Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 16
1.1 Образование биопленок у бактерий 16
1.1.1 Биопленки S. aureus 27
1.1.2 Биопленки P. aeruginosa 30
1.2 Полимикробные биопленки 33
1.3 Способы терапии бактериальных биопленок 38
Заключение 45
Экспериментальная часть 47
2 Материалы и методы исследования 47
2.1 Антибактериальные вещества, использованные в работе 47
2.2 Линии клеток и условия культивирования 47
2.3 Методы работы с бактериальными клетками 47
2.3.1 Штаммы 47
2.3.2 Плазмидные векторы 49
2.3.3 Среды и условия культивирования 49
2.3.4 Определение способности бактерий образовывать биопленки (с модификациями) 50
2.3.5 Получение смешанной биопленки 51
2.3.6 Определение минимальной подавляющей концентрации и минимальной бактерицидной концентрации 51
2.3.7 Определение минимальной концентрации, подавляющей образование биопленок 51
2.3.8 Определение эффективности антимикробных веществ против бактерий в составе биопленок 52
2.3.9 Подсчет КОЕ 52
2.3.10 Трансформация клеток E. coli методом теплового шока 52
2.3.11 Трансформация клеток S. aureus методом электропорации 53
2.4 Методы работы с рекомбинантной ДНК 53
2.4.1 Выделение геномной ДНК бацилл методом фенол-хлороформной экстракции 53
2.4.2 Выделение геномной ДНК S. aureus с помощью GenElute Bacterial Genomic DNA Kits 54
2.4.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit 54
2.4.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 55
2.4.5 Очистка амплифицированных фрагментов ДНК после ПЦР 56
2.4.6 Рестрикция ДНК 56
2.4.7 Реакция Гибсона 56
2.4.8 Электрофорез ДНК 56
2.5 Схемы получения рекомбинантных конструкций 57
2.5.1 Клонирование гена sacC из B. subtilis 168 для получения гиперпродуцентов рекомбинантной леваназы SacCst 57
2.5.2 Получение рекомбинантного штамма S. aureus ica-GFP, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок с промотора гена icaA 57
2.6 Методы работы с белками 58
2.6.1 Скрининг рекомбинантных штаммов, обеспечивающих гиперпродукцию белка58
2.6.2 Гиперпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов 58
2.6.3 Очистка белков на стреп-тактин сефарозе 59
2.7 Микроскопические методы исследований 60
2.7.1 Флуоресцентная микроскопия 60
2.7.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 60
2.7.3 Атомно-силовая микроскопия 61
2.8 Методы исследований биобезопасности веществ 61
2.8.1 Определение цитотоксичности 61
2.8.2 Тест Эймса 62
2.8.3 Тест Эймса с метаболической активацией 63
2.8.4 ДНК-повреждающий тест 64
2.9 Определение активности -галактозидазы 64
2.10 Статистическая обработка результатов 65
3 Результаты исследований 66
3.1 Подавление образования бактериальных биопленок производными 2(5H)-фуранона 66
3.1.1 Подбор питательных сред 66
3.1.2 Скрининг производных 2(5Н)-фуранона, подавляющих образование биопленок клетками грамположительных и грамотрицательных бактерий 67
3.1.3 Повышение эффективности антибиотиков в присутствии фуранонов 69
3.1.4 Цитотоксичность производных 2(5H)-фуранона 73
3.1.5 Мутагенность соединения Ф105 74
3.2 Разрушение биопленок P. aeruginosa с помощью бактериальных гликозидгидролаз 76
3.2.1 Клонирование гена внеклеточной леваназы SacС из B.subtilis, очистка белка 76
3.2.2 Оценка эффективности разрушения биопленок P. aeruginosa внеклеточной леваназой SacCst 78
3.2.3 Исследование возможности повышения эффективности антибиотиков в присутствии внеклеточной леваназы SacCst против клеток P. aeruginosa в составе биопленки 79
3.3 Исследование устойчивости бактерий в составе полимикробных биопленок 82
3.3.1 Моделирование полимикробной биопленки S. aureus и P. aeruginosa 82
3.3.2 Атомно-силовая микроскопия полимикробных биопленок 88
3.3.3 Влияние различных групп антибиотиков на S. aureus и P. aeruginosa в составе смешанной биопленки 90
3.3.4 Оценка эффективности антибиотиков широкого спектра действия в присутствии внеклеточной леваназы SacCst на микроорганизмы в составе смешанной биопленки S. aureus и P. aeruginosa 98
3.3.5 Анализ образования малых форм колоний S. aureus при терапии смешанных биопленок S. aureus-P. aeruginosa 99
3.3.6 Анализ воздействия цианида, синтезируемого P. aeruginosa, на жизнеспособность S. aureus в смешанной биопленке 100
3.3.7 Интродукция бактерий-антагонистов как способ повышения антимикробной эффективности антибиотиков 101
4 Обсуждение результатов 103
Заключение 112
Список использованных источников 114
Приложение 1 142
Приложение 2 153
- Образование биопленок у бактерий
- Повышение эффективности антибиотиков в присутствии фуранонов
- Моделирование полимикробной биопленки S. aureus и P. aeruginosa
- Интродукция бактерий-антагонистов как способ повышения антимикробной эффективности антибиотиков
Образование биопленок у бактерий
Биопленки можно охарактеризовать как дифференцированные группы микроорганизмов, организованные в виде клеток, погруженных в единый внеклеточный матрикс [Bjarnsholt et al., 2018]. При этом большинство клеток в многослойных биопленках находятся в межклеточном контакте либо в поверхностно-прикрепленных биопленках, в которых только один слой соприкасается с субстратом, либо в так называемых хлопьях, являющиеся подвижными биопленками, которые образуются в отсутствие какого-либо субстрата. Благодаря межклеточным взаимодействиям, а также свойствам матрикса данная форма существования бактерий принципиально отличается от хорошо изученных планктонных форм. Таким образом, бактерии, находящиеся в составе биопленок, обладают абсолютно новыми свойствами, не характерными для свободноживущих микроорганизмов [Konopka et al., 2009].
Биопленки являются одним из наиболее распространенных способов жизни бактерий, они участвуют в большинстве биохимических циклов органических элементов в воде, почве и донных отложениях. В сфере биотехнологий биопленки применяются для фильтрации питьевой воды, деградации сточных вод и твердых отходов, а также при биокатализе в производстве сыпучих и тонких химических веществ, а также биотоплива [Halan et al., 2012]. Бактерии, колонизирующие организм человека и животных, также способны образовывать биопленки [De Vos et al., 2015], что может быть связано с постоянным развитием инфекций у животных и людей [Costerton et al., 1987] а также с загрязнением медицинских устройств и имплантатов [Shirtliff, Leid, 2009].
Биопленки представляют собой сложную систему, которая имеет высокую плотность клеток, варьирующую от 108 до 1011 КОЕ/мл [Balzer et al., 2010; Morgan-Sastume et al., 2008]. Как правило, состав биопленки гетерогенен и включает в себя несколько видов бактерий. Дополнительным источником гетерогенности популяций является способность клеток в биопленках подвергаться дифференцировке, которая может быть вызвана условиями окружающей среды и скоординированными жизненными циклами, которые включают специфическую для каждой стадии экспрессию генов и белков, что характерно для роста и развития микроорганизмов в пространственно-неоднородных экосистемах [Singer et al., 2010].
Образование биопленок является сложным динамичным процессом развития сообщества, который происходит в ответ на изменения окружающей среды. При образовании биопленок в бактериях активируется множество регуляторных сетей, происходит изменение экспрессии генов, тем самым опосредуется пространственная и временная реорганизация микроорганизмов [Monds, O Toole, 2009]. Это клеточное перепрограммирование изменяет экспрессию поверхностных молекул, использование питательных веществ и факторов вирулентности и дает бактериям набор свойств, которые обеспечивают их выживание в неблагоприятных условиях [Klebensberger et al., 2009]. Бактериальная агрегация и последующее созревание биопленки состоит из обратимых и необратимых стадий и включает в себя многочисленные консервативные и видоспецифичные факторы. Выделяют основные этапы образования биопленок: прикрепление клеток к поверхности и перераспределение их массы, усиленное деление клеток для получения крупных клеточных кластеров и образование внеклеточного матрикса, формирование пространственной структуры и конечный этап – дисперсия биопленки, т.е. выброс клеток в окружающую среду [Omar et al., 2017]. Изначально свободноживущие планктонные бактерии адгезируются на поверхности. Процесс прикрепления к поверхности жгутиковых и безжгутиковых бактерий происходит разными путями. Первичным этапом адгезии у форм не имеющих жгутиков является повышенный синтез адгезинов и интегринов [Gtz, 2002]. У жгутиковых и грамотрицательных микроорганизмов прикрепление индуцируется за счет связывания с поверхностью пилей IV типа (в некоторых случаях I типа) [O Toole et al., 2000]. После адгезии этапы развития биопленок не имеют принципиальных различий в зависимости от вида.
После прикрепления к поверхности микроорганизмы образуют конгломераты в несколько слоев, и наступает фаза созревания биопленки, когда могут происходить характерные морфологические изменения, что приводит к развитию микроколоний, имеющих грибовидную форму или форму пилей. В связи с наличием большого количества включений в матриксе биопленок происходит образование конгломератов с различной пространственной структурой (рисунок 1).
Существенными особенностями цикла развития биопленки являются механизмы, участвующие в прикреплении планктонных бактерий к поверхности, что приводит к межклеточной адгезии между бактериальными клетками внутри биопленки. Так как большинство клеток не имеют прямого контакта с поверхностью, существуют также механизмы, определяющие форму зрелой биопленки. Впоследствии из биопленки в окружающую среду высвобождаются планктонные клетки, которые затем могут начать новый цикл развития биопленки (рисунок 2).
В состав внеклеточного матрикса биопленки входят полисахариды, белки, липиды и внеклеточная ДНК (eDNA), которые препятствуют ее высыханию [Flemming et al., 2010]. Синтез матрикса обеспечивает бактериям в составе биопленок отличную от окружающей среду обитания, внутри которой происходит повышенный обмен генами, накопление питательных веществ. Внеклеточный матрикс оказывает защитную функцию, в следствии чего у клеток в составе биопленки проявляется повышенная устойчивость к действию антимикробных препаратов.
Формирование матрикса является динамичным энергозатратным процессом, который зависит от доступности питательных веществ, синтеза и секреции внеклеточного материала, конкурентных отношений клеток и повреждений другими микроорганизмами из вне. Матрикс обеспечивает пространственную структуру биопленки и является промежуточным звеном при контакте бактерий с окружающей средой.
Большую часть биомассы биопленки составляет матрикс, а не микробные клетки. Механические свойства матрикса биопленки, а также физиологическая активность организмов в ней обусловлена самоорганизацией молекул в экзополимерном субстрате и от межмолекулярных связей между его компонентами [Flemming et al., 2010]. Молекулы внеклеточного матрикса играют важную роль в формировании пространственной структуры биопленки, образование которой представляет собой непрерывный активно протекающий процесс, создающий такую организацию, в которой клетки существуют в виде микроколоний [Neu, Lawrence, 2015]. В 2013 году были описаны клеточные кластеры в биопленках Escherichia coli со сложной архитектурой, ответственной за физиологическую дифференцировку клеток в пространстве [Serra et al., 2013]. Было показано, что в биопленках E. coli плотность заряда способна изменяться в зависимости от времени и зависит от высоты биопленки [Birjiniuk et al., 2014]. В межклеточном пространстве биопленки находятся молекулы, которые определяют условия для существования микроорганизмов, а также обеспечивают механическую прочность и стабильность биопленки [Persat et al, 2005].
Основным компонентом матрикса является вода (до 97%), в которой содержатся структурные компоненты: наиболее распространены белки, растворимые и гелеобразующие полисахариды и внеклеточная ДНК (eDNA), содержание которых может варьировать и доминировать или оставаться минорным компонентом в зависимости от вида [Flemming, Wingender, 2010], а также нерастворимые компоненты, среди котрых амилоидные белки, целлюлоза, фимбрии, пили и жгутики [Serra et al., 2013; Hobley et al., 2015]. Было показано, что переносу жидкости в матриксе способствуют поры и каналы между клеточными конгломератами [Karimi et al., 2015; Wilking et al., 2013]. В некоторых случаях структурные компоненты матрикса могут также иметь другие функции, которые приносят дополнительные преимущества биопленке. Например, в биопленках кишечной палочки, амилоидные белки являются основным структурным компонентом матрикса, которые в комплексе с целлюлозой повышают устойчивость к высыханию биопленки, а в биопленках Bacillus subtilis матрикс содержит белки, называемые гидрофобинами, для образования высокогидрофобной биопленки, которая не прикреплена к поверхности и способна существовать на разделе водно-воздушной среды [Hobley et al., 2015]. В биопленках, образованных Pseudomonas aeruginosa, матрикс самоорганизован посредством энтропийных взаимодействий между биополимерами в жидкокристаллическую структуру, а вязкость сильно повышается за счет нитевидных фагов Pf32.
Чеще всего структура биопленки характеризуется высокой подвижностью. В ней идентифицируют отдельные зоны, которые имеют существенно различную вязкость, что позволяет клеткам перемещаться в матриксе [Persat et al., 2005]. Выделяют вертикальную миграцию бактериальных популяций на фоне повышенного содержания солей в субстрате [Raymond et al., 2015], и миграцию, определяющуюся различными функциональными характеристиками клеточных популяций внутри бактериальной биопленки [Van Gestel et al., 2015]. Было показано, что популяция планктонных клеток Bacillus thuringiensis способна проникать глубоко в структуру биопленки с высокой скоростью (до 20 мкм/с). Клетки, погружающиеся в матрикс биопленки, создают переходные поры, которые увеличивают движение масс в биопленке [Houry et al., 2012]. Изменение структуры биопленки необходимо для того, чтобы она реагировала на изменения окружающей среды, такие как гидродинамический сдвиг, или формировала тяжи, которые облегчают колонизацию поверхности. В процессе изменения специфические ферменты разлагают и изменяют конфигурацию биопленки, что приводит к расслаиванию, а также активному рассеиванию биопленки с последующей колонизацией новых поверхностей [Whitfield et al., 2015].
Одним из важных свойств матрикса биопленки является устойчивость к высыханию, поскольку микроорганизмы в окружающей среде регулярно испытывают стресс из-за недостатка воды. В ответ на высыхание в биопленке происходит активный синтез всех компонентов матрикса, в особенности гидрофобных молекул, а также оболочки, обогащенной целлюлозой, которая служит барьером для испарения жидкости [Flemming, Wingender, 2010; Flemming, 2011].
Питательные вещества, необходимые микроорганизмам, способны поступать в биопленку из водной фазы или из субстрата, на котором образована биопленка с помощью губчатой структуры матрикса [Billings et al., 2015]. Поскольку питательные вещества из поверхностных материалов наиболее сконцентрированы в базовом слое биопленки, градиент питательных веществ меняется по сравнению с градиентом питательных веществ, полученных из водной фазы.
Повышение эффективности антибиотиков в присутствии фуранонов
Большинство бактерий (в том числе и грамположительных) часто образуют биопленки на различных поверхностях [Flemming, 2010]. Кроме повышенного уровня секреции вторичных метаболитов, часто токсичных для организма-хозяина, бактерии в составе биопленки характеризуются повышенной устойчивостью к бактерицидными препаратам, антибиотикам и иммунной системе организма [Mah, O Toole, 2001]. Поэтому подавление образования бактериальных биопленок является одним из подходов к повышению эффективности антимикробной терапии. Полученные данные по подавлению биопленок стафилококков в присутствии соединений Ф6, Ф8, Ф35, Ф83, Ф105 (таблица 6) позволяют предложить их для комплексного применения с антибиотиками и повышения их эффективности против клеток адгезированных к поверхности.
Чтобы проверить способность соединений Ф6, Ф8, Ф35, Ф83, Ф105 повышать антибактериальное действие антибиотиков, получали 48-часовую биопленку стафилококков на БМ-бульоне в присутствии и отсутствии производных 2(5Н)-фуранона. Затем в среду культивирования вносили хлорамфеникол до концентрации 10 мкг/мл, и продолжали культивирование в течение суток. После проводили дифференциальное флуоресцентное окрашивание жизнеспособных и погибших клеток акридиновым оранжевым и пропидия йодидом, и исследовали путем флуоресцентной микроскопии (рисунок 10). Процентное содержание жизнеспособных клеток определяли с помощью программы BiofilmAnalyser [Bogachev et al., 2018].
Оценка жизнеспособности клеток S. aureus в составе 48-часовой биопленки, выращенной в присутствии производных 2(5Н)-фуранона (верхний ряд) с последующей экспозицией с хлорамфениколом в течение 24 часов. Жизнеспособность клеток оценивали путем дифференциального флуоресцентного окрашивания клеток DioC6 (жизнеспособные клетки окрашены в зеленый цвет) и PI (нежизнеспособные окрашены красным) [Trizna et al., 2016]. В процентах указано количество нежизнеспособных клеток
По причине наличия биопленки, оказывающей защитное действие, в отсутствии фуранонов количество нежизнеспособных клеток было незначительным. При внесении Ф35, Ф83 и Ф105 наблюдалось значительное снижение количества жизнеспособных клеток (рисунок 10).
Поскольку Ф105 оказывал максимальный эффект подавления транскрипции ica-оперона в клетках S.aureus и имеет самый низкий показатель БПК, анализ эффективности действия более широкого спектра антибиотиков проводили в комплексе с этим соединением. Для этого 48-часовую биопленку S.aureus выращивали в присутствии Ф105 в концентрации 2.5 мкг/мл, затем заменяли культуральную жидкость свежим БМ-бульоном, содержащим Ф105 и антибиотик в концентрациях 1-8МБК (МБК антибиотиков указаны в таблице 7), и продолжали инкубирование. Через 24 часа количество жизнеспособных клеток анализировали путем прямого подсчета КОЕ и с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии как описано в разделе Материалы и методы.
На рисунке 11А видно, что в отсутствии Ф105 снижение количества жизнеспособных клеток золотистого стафилококка в составе биопленки на 2-3 порядка наблюдалось только при концентрации антибиотиков равной 8МБК, при этом максимальный эффект оказывал ванкомицин (256 мкг/мл). В случае, когда биопленки выращивали в присутствии 2.5 мкг/мл Ф105, чувствительность клеток к антибиотикам значительно повышалась и полная гибель клеток наблюдалась уже при концентрациях антибиотиков, соответствующих их 1-2МБК.
Результаты подсчетов КОЕ были подтверждены при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. На рисунке 11Б видно, что при воздействии амикацином и ванкомицином практически все клетки S. aureus в составе биопленки окрашивались в зеленый цвет, что свидетельствует об их жизнеспособности. При добавлении в среду культивирования соединения Ф105 биопленка не образовывалась и отсутствовал диффузный барьер для антибиотиков, вследствие чего все клетки идентифицировались нежизнеспособными. Рисунок 11 – Жизнеспособность S. aureus в составе биопленки в присутствии антибиотиков и Ф105 в концентрации 2.5 мкг/мл. Жизнеспособность оценивали с помощью подсчета КОЕ (А) и дифференциального флуоресцентного окрашивания с последующей конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (Б). Жизнеспособные клетки окрашены в зеленый цвет (DioC6), нежизнеспособные окрашены красным (PI).
Шкала измерения равна 10 мкм Полученные данные позволяют заключить, что комбинирование антибиотиков с производными 2(5//)-фуранона позволяет значительно повысить эффективность антибактериальной терапии.
Моделирование полимикробной биопленки S. aureus и P. aeruginosa
Моделирование биопленки осуществляли in vitro путем совместного культивирования S. aureus и P. aeruginosa в БМ-бульоне с различной последовательностью инокуляции бактерий. В первом случае культуру S. aureus (107 КОЕ/мл) в БМ-бульоне вносили к предварительно сформированной 24-часовой биопленке P. aeruginosa. В другом случае, наоборот, культуру P.aeruginosa (107 КОЕ/мл) в БМ-бульоне добавляли к сформированной 24-часовой биопленке S. aureus. Затем культивирование продолжали в течение 24 часов. Также проводили одновременную инокуляцию в среду ночных культур обоих штаммов с последующим культивированием в течение 48 часов. Затем культуральную жидкость удаляли, и оценивали плотность образовавшейся биопленки с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым, а также определяли количество жизнеспособных клеток обоих штаммов в биопленке путем подсчета КОЕ на дифференциальных средах.
Несмотря на большое количество сообщений о наличии антагонистических взаимоотношений S. aureus и P.aeruginosa, на вторые сутки ко-культивирования в биопленке обнаруживались жизнеспособные клетки обоих видов микроорганизмов (рисунок 18). При этом, при одновременной инокуляции обоих видов бактерий соотношение количества их жизнеспособных клеток составляло примерно 1:1. При последовательной инокуляции, независимо от того, какой микроорганизм служил для предварительного формирования биопленки, соотношение КОЕ видов после 24-часов инкубации составляло 1:10 с преобладанием того вида, который был внесен первоначально (рисунок 18 Б и В). Таким образом, S. aureus и P.aeruginosa способны формировать смешанную биопленку при совместном культивировании. Более того, и S. aureus и P.aeruginosa способны проникать в зрелую биопленку другого вида и выживать в ее составе.
На следующем этапе анализировали распределение клеток S. aureus и P.aeruginosa в матриксе смешанной биопленки. Для это получали смешанную биопленку путем совместного культивирования стафилококка и псевдомонады в течение 48 часов при одновременной инокуляции. Затем проводили дифференциальное окрашивание жизнеспособных и погибших клеток с помощью красителей DioC6 и PI с последующей конфокальной лазерной сканирующей микроскопией, как описано в разделе Материалы и методы. Бактерии S. aureus и P. aeruginosa в случае монокультур образовывали биопленки толщиной 20-25 мкм, с развитыми грибовидными структурами (рисунок 19 А и Б). При этом большинство клеток (90-95%) окрашены в зеленый цвет, что свидетельствует об их жизнеспособности. Толщина смешанной биопленки также составляла 20-25 мкм, однако наблюдалась более плотная структура без значительных пустот, в отличие от биопленок монокультур, что позволяет предположить меньшую степень ее проницаемости для антимикробных препаратов. Количество нежизнеспособных клеток в ее составе было выше, по сравнению с монокультурами (только 80% клеток идентифицировались как жизнеспособные). При этом клетки стафилококка образовывали агломераты, или микроколонии в толще биопленки (на рисунке 19В показаны белой стрелкой), по всей видимости, тем самым снижая негативное давление факторов антагонизма псевдомонады. Полученные результаты свидетельствуют о стабильности сообщества в условиях проведения эксперимента.
Далее исследовали возможность комменсальных взаимодействий S. aureus и P. aeruginosa в составе смешанной биопленки, а именно возможности интеграции одного вида в состав матрикса биопленки, сформированой другим видом бактерий, и благодаря этому выживать в негативных условиях среды. Для этого смешанные биопленки выращивали в присутствии соединения Ф105, охарактеризованного как ингибитор образования биопленок золотистым стафилококком и неактивного против P. aeruginosa. Следовательно, можно ожидать подавление образования внеклеточного матрикса клетками S. aureus в присутствии Ф105, не нарушая формирование биопленки за счет P. aeruginosa.
С помощью лазерной конфокальной микроскопии моно- и полимикробных биопленок S.aureus и P.aeruginosa показано, что в присутствии Ф105 в концентрации 2.5 мкг/мл образовывалась плотная биопленка P.aeruginosa (рисунок 19 Ж), тогда как в культуре S.aureus биопленка не формировалась, и нежизнеспособные клетки составляли 55% популяции (рисунок 19 Е). При этом Ф105 практически не влиял на структуру и процент нежизнеспособных клеток в смешанной биопленке S.aureus и P.aeruginosa (сравнить рисунок 19 В и З). В присутствии Ф105 также наблюдалось образование скоплений живых клеток стафилококка в матриксе смешанной биопленки, как и в среде без производного 2(5Н)-фуранона (рисунок 19 З).
Чтобы подтвердить отсутствие синтеза компонентов биоплёнки клетками стафилококка в присутствии Ф105, данный эксперимент был проведен с использованием штамма S. aureus pRB-ica-gfp, несущего репортерную конструкцию ica-GFP, экспрессирующуюся в условиях образования биопленки. В соответствии с ранее полученными данными, в монокультуре в присутствии Ф105 экспрессия GFP значительно снижалась (рисунок 19 Г и И). В смешанной биопленке в отсутствии Ф105 идентифицировались клетки, экспрессирующие GFP, что свидетельствует о синтезе матрикса биопленки клетками стафилококка и в смешанной культуре (рисунок Д). Внесение Ф105 к смешанной биопленки полностью подавляло экспрессию ica-GFP (рисунок 19 К).
Результаты конфокальной микроскопии были подтверждены путем подсчета КОЕ на селективных средах в полимикробной биопленке в присутствии и отсутствии Ф105 (рисунок 20). Количество жизнеспособных клеток S.aureus снижалось на 6 порядков в присутствии Ф105, что свидетельствует о полном ингибировании образования биопленки. При этом существенного снижения КОЕ P. aeruginosa в присутствии и отсутствии Ф105 не наблюдалось. В составе смешанной биопленки S. aureus-P. aeruginosa в контроле соотношение КОЕ оставалось неизменным и доля жизнеспособных клеток S.aureus почти не изменялась независимо от внесения Ф105 в среду культивирования.
На основании этих данных было сделано заключение, что в смешанной культуре в присутствии Ф105 биопленка образуется в основном клетками P. aeruginosa; клетки стафилококка, по всей видимости, способны встраиваться в биопленку P. aeruginosa и выживать в ее составе.
В ряде работ было показано, что в смешанных биопленках аэробные клетки S. aureus преимущественно располагаются в верхних слоях, при этом микроаэрофильные клетки P. aeruginosa расположены в нижних слоях [Korgaonkar et al., 2013]. Поэтому далее проводили анализ распределения клеток S. aureus и P. aeruginosa в смешанных биопленках, полученных в присутствии и отсутствии Ф105. Для этого проводили дифференциальное окрашивание биопленки набором ViaGramTM Red+, который позволяет окрасить клетки грамположительных бактерий в красный цвет, в то время как грамотрицательные бактерии окрашиваются в синий цвет. Далее, с помощью программы BioFilmAnalyzer была проведена оценка относительного содержания S. aureus и P. aeruginosa в каждом слое биопленки.
В соответствии с ранее опубликованными данными, в смешанной биопленке клетки S. aureus находились в верхних слоях биопленки в виде микроколоний, тогда как P. aeruginosa доминировала в нижних слоях (рисунок 21 А, В). В присутствии Ф105 наблюдалась обратная ситуация: P. aeruginosa, не чувствительная к действию Ф105, перемещалась в верхние слои биопленки, а стафилококк погружался в толщу матрикса и перемещался в нижние слои, вероятно, сохраняя тем самым свою жизнеспособность.
Таким образом, внесение фуранона Ф105 способствовало подавлению образования мономикробных биопленок S.aureus и гибели значительной части клеток. Однако, в смешанной культуре клетки стафилококка были способны интегрироваться в матрикс биопленки, формируемой P. aeruginosa, и выживать в его составе.
Интродукция бактерий-антагонистов как способ повышения антимикробной эффективности антибиотиков
Полученные результаты показали, что в определенных условиях как S. aureus, так и P. aeruginosa оказываются более восприимчивыми к противомикробным препаратам широкого спектра действия в полимикробных биопленках по сравнению с монокультурами. На основании этих данных была высказана гипотеза, что восприимчивость биопленок монокультуры может быть увеличена путем преднамеренного вмешательства P. aeruginosa в предварительно сформированную биопленку S. aureus и наоборот.
Чтобы проверить это предположение, клетки P. aeruginosa (2-9106 КОЕ / мл) добавляли к 24-часовой биопленке S. aureus и бактерии инкубировали в течение следующих 24 часов. Затем биопленку промывали стерильным 0.9% NaCl и добавляли свежую среду, содержащую антибиотики в различных концентрациях. Через 24 часа проводили подсчет КОЕ на дифференциальных средах (рисунок 33).
Введение P. aeruginosa в биопленку S. aureus не изменило эффективности антибиотиков против P. aeruginosa (рисунок 33, дорожка II). Напротив, внесение ципрофлоксацина в концентрации 1МБК приводило к уменьшению КОЕ S. aureus в биопленке на 3 порядка, в то время как в монокультуре для достижения того же эффекта требовалась концентрация антибиотика 4-8МБК (рисунок 33, дорожка I, сравните красные и фиолетовые боксы). Амикацин и гентамицин обладали низкой эффективностью против монокультуры S. aureus, однако после введения P. aeruginosa количество жизнеспособных клеток золотистого стафилококка также снизилось на 3 порядка уже при концентрации антибиотиков равной 1-2 MБК. Наиболее выраженный эффект наблюдался при 101 применении гентамицина. В обратном эксперименте, когда S. aureus был добавлен в биопленку P. aeruginosa, хотя значительного увеличения эффективности антибиотиков в отношении P. aeruginosa не наблюдалось.
Таким образом, полученные данные на модели смешанной биопленки P. aeruginosa - S. aureus позволяют предложить интродукцию бактерий другого вида как способ повышения антимикробной эффективности антибиотиков.
Образование биопленок патогенными бактериями приводит к повышению устойчивости бактерий к антимикробным препаратам в 1000 раз, в результате чего антибактериальные препараты практически бесполезны против большинства микроорганизмов. Распространение катетер-ассоциированных инфекций, в основном связанных с образованием биопленок S. aureus привело к значительному увеличению расходов в сфере здравоохранения за последнее десятилетие [Bjarnsholt et al., 2018]. Следовательно, необходимо развивать новые стратегии лечения инфекций, связанных с биопленками, и уменьшить значительные нагрузки, вызываемые этим патогеном. Экстремальная устойчивость бактерий в составе биопленок обусловлена множеством факторов, основным из которых является наличие экзополисахаридного матрикса, который представляет собой многокомпонентную систему способную подавлять действия антибиотиков [McCarthy et al., 2015].
В настоящее время существует большое количество подходов к борьбе с бактериальными биопленками. Лишь небольшой спектр антибиотиков способен снижать жизнеспособность микроорганизмов в составе биопленок, например, рифампицин для грамположительных бактерий и фторхинолоны для грамотрицательных [Kinnari et al., 2015]. При этом полного уничтожения бактерий не происходит и действенной является лишь комплексная терапия несколькими антибиотиками. При терапии инфекции легких, вызванной Pseudomonas aeruginosa у пациентов с муковисцидозом, применяется полимиксиновый антибиотик колистин, который в настоящее время является более эффективным по сравнению со многими другими антибиотиками в анаэробных условиях [Kolpen et al., 2016]. По некоторым данным более 40% изолированных штаммов S. aureus у пациентов с муковисцидозом являются метициллин-устойчивыми [Nobandegani et al., 2016]. Изолированные штаммы не проявляли устойчивости к ванкомицину и линезолиду, однако стандартизированных рекомендаций по лечению MRSA при муковисцидозе в настоящее время не имеется, поскольку для них характерно быстрое приобретение резистентных фенотипов микроорганизмов [Goss et al., 2011]. Тем не менее, результаты многочисленных исследований показывают, что применение ванкомицина, рифампина, хинупристина/дальфопристина и моксифлоксацина в качестве первой линии лечения MRSA должно осуществляться только в случае ухудшения течения болезни у пациентов с муковисцидозом [Dasenbrook et al., 2011].