Введение к работе
Актуальность темы
К концу ХХ-ого века в силу изменения экологической обстановки и условий жизни людей значительную роль в структуре инфекционной патологии стали играть возбудители оппортунистически» "гг*:_^.,«. такие *»« іігІСііл яопп»»»^1.'лс5, Letriort'!la pneumophz /a, Klebsiella aerogenes, Pseudomonas aeroginosa и др.
С начала 80-х было зарегистрировано несколько крупных вспишск листериоза с высоким процентом смертности. В связи с этим резко усилился интерес к изучению механизмов патогенности возбудителя лнстерноэа С monocytogenes.
Одним из факторов патогенности листернй является фосфатидн-линоэитол-специфнчная фосфолнпаза С (PI-PLC). Листериоэная PI-PLC принадлежит к семейству бактериальных секретируеиых фосфолипаэ, специфичных к липиду эукарнотнческой иеибраны фосфатидилинозитолу. Високий процент гомологии и сходство функционирования этих ферментов с эукариотнческиын фосфолнпазами привели к предположению о возможной имитации бактериальными фосфолипаэами дейстпия эукарио-тических (Ixezaws, 1936). Эукарнотнческке фосфолнпазы, как было установлено в начале 80-х, являются ключевыми ферментами в регуляции многих внутриклеточных процессов эукариот. Продуцируя собственные еосфолипаэы, бактерия могла би изменять метаболизм эук»-риоіической клетки в нужном для себя направлении, например, ннгн-бкруя бактерицидный отпет, приспосабливая обмен веществ эукарнотнческой клетки к метаболическим потребностям бактерии и тому подобным образом.
Мутанти L.monocytogenes, дефектные по гену PI-PLC рІсЛ демонстрирует пониженную вирулентность. Это свидетельствует о необ-
ходимости PI-PLC для полного проявления вирулентных свойств лис-терий. С другой стороны было показано, что ген PI-PLC plcA присутствует только у патогенных представителей рода Listeria, что делает его потенциальный маркером для дифференциации патогенных к непатогенных листернй.
Таким образом,-изучение PI-PLC L.monocytogenes имеет как глубокий научный интерес, так и практическое значение.
Пель и задачи исследования
Цель» работы было изучение . экспрессии клонированного гена фосфатидилиноэитол-спецнфичной фосфолипазы С {PI-PLC) L,monocytogenes в S.col і, и возможности использования PI-PLC и ее гена в качестве аидоспецифических маркеров.
Для достижения згой цели были поставлены следующий задачиt
клонирование гена PI-PLC р/сД в В.сої І и конструирование рекомбинантных плазмнд, необходимых для изучения его экспрессии!
сравнение уровня экспрессии гена рісА в В.сої і из-под собственного н гетерологичного промоторов;
получение иммунореактивного рекомбинантного белка, на основе создания гибридного белка, Protein A :: PI-PLC
получение мокоспецифической антисыворотки к PI-PLC]
скрининг коллекции штаммов L.monocytogenes на предмет изучения продукции ими PI-PLC;
разработка системы для выявления I.monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции;
-апробация разработанной системы в условиях экспериментального заражения мишей.
Научная новизна работц
В результате изучения клонированного гена PI-PLC t.monocytogenes plcA детально исследованы процессы его транскрипции н трансляции в E.coli.
Создана оригинальная геннч» --оасхру»"»ч jибоилини ген
sua:tрісл, S'-kohb'j soToporo представляет собой фрагмент гена зра Белка A (Protein A) S. aureus, а З'-конец - геи PI-PLC plcA.
Показано, что Гибридный белок Protein A::PI-PLC эхспрессиру-ется в E.coli в виде полноразмерного продукта. Разработана технология очистки гибридного белка Protein A :: PI-PLC.
Установлено, что поликлональная антисыворотка к гибридному белку Protein А :: PI-PLC способна выявлять иатнвкую PI-PLC, что свидетельствует о той, что входя в состав гибридного белк.а, PI-PLC сохраняет, по крайней мере частично, антигенные детерминанты и, следовательно, нативную конформацию.
Впервые установлен факт наличия значительных вариаций в уровне экспрессии PI-PLC разными жтаммами L.monocytogenes.
Практическую значимость работы составляет создание амплифи-кацнонных систем для выявления I.monocytogenes, основанных на последовательностях генов PI-PLC plcA и листериолнэина Л1у. Обе системы являются видоспецифнчными и высокочувствительными. Чувствительность системи на основе гена plcA достигает 1000 клеток в образце, чувствительность системы на основе гена Ыу колеблется между 10 и 100 клетками в образце. Разработана методика, позволяющая выявлять L.monocytogenes с помощью анплнфикационных систем в тканях животных.
Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела - Медицинской Микробиологии НИИЭМ ни.Н.Ф.Гамалеи
РАМН (16 нюня 1994г.) По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции по проблемам листериоза (1993г., Покров), на VIконференция "Новые направления в биотехнологии" (1994г., Пуцино).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста м иллюстрирована 20-м рисунками и 5-м таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований к их обсуждения, выводов м списка лите» ратуры, включающего 100 источников.
Работа выполнена на базе лабораторий легмонеллеза (руководитель - доктор биологических наук И.С.ТартаковскиА) и лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов (руководитель -доктор биологических наук А.Л.Гинцбург).