Введение к работе
Актуальность темы
К концу ХХ-ого веса в силу изменения экологической обстановки и условий жизни людей значительную роль в структуре инфекционной патологии стал* играть возбудители оппортунистических инфекций, такие как Listeria monocytogenes, Legionella pncvmophila, Klebsiella aerogenes, Pseudomonas aeroginosa и др.
С начала 80-х было зарегистрировано несколько крупных вспышек лнетериоза с высокий процентом смертности. В связи с этим резко усилился интерес к изучению механизмов патогенности возбудителя лнетериоза L. monocytogenes.
Одним из факторов патогенности листерий является фосфатидн-линозитол-специфичная фосфолипаэа С (PI-PLC). Лнстерноэная PI-PLC принадлежит к семейству бактериальных секретируеыых фосфолипаэ, специфичных к липиду эукариотической мембраны фосфатидилинозитолу, Высокий процент гомологии и сходство функционирования этих ферментов с эукариотическими фосфолипазами привели к предположению о возможной имитации бактериальными фосфолипазами действия эукарио-тических (Ikezawa, 198S). Эукарнотические фосфолипазы, как было установлено в начале 80-х, являются ключевыми ферментами в регуляции многих внутриклеточных процессов эукариот. Продуцируя собс-твенные фосфолипазы, бактерия могла бы изменять ыетаболнэн эукариотической клетки в нужном для себя направлении, например, ннгн-бируя бактерицидный ответ, приспосабливая обмен вецеств эукариотической клетки к метаболическим потребностям бактерии и тому подобным образом.
Мутанты L.monocytogenes, дефектные по гену PI-PLC plcA демонстрируют пониженную вирулентность. Это свидетельствует о необ-
ходниостн PI-PLC для полного проявления вирулентных свойств лис-терий. С другой стороны было показано, что ген PI-PLC plcA присутствует только у патогенных представителей рода Listeria, что делает его потенциальныы маркерои для дифференциации патогенных и иепатогенных лнстернй.
Таким образом, изучение PI-PLC L.monocytogenes имеет как глубокий научный интерес, так и практическое значение. Пель и задачи исследования
Целы» работы было изучение экспрессии клонированного гена фосфатидилиноэктол-специфичнои фосфолипаэы С (PI-PLC) L,monocytogenes в Е.соН, и возможности использования PI-PLC н ее гена в качестве видоспецифическнх маркеров.
Для достижения этой цели были поставлены следующий задачи:
клонирование гена PI-PLC plcA в Е.соН м конструирование рекоыбииантних плаэмнд, необходимых для изучения его экспрессии;
сравнение уровня экспрессии гена plcA в Е.соН из-под собственного и гетерологичного промоторов;
получение ішмунореактнвного рекоибинантпого белка, на основе создания гибридного белка, Protein A :: PI-PLC
получение ыоноспецифической антисыворотки к PI-PLC)
скрининг коллекции отаимов L.monocytogenes на предмет изучения продукции ими PI-PLC;
разработка системы для выявления L.monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции; -
-апробация разработанной системы в условиях экспериментального заражения мышей.
Научная новизна работы
В результате изучения клонированного гена PI-PLC L.monocytogenes plcA детально исследованы процессы его транскрипции и трансляции в E.coli.
Создана оригинальная генная конструкция - гибридный ген spa:: plcA, S'-конец которого представляет собой фрагмент гена зра Белка A (Piotein A) S.aureus, а Э'-конец - ген PI-PLC plcA.
Показано, что гибридный белок Protein A::PI-PLC эахпрессиру-ется в E.coli в виде полноразыерного продукта. Разработана технология очистки гибридного белка Protein A :: PI-PLC.
Установлено, что поликлональная антнеыворотка к гибридному белку Protein А :: PI-PLC способна выявлять натнвную PI-PLC, что свидетельствует о том, что входя в состав гибридного белк,а, PI-PLC сохраняет, по крайней мере частично, антигенные детерминанты и, следовательно, натнвную коифорыацкп.
Впервые установлен факт наличия значительных вариаций в уровне экспрессии PI-PLC разными ятаммаик L.monocytogenes.
Практическую значимость работы составляет создание аиплнфк-кационных систем для выявления L.monocytogenes, основанных на последовательностях генов PI-PLC plcA и листернолнэнна Ыу. Обе системы являются вндоспецифичныин и высокочувствительными. Чувствительность системы на основе гена plcA достигает 1000 клеток в образце, чувствительность системы на ооюве гена Ыу колеблется мехду 10 и 100 клетками в образце. Разработана методика, позволяющая выявлять t.uionocyrogefles с помощь» аиплнфикациотшх систем в тканях животных.
Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела Медицинской Микробиологии НИИЭМ им.Н.Ф.Гаыален
РАМН (16 нюня 1994г.) По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции по проблемам листериоза (1993г.» Покров), на VIконференции "Новые направления о биотехнологии" (1994г., Пуцино).
Объем к структура диссертации,. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста и иллюстрирована 20-м рисунками и 5-ю таблицами. Состоит иэ введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и мх обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 100 источников.
Работа выполнена на базе лабораторий легионеллеза (руководитель - доктор биологических наук И.С.Тартаковский) н лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов (руководитель -доктор биологических неук А.Л.Гинцбург).