярные аіггигеньї риккетсий, полученные по оригинальной технологии, сохраняют основные антигенные структуры на уровне нативнои риккетсиальной клетки и максимально очищены от компонентов среды культивирования. Новая технология является унифицированной, так как пригодна для получения антигенов различных видов риккетсий (R. prowazekii, R.typhi, R. sibirica, R. ASF, C. burnetii). Разработанная технология обеспечивает больший (в 4-16 раз) выход антигенов, чем регламентированная технология.
2.. Поверхностные белковые антигены риккетспй характеризуются высокой антигенной п гемосенсибиличирующей способностью. Установлено, что из изученных сенснтинов только видоспецифические антигены обеспечивают возможность проведения абсолютной межвидовой дифференциации риккетсиозных сывороток в РИГА.
-
Конструирование иммунофлуорометрических тест-систем с использованием оригинальных поверхностных белковых антигенов, специфических Р(аЬ)2-фрагментов и индикаторных, меченых европием, специфических Fab-фрагментов иммуноглобулинов позволяет не только повысить качество нового метода иммуноанализа, но и разработать эффективные средства для ранней диагностики (выявление риккетсий и ігх антигенов) и слежения за риккетсиозами.
-
Метод элиминации нежелательных примесей из антигенов с помощью иммуносорбента, носителем в котором является гель гидрокиси алюминия, лигандом - перекрестно - реагирующий иммуноглобулин, иммобилизованный на носителе с помощью поперечно-сшивающих реагентов.
-
Реализация высокой активности и специфичности иммунофермент-ного анализа возможна при условии применения видоспецифических белковых антигенов риккетсий для сорбции на планшеты, а в качестве индикаторного иммунореагента - аффинноочишенных Р(аЬ)2-фрагментов антител. Созданные по этой технологии иммуноферментные тест-системы позволяют осуществлять дифференциальную межвидовую диагностику риккетсиозов.
-
Целесообразность использования для конструирования инактивиро-ванной сыпнотифозной вакцины комбинации корпускулярного антигена и растворимого белкового антигена R. prowazekii.
Практическая значимость работы и внедрение в практику
Предложена унифицированная ресурсосберегающая технология получения риккетсиальных антигенов (R. prowazekii, R. typhi, R. sibirica, С. burnetii), обеспечивающая не только увеличение выхода препарата, но и улучшающая санитарно-гигиенический мониторинг производственных помещений.
Разработан метод повышения видоспецифической дифференцирующей активности риккетсиальных антигенов с применением исключающей иммунсорбции.
. . На основе поверхностных белковых антигенов разработаны технологии получения видоспецифических эритроцитарных диагностикумов, иммунофлуорометрических тест-систем, иммуноферментных тест-систем.
Разработано 6 новых диагностических препаратов, из которых два внедрены в производство и проводится их выпуск для практического здравоохранения. Создана нормативно-техническая документация на препараты, технология производства которых обоснована настоящими исследованиями:
-
Экспериментально-производственный регламент №401-92 на "Диагностикам риккетспозный Провачека корпускулярный сухой для РСК. РНАг,МФА."
-
Экспериментально-производственный регламент №400-92 на " Диагностику эритроцитарный антигенный сыпнотифозный сухой для РИГА"
-
Иммуноферментная тест -система для выявления антител к риккет-сиям группы сыпного тифа (находится на рассмотрении в ГИСК им. Л. А. Тарасевича)
-
Иммуноферментная тест-система для выявления антител к риккетси-ям группы клещевой пятнистой лихорадки ( находится на рассмотрении в ГИСК им. Л.А. Тарасевігча )
-
Иммунофлуорометрігческая тест-система для индикации риккетсий группы сыпного тифа (утверждена Генеральным директором НПО "Биомед", протокол № 2 от 11 ноября 1991 г.
-
Иммунофлуорометрическая тест-система для индикации риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки ( утверждена Генеральным директором НПО " Биомед", протокол №2 от 11 ноября 1991 г.
Полученные в процессе исследований материалы использованы при составлении соответствующих разделов методических рекомендаций "Серологические методы диагностики риккетсиозов" М., 1988 г., утвержденные МЗ СССР в декабре 1987 г.
Апробация работы
Материалы исследований доложеїш и обсуждены на:
республиканской научной конференции "Перспективы использования физико-химического анализа для разработки технологических процессов и методов аналитического контроля химическігх и фармацевтических производств" (Пермь, 1985);
пленарных заседаниях Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов ( 1985 );
научных конференциях Пермского НИИ вакцин и сывороток (1983, 1984,1988, 1990,1991);
Всесоюзных конференциях по риккетсиозам (Москва 1985, 1989, 1995);
конференции Всесоюзного научного медико-технического общества "Естественные науки - здравоохранению" (Пермь, 1987);
на научной конференции "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии" (Томск, 1991);
международном симпозиуме "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине" (Уфа, 1995);
- международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Пермь. 1996):
Диссертация прошла экспертизу и апробирована на заседании Научно-технического совета Пермского НПО " Биомед".
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 34 научных работах, в том числе одной монографии (в соавторстве) и в 5 авторских свидетельствах и патентах.
Структура и объем диссертации