Введение к работе
Акту_альность_теиы^ Азот входит в состав многих биологических молекул й является одним из макроэлементов, необходимых для развития и роста всех живых организмов. Однако молекулярный азот воздуха доступен для использования только, небольшой группе микроорганизмов. Бактерии, относящиеся к видам Rhleoblum и Bradyrhi20bium, могут осуществлять фиксацию азота в симбиозе с бобовыми растениями. В основе этих симбиотических взаимоотношений лежит обмен фиксированным рмзобиями азотом и содержащими углерод соединениями, синтезированными растением-хозяином. Одной из наиболее интересных черт симбиотичекой фиксации азота является конфликт мецду высокой чувствительностью нитрогеназного комплекса к кислороду и потребностью в больших затратах анергии в процессе его функционирования. Основная часть этой энергии может быть получена только в результате окислительного фосфорилирования, а значит в процессе дыхания. На данный момент достаточно активно ведутся работы по изучению энергетических аспектов сиыбиотической азотфиксации и, в частности, по изучению влияния дыхательной активности ризобий. на их способность вступать в эффективный симбиоз с растением-хозяином. Исследована роль различных ветвей цепи транспорта электронов ризобий в процессе сиыбиотической азотфиксации (Boit et al., 1992, Batut et al., 1989, Gabel et al., 1994, Preieig et al., 1993, tully, Ritz et al, 1993). Однако четкой корреляции между активностью дыхания и сиыбиотической .эффективностью у различных видов и штаммов клубеньковых бактерий до сих пор обнаружено не было. Кроме того, не доказана возможность получения высоко эффективных штаммов ризобий при селекции их по дыхательной активности чистых культур. Цель и_задачи исследования..
Целью нашей работы являлось изучение взаимосвязей между клеточным редокс-потонциалом R.mellloti и их дыхательной и сиыбиотической активностью. 6 задачу исследований входило:
- разработать методику получения мутантов клубеньковых бактерий, обладающих повышенной способностью восстанавливать бромид трифе-нилтетразолия, являющегося индикатором клеточного редокс-потекци-
ала, и получить коллекцию мутантов тэкого типа у штамма СХМ1-188 R.mellloU;
- доказать транспоэоиовую природу возникновения иутаций и
определить их локализацию в геноме R.melHoti;
изучить дыхательную активность чистых культур н эндосимбиотических форм полученных иутантов, а также их симОиоткческие свойства;
выявить корреляции между дыхательной и симбиотической активностью близкородственных штаммов R.melilotl, штаммов, имеющих независимое происхождение, а также иутантов с измененный окислительно-восстановительным потенциалом;
~-:на основе штамма СХМ1-188 R.melilotl получено 29 иутантов с повышенной способностью восстанавливать бромид трифенилтетразо-лия (Г;ей++чі«нотип);
определена локализация полученных мутаций и показано, что у 23 из 29 мутантов инсерции Тп5, вызывающие возникновение Ие(1++-фенотипа, произошли в мегаплазмиду 2;
выявлена корреляция между интенсивностью дыхания бактероидов и сиыОнотической активностью у близкородственных штаммов, а также показано отсутствие корреляции между этими признаками у штаммов R.melilotl, имеющих независимое происхождение;
анализ симбиотической и дыхательной активности Red*4-мутантов покаэпл, что большинство из них характеризуются повышенной симбиотической эффективностью и дыхательной активностью как свободно-живущих клеток, так и их эндосимбиотических форм. QE5!5!5!S{LUeKHOcTb^ Разработан метод отбора мутантов клубеньковых бактерий R.melilotl с повышенной дыхательной активностью, основанный на использовании индикатора '/леточного релокс-потенциала - бромида трифекилтетразолия. Частота возникновения мутантов такого типа составила 3x10 . . Используя этот метод, был получен 21 мутант с повышенной симбиотической активностью. Следовательно, показана возможность его использования для отбора высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий люцерны.
Лпроб?!й?я_Р59і Результаты работы докладывались на VI с'езде
ВОГКС (Минск, 1992), І Европейской конференции по аэотфиксации (Сегед, Венгрия, 1994), I с'езде ВОГИС (Саратов, 1994), на IX Баховском коллоквиуме по биологической фикевции молекулярного азота (Москва, 1995), на X Международном конгрессе по биологической фиксации азота (С.-Петербург, 1995). Публикации^ По теме диссертации опубликовано 7 работ. 2тРїїїїЕ_и_об^еи_работад Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов и обсуждения; выводов и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 16 рисунков. Список литературы состоит из 177 источников.