Введение к работе
Актуальность ^облемы. Послеиние 30 лет метанохисляющие бактерии (метанотрофы) являются предметом изучения большого числа исследователей во всем мире. Это обусловлено целым рявом причин. Во-первых, метанокислящие бактерии играют важну» роль в круговороте углерова в биосфере Земли» так как значительная часть биогенного и абиогенного метана превращается в органические вещества и СО> в результате их жизнедеятельности; они также способны фиксировать молекулярный азот. Во-вторых, метаноки-сляющие бактерии облаватт специфическими особенностями метаболизма: облкгатной зависимостью от метана (и в некоторых; случаях от метанола),как источника углерова и энергии; мног-tte зкэоген-ные органические вещества, являющиеся нормальными метаболитами клетки, подавляют их рост; отсутствует субстратная специфичность ключевых ферментов окисления метана, а также некоторыми другими. Большой интерес метанокисляющие бактерии представляют также в связи с возможностью их применения в биотехнология для получения кормового белка, полисахаридов, пигментов и крутих биологически активных провуктов из метана.
Понимание роли любого микроорганизма в природных экосистемах, а также использование его в биотехнологии невозможно без изучения путей метаболизма к их регуляции. За последние говы в исследованиях физиологии и биохимии метанокисляющих бактерия достигнуты значительные успехи. Овнако отсутствуют систематические работы по изучению генетики ванной группы бактерий. Так,во сир пор не разработаны метовы мутагенеза, селекции широкого спектра мутантов, не созданы системы переноса генетической ннформа-и клонирования генов в клетках метанокисляющих бактерий.
НАУЧидя БИБЛИОТЕКА 1
Mo»t. оалиснохоз. академчи I
у*,;, И. А.«Тимирязева |
Цель и задачи исследования. Целью панной работы было изучение генетической изменчивости метанотрофов, действия на них ряда мутагенов, систем генетической рекомбинации и обмена генов, а также возможности клонирования генов в гетерологичных хозяевах.
Для решения этих проблем были поставлены следующие задачи: изучить спонтанну» и индуцированную мутагенами генетическую изменчивость ряда штаммов метанокисляющих бактерий; исследовать их плазмиды; изучить возможность использования плаэмив с широким кругом бактериальных хозяев в качестве систем генетического обмена у метанокисляющих бактерий; выяснить возможность молекулярного клонирования и экспрессии генов метанокисляюищх бактерий в клетках гетерологичных хозяев <в частности гесА -покойного гена).
Работа выполнена в отделе биологии гаэокисляющих микроорганизмов Йіститута микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР. Работа по созданию банка генов Methyloeoccus ther-mojtolue была провезена в лаборатории генетики иетклотрофных микроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Минмевбиопрома СССР.
Научная новизна. Изучена спонтанная изменчивость ряда признаков у нескольких штаммов метанокисляющих бактерий. Впервые показано, что ультрафиолетовое (УФ) излучение и нитроз огуанивин (НГ) оказывают мутагенное действие на клетки метанокисляющих бактерий ( в частности H.iuhra и M.t hemophilus ). Подобраны условия, оптимальные для мутагенеза этих штаммов. Обнаружены пла-эмивы в клетках ряда ранее не исследованных штаммов метанокисляющих бактерий. Установлено, чтс плазмивы с широким кругом бактериальных хозяев способны передаваться из штаммов Б.coll и P. ри-tida к повверчиваться в клетках метанокисляющих бактерий,прояв-
ляя в них свои основные свойства (устойчивость к антибиотикам и кокьюгативность). Плазми вы КР4, кбЗ.^5 и pULB 113 поддержива-ются в клетках ll. rubra в автономном состоянии, а плазмкда pASe-ігі - в интегрированном состоянии. Плаз мины Ц63,*5 и pULB 115 в клетках термофильного штамма it.thoniraphilu& подверчиваются в интегрированном состоянии.
Установлено, что плаэмивы КР4, Е6Є.^5 и pASS-ігі способны перепеваться из клеток метанокисляющих бактерий в Е. coli, при этом плазмипы, интегрированные в хромосому вонора, способны при переносе в клетки реципиента захватывать фрагменты хромосом ме-танотрофов.
Впервые осуществлена передача хромосомных генов между различными штаммами метанокисляющих бактерий ( Ы.гчтэга) с помощь» конъюгативноя плаэмивы pASS-ігі «показано, что при этом происходит гомологичная рекомбинация между хромосомами донора и реципиента.
Создан банк хромосомных генов li.theraopiuius на векторной мобилиэируемой плазмиїю рЛГС ^.Обнаружены две различные, последовательности хромосомы U.thermoptiiluo, несущие в своем составе гены, восстанавливающие ЯеоА фенотип у дефектных по этому гену штаммов е» coll.
Практическая ценность. Созвана коллекция мутантних и содержащих различные плаэмивы штаммов метанокиеляящих бактерий. Разработаны методы, позволяющие проводить генетический анализ и конструирование новых штаммов метанотрофов - продуцентов различных биологически активных продуктов.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всесоюзной конференции "Биохимия и физиология метилотрофов" (Пушино, 1986); УП Съезде УЬЮ (Черновшії 1989) і конференциях молодых
ученій ИМВ АН УССР (Киев, 1984-1990; Канев, 1986); 5th International Symposium on Microbial Growth on С I-compounds ( Haren, EetherlanUB, 1986)* 6th International Syepoalum on Microbial Growth on CI-compoun4s ( GSttingen, 1989).
Публикация результатов исследования. Материалы диссертационной работы опубликованы в 16 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит ' иэ ввепения, обзора литературы (I глава), экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов и списка литературы (206 источников) иэ них 20 работ отечественных авторов). Работа изложена на 118 страницах машинописи, содержит 18 таблиц и IS рисунков. Объекты и методы^исследования. В работе были использованы следующие штаммы метанокисляющих бактерий : Uethylococcus capsu-latue 494 и 9», II. theroophilus III I];Methylovariua ucrainlcua 159 и 161б,и.1«**ча 55вн 98, U. wnitenburyi T, M. viaelenall 50, liethylovariue ap. 9e, BM, 72$, I7c, 9, 21, IIS2, 126; Kethylo-monae methanica Sj и I5fc, W. rubra 15 Ш и 2T, M. alba BG8, U. agile Д20} liethyloslnus trichosporium OBJb, 0B5t GB4, AJ9d, It. sporlum 5, 12, A20d, liethyloeinus вр. ЄК6, IIBJ, 5э, 4э, 80в И 100; Methylocyatla parvus ОВВР, А2І, *92, М. eehlnoides C49>t Metbylocystie sp. B2I из коллекции отвела биологии гаэокислякщик микроорганизмов ИМВ АН УССР; а также следующие гетеротрофные бактериальные штаммы И плазмиды: ' Bacherichia coll: J53 ргоВ22 raet-F6Jt С600 tra-I ІеиВб tonAIlacYI supE«. xtbDI thl-I; C6Q0 srlu TnIO recA5&i HBIOI 1еиВЄ pro-^22 thl-I lacTI recAIJ end-IvrpsH ha4R hadMj RKI (ИВІОІ) recA* hisuTnlO; АВ246Д arg3 hisfi* l«uB6 A (gtp-proA)&2 thl-I thr-I ara-I4 ІасїІ tsxJJ galK2 зирЕад-rao mgl-51 іраЬЗІ HU&H51 xyl-5 mtl-I гесАІЗ; ЛЯІ09 reoAI endAI