Введение к работе
Актуальность темы. Микроорганизмы находят все более широкое применение для получения антибиотиков, белковых, лекарственных препаратов, витаминов и ферментов. Созданы бактериальные штаммы-продуценты трех типов интерферонов (Институт биоорганической химии АН СССР, Институт ВНШгенетики), гормона роста человека и ряда сельскохозяйственных животных (Институт молекулярной биологии АН СССР), проинсулина человека (ИБХ АН СССР), ин-терлейкина-2 (Институт органического синтеза АН Латв.ССР).
С появлением новых продуктов микробиологического синтеза возникают проблемы их выделения из культуральной среды и освобождения от примесей. Очень часто получаемые отечественные препараты уступают зарубежным по степени чистоты и уровню биологической активности, что имеет немаловажное значение для их практического применения.
Одной из актуальных проблем в настоящее время является получение высокоочищенного инсулина человека. Советские специалисты сконструировали бактериальные штаммы-продуценты предшественника инсулина, что создало предпосылку развертывания в нашей стране производстве генно-инженерного инсулина человека (ГИИЧ). Преимущество процесса получения ГИИЧ состоит в том, что он не зависит дт перебоев в поставках сырья мясокомбинатами и позволяет получить человеческий инсулин, который при длительном применении не вызывает аллергических осложнений в отличие от инсулина животных.
Выделение рекомбинантного.белка (FB) ГИИЧ из биомассы продуцентов .(#& JmioJ „ JM/Ci в настоящее время осуществляется хроматографическими методами с .использованием импортных сорбентов, реактивов и оборудования, что влечет за собой высокие финансовые затраты. Наличие нескольких этапов очистки белка обусловливает дробность процесса, довольно значительную его продолжительность и необходимость предварительной фильтрации раствора.
Актуальность разрабатываемой проблемы связана с необходимостью проведения исследований', направленных на совершенствование технологии получения генно-индек >рного инсулина человека путем разработки новых методов выдсоения его полупродуктов ч использованием ь.етод^в, альтернативных хроматогрзфи-ческим, и заменой импортного оборудования и сырья на отечест-
te.
венные.
Целью работы было изучение зависимости степени раствори-, мости РБ, получаемого из штамма-продуцента Е.ыб' , от температурного фактора, ионной силы раствора и присутствия органических растворителей для дальнейшего использования полученных результатов в процессе выделения и очистки полупродуктов ГИИЧ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести сравнительную оценку штаммов . tvfr' JMJoS и ЗМШі по способности продуцировать рекомбинантный белок генно-инженерного инсулина человека*,
-
Разработать технологию очистки и выделения РБ с использованием отечественных сырья, реактивов и оборудования;
-
Оптимизировать процесс производства ГИИЧ по времени и количеству стадий;
-
Осуществить контроль качества и специфичности выделенного РБ физико-химическими и иммунологическими методами.
Научная новизна работы. Впервые проведены работы по изучению структурной и репликативной стабильности рекомбинантных плаэмид штаммов F.&&ZM/OJ и дл Ш - продуцентов рекомбинантных белков на стадиях культивирования и в процессе хранения посевного материала. Осуществлена оценка этих штаммов по продуктивности РБ. Для экспериментальных работ по очистке и выделению белка отобран продуцент . а>& JM JQi? . Опробованы методы всаливания, ультрафильтрацш и осаждения белков органическими растворителями для удаления примесных компонентов ;;з раствора РБ, продуцируемого штаммом . ео& JM/CJ?. На основе полученных данных о зависимости степени растворимости реком-бинантного белка от температуры, ионной силы раствора и наличия органических растворителей, усовершенствован процесс выделения и очистки целевого продукта. Осуществлена разработка новых методик контроля качества и специфичности РБ на стадиях его производства.
Практическая значимость. Практическая значимость работы заключается в разработке новой нетрадиционной технологии получения РБ из В. м&" JM/OJ, отличающейся от существующих простотой, большей экспрессностыэ и дешевизной, обусловленных применением отечественного сырья и оборудования, сокращением стадий очистки белка. Полученные экспериментальные данные no-
зволяют заменить 2 стадии хроматографической очистки РБ на селективное фракционирование раствора белков этанолом. Простота выполнения операций, использование нехроматографичееких процессов очистки белка, результаты оценки качества РБ, выделенного по разработанной технологии, являются основанием для того, чтобы рекомендовать данную работу к внедрению в производство.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Выбор штамма-продуцента рекомбинантного белка генно-инженерного инсулина человека.
-
Разработка альтернативной технологии очистки рекомбинантного белка, получаемого из клеток . ы>& J-*'/е>4 - продуцента генно-инженерного инсулина человека.
-
Оптимизация технологического процесса получения генно-инженерного инсулина человека.
-
Разработка методов контроля качества рекомбинантного белка на стадиях его получения.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на научно-практической конференции ПО"Прогресс" (Степногорск, 1991), на III Всесоюзном семинаре "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степногорск,1991), а также на совместном заседании секций Ученого Совета "Физиология роста, генетика и селекция микроорганизмов" и "Вирусология" (Алма-Ата,. 13.П.91).
Публикации. Результаты проведенной работы вошли в опытно-промышленный регламент на производство рекомбинантного инсулі'-на человека (ОПР І23І5-0І-9І/64-І20-0І-9І, ИБХ АН СССР, СНОТ-ПО"Прогресс"). Разработаны три производственные методики (Архив СНОПЕ ПО"Прогресс", инв.№ 2628, 1990), оформлен ьнио-тационный отчет по этапу темы СБ 04/91 (Архив СНОПЕ [Ю'Иро.-р* ее',' инв.№ 2712/1990). По теме диссертации опубликозано 9 неучша трудов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяте, разделов: введения, аналитического, обчора, экспериментальных исследований, заключенья и выводов. Список литературы шиюча'; Iі 123 наимонопачкя ра^от отечественных и зарубекных авторов, "е-териалы дпесортапкр изложены на 130 листах машинописного vsua-т-'1, Содержат Г" таблиц и '/ рисунков'.