Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Взаимодействие почвенных микроорганизмов и пестицидов 8
1.1. Пестициды как поллютанты почвенных экоситем 8
1.2 Влияние пестицидов на почвенные микроорганизмы 9
1.3 Влияние факторов среды на токсическое действие пестицидов 14
1.4 Биодеструкция пестицидов в почве 16
1.4.1 Стратегии микробной биодеструкции пестицидов 16
1.4.2 Ферменты, участвующие в биодеструкции пестицидов 20
1.4.3 Характеристика и механизмы биодеструкции почвенными микроорганизмами пестицидов симазина и ТМТД 26
1.4.3.1 Характеристика симазина 26
1.4.3.2 Механизмы биодеструкции симазина 27
1.4.3.3 Характеристика ТМТД 30
1.4.3.4 Механизмы биодеструкции ТМТД 31
Глава II. Объекты и методы исследования 33
2.1. Характеристика объекта исследования 33
2.2. Микробиологические методы 36
2.3 Химические методы 42
Глава III. Численность и структура комплексов бактерий и микро мицетов почв в окрестностях Кильмезского полигона захоронения пестицидов 44
3.1 Численность комплексов бактерий и микромицетов почв окрестностей Кильмезского полигона захоронения пестицидов 44
3.2 Сравнение структуры комплексов почвенных бактерий 45
3.3 Сравнение структуры комплексов почвенных микромицетов 47
Глава IV. Изучение физиолого-биохимических признаков изолятов Trichoderma viride, выделенных из почв в районе Кильмезского полигона захоронения пестицидов 55
4.1 Фенотипические различия между изолятами Trichoderma viride, выделенными из почв района исследования 55
4.2 Адаптивные реакции Т. viride S11 на присутствие симазина и ТМТД в среде 57
4.2.1 Выявление способности Т. viride SI 1 к биодеструкции ТМТД и симазина 59
4.2.2 Выявление биохимических адаптивных реакций Т. viride SI 1 на присутствие в среде ТМТД и симазина 61
4.2.3 Выявление морфобиологических адаптивных реакций Т. viride SI 1 на присутствие в среде ТМТД и симазина 65
Глава V. Биодеструкция пестицидов почвенными микроорганизмами 78
5.1 Отбор перспективных штаммов микроорганизмов-деструкторов 78
5.1.1 Селекция наиболее устойчивых к действию пестицидов штаммов микроорганизмов в периодической культуре 79
5.1.2 Выявление антагонизма между штаммами микромицетов и бактерий 84
5.1.3 Определение чувствительности штаммов к высоким концентрациям ТМТД и симазина 84
5.2 Определение эффективности биодеструкции ТМТД и симазина искусственными ассоциациями микроорганизмов в модельных условиях 88
5.2.1 Степень биодеструкции пестицидов ассоциациями микроорганизмов 89
5.2.2. Фитотоксичность культуральной жидкости и растворов пестицидов 95
Заключение 100
Вы воды 105
Список литературы 107
Приложения 141
- Ферменты, участвующие в биодеструкции пестицидов
- Сравнение структуры комплексов почвенных микромицетов
- Выявление морфобиологических адаптивных реакций Т. viride SI 1 на присутствие в среде ТМТД и симазина
- Степень биодеструкции пестицидов ассоциациями микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность темы. Пестициды - химические средства защиты растений, интенсивное и не всегда обоснованное применение которых привело к тому, что в последнее время они рассматриваются также в числе самых опасных синтетических поллютантов (Ермаков и др., 2001; Ананьева, 2003). Одной их серьезных экологических проблем является загрязнение природных объектов органическими пестицидами, обладающими высокой токсичностью и персистентностью (Попов и др., 2003). Кроме мест интенсивного применения пестицидов, потенциальную опасность для окружающей среды и человека несут места их захоронения - специальные подземные бетонированные бункеры или колодцы. Одним из самых крупных среди таких объектов в РФ является Кильмезский полигон захоронения непригодных к использованию пестицидов и ядохимикатов (Кировская область), в котором захоронено около 590 т препаратов химической защиты. Токсичные вещества могут проникать из могильников в окружающую среду и создают угрозу для всех живых организмов, включая почвенное микробное население (Thyssen, 1998; Wodageneh, 1998). Большинство проводимых исследований посвящено изучению влияния пестицидов на популяции микроорганизмов в почвах агроценозов (Alexander, 1999; Soil pollution..., 2004), тогда как вопросы изучения почвенных микробных комплексов в районах захоронения пестицидов, освещены недостаточно. В то же время микроорганизмы, выделенные из экосистем, подвергающихся длительному воздействию пестицидов, обладают потенциалом к более быстрому разложению данных соединений (Nowak, 1998), что делает необходимым изучение микробных сообществ почв, загрязненных пестицидами, как для оценки биологического риска, так и для отбора перспективных агентов для технологии биоремедиации природных объектов.
Цель работы - изучение структуры микробных комплексов подзолистых почв в районе Кильмезского полигона захоронения пестицидов и поиск микроорганизмов-деструкторов органических пестицидов тетраметилтиурам-дисульфида (ТМТД) и симазина.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Дать характеристику изменений в структуре микробного комплекса подзолистой почвы в условиях пестицидного загрязнения.
Описать адаптивные реакции у доминирующих в комплексе микроорганизмов (на примере Trichoderma viride) на присутствие в среде органических пестицидов ТМТД и симазина.
Путем селекции в условиях периодического культивирования в присутствии ТМТД и симазина выделить наиболее резистентные штаммы бактерий и микромицетов и провести анализ их свойств.
Составить искусственные ассоциации устойчивых к пестицидам изолятов бактерий и микромицетов и определить их эффективность в отношении биодеструкции ТМТД и симазина в условиях лабораторной модели.
Научная новизна работы. На основании морфологических и биохимических признаков (для бактерий) и экологических показателей (для микромицетов) впервые выявлены различия в структуре между комплексами микроорганизмов подзолистых почв из зоны влияния Кильмезкого полигона захоронения пестицидов и фоновой территории.
Установлено, что грибы рода Trichoderma, часто встречающиеся в комплексе микромицетов почвы с фоновой территории, переходят в разряд доминантных в комплексе при пестицидном загрязнении.
Выявлена характерная морфобиологическая реакция гриба Т. viride на возрастание в среде концентрации симазина и ТМТД, заключающаяся в формировании мицелиальных агрегатов различной плотности. С увеличением степени коагрегации мицелия доля неагрегированного мицелия соответственно снижалась, а скорость биодеструкции пестицидов, наоборот, возрастала. Экспериментально показана существенная роль процессов агрегации гиф в увеличении устойчивости микромицета Т. viride к симазину и ТМТД.
Показано, что эффективность биодеструкции симазина и ТМТД искусственными ассоциациями наиболее резистентных к данным пестицидам
представителей аборигенной почвенной микрофлоры выше при использовании бактериальной ассоциации, чем грибной и смешанной (грибы+бактерии).
Практическая значимость работы. Выявленные перестройки в структуре комплексов почвенных микромицетов и бактерий в зоне влияния объекта учтены при разработке методов биоиндикации почв на загрязнение органическими пестицидами. Полученные результаты вошли в разработанную с участием автора данного исследования областную программу «Комплексный экологический мониторинг окружающей среды в районе Кильмезского полигона захоронения пестицидов в Кировской области» (2008-2010 гг.).
Составлена рабочая коллекция, включающая 17 бактериальных изолятов и 4 изолята микромицетов из загрязненных пестицидами почв, перспективных для разработки технологий биоремедиации почв, загрязненных ТМТД и симазином.
Штамм гриба Т. viride S11 рекомендован для использования в целях биотестирования в отношении ТМТД и симазина.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2009; 2010); Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009; 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009» (Пущино, 2009); V молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009; 2010), областной научно-практической конференции молодежи «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2010), 14-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010).
Публикации. Материалы исследований изложены в печатных работах,
в том числе 4 статьи опубликованы журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых изданий ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав экспериментальной части, заключения, выводов,
Ферменты, участвующие в биодеструкции пестицидов
Микробиологическая трансформация пестицидов по своей природе в значительной степени не отличается от трансформации природного органического вещества (Biology of..., 1999).
Структура большинства синтетических пестицидов представляет собой относительно простой углеводородный скелет (ароматический или алифатический) с разнообразными заместителями, такими как галогены, фосфатные группы или нитрогруппы. Устойчивость к биоразложению обеспечивается прочными химическими связями или заместителями в составе ксенобиотика, которые блокируют реакции окисления. После удаления этих заместителей, стабилизирующих электроны, углеродный скелет легко подвергается детоксикации и трансформации многими почвенными микроорганизмами в результате биохимических реакций окисления, гидролиза, восстановления, связывания и др. (Kwong, 2002; Современная ...,2005).
Окисление. У бактерий основными ферментами, участвующими в окислении пестицидов, являются моноокисгеназы, флавинмонооксигеназы и диоксигеназы (Cassidy et al., 1999). У микроорганизмов, в отличие от растений, многие оксидоредуктазы различных метаболических путей могут окислять нитроароматические вещества. Многие из этих ферментов выделены, а их гены клонированы и секвинированы (Zablotowicz et al., 2001). Данные реакции могут осуществлять представители различных родов аэробных бактерий (Leung et al., 1997; Kadiayala, Spaine, 1998). В зависимости от структуры азот может быть отщеплен до или после разрыва ароматического кольца. Флавинмонооксидаза штамма Sphinogomonas sp. UG30 может удалять нитрат из гербицида 4,6-динитрокрезол, но не из пестицида динозеп (4,6-динитрокрезол-о-бутилфенол), по причине пространственного затруднения объемной бутиловой группы динозепа (Zablotowicz et al., 1999). В итоге, эти пути деструкции нитроароматических соединений позволяют гидроксилировать, разрывать кольца, т.е. осуществлять реакции, предшествующие полной деградации многих ксенобиотиков.
Грибы белой гнили Phanerochaete chysosporium имеют высокий потенциал для трансформации ксенобиотиков, основанной на системе свободнорадикальной деструкции лигнина (ферменты лигнинпероксидазы, магний-зависимой пероксидазы). Поэтому данные грибы способны окислять широкий крут поллютантов, например полихлорированные бифенилы и нитроароматические соединения (Ban;, Augst, 1994). Известно, что в большинстве случаев продукты полимеризации могут уменьшать токсичность за счет соединения с субстратом (Dec, Bollag, 2000).
Гидролиз. Гидролитические ферменты разрывают химические связи в субстрате, присоединяя Г или ОН . Существует ряд гидролитических ферментов, способных метаболизировать различные субстраты, в частности, содержащие амидные, карбоматные, эфирные функциональные группы. Такие гидролазы могут относиться к экзо- и эндоферментам, осуществляющим реакции в аэробных и анаэробных условиях. Как и большинство известных энзимов этого класса, данные гидролазы обладают широкой субстратной специфичностью, позволяющей, таким образом, участвовать в трансформации различных пестицидов. Гидролиз сложной эфирной связи в пестицидах описан в работах (Hoaglang, Zablotowicz, 2001). Данный процесс осуществляется главным образом за счет эстераз и, в меньшей степени, за счет липаз и протеаз. Микробные эстеразы, как и растительные, характеризуются Gly - X - Ser - X - Gly мотивом (Brenner, 1988). Ser в данной рекции выступает в качестве нуклеофильного агента, способствуя разрыву эфирной связи (Cygler et al., 1995). Несколькими авторами показан микробный гидролиз в почве дихлорфеникола (Gaynor, 1992) и феноксапроп-этила (Kocher et al., 1985; Smith, 1989) смешанной бактериальной культурой (Gennari et al., 1989), чистыми культурами или клеточными экстрактами (Zablotowiczet al., 2000; Hoaglang, Zablotowicz, 2001). Четыре типа эстераз были описаны у Pseudomonas fluorescens, каждый из которых отличался белковой структурой, локализацией в клетке, субстратной специфичностью (Choi et al., 1990). Многие эстеразы были клонированы и секвинированы, а некоторые из них тестированы на гидролиз пестицидов.
Другим важным ферментом является арилациламидаза. Данный фермент у микроорганизмов более вариабелен, чем у растений. Например, у некоторых штаммов Pseudomonas fluorescens круг субстратов ограничен ацетилидными пестицидами (Zablotowiczet al., 1995), но имеет достаточно широкий субстратный круг, включающий ациланилиды, фенилкарбоматы и замещенные пестициды на основе фенилмочевины (Engelhardt et al., 1973). Некоторые микроорганизмы могут гидролизовать амидную связь в молекуле пропанила. Арилациламидаза выделена в чистом виде из представителей нескольких бактериальных родов: Bacillus sphaericus (Engelhardt et al., 1973), P. fluorescens (Hammond et al., 1983), P.pickettii (Hirase, Matsunaka, 1991), P. aeurugenosa (Riley, Behal, 1971), Nocardia globerula (Yoshioka, 1991) и коринеформные бактерии (Mochida, 1993). Арилациламидазы имеют размер от 52,5 до 127 Ша и различны по характеру агрегации субъединиц, то есть некоторые из них мономеры, димеры или тетрамеры. Также все амидазы характеризуются гидрофобным Gly- Gly-Ser-Ser мотивом. В литературе достаточно мало данных о роли фосфатаз и сульфатаз в метаболизме пестицидов у растений и микроорганизмов (Hoaglang, Zablotowicz, 2001). Микробный гидролиз фосфорорганических пестицидов был изучен у Pseudomonas dimimita (Chaudhry et al., 1988; McDaniel et al., 1988) и Flavobacterium spp. (Mulby et al., 1989). Сообщалось, что грибы Trichoderma harzianum (Katayama et al., 1993) и Phanerochaete chrysosporium (Kullmas, Matsumura, 1996) гидролизуют инсектицид эндосульфан.
Вообще, достаточно много известно о гидролизе ксенобиотиков у микроорганизмов. В то же время принципиальная физиологическая роль многих гидролитических ферментов остаётся неясной и необходимы дальнейшие исследования для понимания механизмов действия и регуляции гидролитических ферментов микробного происхождения (Hoaglang, Zablotowicz, 2001).
Восстановление. Среди восстановительных реакций детоксикации пестицидов наиболее изученной является реакция нитровосстановления. У микроорганизмов существует три основные пути восстановительного метаболизма нитроароматических соединений: ароматическое нитровосстановление, частичное нитровосстановление и гидрогенизация. Восстановительный метаболизм нитроароматических ксенобиотиков опосредован нитроредуктазными ферментами, найденными у аэробных и анаэробных микроорганизмов (Zablotowicz et al., 2001). Эти ферменты представлены флавопротеинами, которые используют NAD(P)H в качестве восстановительного эквивалента, нуждаются в FMN и/или FAD в качестве кофакторов, отличаются различной чувствительностью к концентрации СЬ. Некоторые бактерии образуют различные ароматические нитроредуктазные изоферменты (Kinouchi, Ohnishi, 1983; Bryant et al., 1998). Иногда довольно сложно разделить биологическое и химическое восстановление ксенобиотиков потому, что восстановление ароматических нитрогрупп, может быть сопряжено с анаэробным восстановлением гуминовых кислот и ионным восстановлением (Oyamada, Kuwatsura, 1989). Трансформация пестицида ацифлуорфена до аминоацифлуорфена является общим примером реакции восстановления нитроароматического соединения бактериями в аэробных (Andreoni et al., 1994) и анаэробных (Gennari et al., 1994) условиях в бесклеточных экстрактах Enterobacter cloacae и P. fluorescens (Zablotowlcz et al., 1997). Аминоацифлуорфен faminoacifluorfen) подвержен сорбции и встраиванию в состав почвенного органического вещества (Zablotowicz et al., 1997; Locke et al., 1997).
Бактериальное частичное восстановление некоторых ксенобиотиков было показано на примере п-нитробензола (Groenewegen, de Bont, 1992; Groenewegen et al, 1992) и нитробензена (Nishino, Spaine, 1993). У бактерий реакции гидрогенизации нитроароматических соединений используются в случае, когда данные соединения являются единственными источниками углерода или азота (Lenke, Knackmuss, 1992; Lenke et al., 1992).
Реакция связывания пестицидов. Под связыванием пестицидов понимают метаболические процессы образования ковалентных связей между природными биохимическими соединениями и пестицидами, облегчающие их детоксикацию, комлартментализацию, депонирование и минерализацию (Hall et al., 2001). Обычно связывание осуществляется при помощи экзо- и эндоферментов различных организмов. Если у растений связывание происходит в основном с Gly, глюкозой и уредином (Van Eerd et al., 2003), то микробная конъюгация включает в себя реакции алкилирования, ацилирования и нитрования, которые могут проходить внутри и вне клетки. В процессе деградации лигнина грибами происходит в основном разрушение углеводов с одновременным высвобождением токсичных фенолов. Механизм детоксикации данных соединений заключается во внеклеточном связывании фенолов с ксилозой. Подобные процессы используются грибами для внеклеточной детоксикации пестицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т (Reddy et al., 1993).
Сравнение структуры комплексов почвенных микромицетов
Одним из перспективных направлений биомониторинга является оценка качества природных сред по изменениям структуры комплексов микромицетов (Марфенина, 2005; Хабибуллина, 2005; Bloem et al., 2006). Поэтому комплекс данных микроорганизмов нами изучался более подробно.
Основу грибных сообществ почв исследуемого района составляли представители 12 родов дейтеромицетов.
Комплекс микроскопических грибов в почве с ПМ Ф был представлен видами, относящимися к 11 родам. Определение структуры комплекса на основе пространственной частоты встречаемости дало возможность выявить доминатные, типичные частые, типичные редкие и случайные роды (рис. 6). Обнаружено, что в комплексе микромицетов почв с ПМ Ф к разряду доминирующих относились представители рода Penicillium, к числу типичных частых - виды pp. Trichoderma, Cladosporium, типичных редких -Aspergillus, Acremonium, Geomyces, Humicola, Paecilomyces, а к числу случайных - Phialophora, Geothrichum, Scopulariopsis.
К числу отличительных особенностей структуры комплекса микромицетов почвы с ПМ 1 по сравнению с ПМ Ф являлись:
1) сокращение количества родов с 11 до 6;
2) снижение частоты встречаемости представителей рода Aspergillus;
3) исчезновение из комплекса типичных представителей родов Cladosporium, Humicola, Acremonium и Paecilomyces;
4) появление нового рода Ulocladium;
5) переход рода Trichoderma из разряда часто встречающихся в разряд доминирующих.
Возможно, данные различия в структуре комплексов почвенных микромицетов связаны с присутствием в подзолистой почве с ПМ 1 пестицидов, потому как многие микроскопические грибы чувствительны к токсическому действию пестицидов и к продуктам их деструкции, обладающим фунгицидным эффектом (Awadalla, El-Refaie, 1993; Nowak, 1998; Семенкова, Соколова, 2003).
Отмечено, что в комплексе почвенных микроскопических грибов ПМ 1 по сравнению с ПМ Ф обилие грибов родов Trichoderma и Penicillium было больше в два и в три раза соответственно. В тоже время значение этого показателя для представителей рода Aspergillus в почве с ПМ 1 было меньше в 6,6 раз по сравнению с ПМ Ф (табл. 5). Возможно, эти изменения также являются следствием пестицидного загрязнения почвы на территории вблизи объекта.
В загрязненных пестицидами подзолистых почвах были отмечены различия по видовой представленности родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium по сравнению с аналогичной почвой фоновой территории. В комплексе почвы с ПМ 1 было обнаружено два представителя рода Trichoderma (Т. viride, Т. harzianum) и один вид Aspergillus flavus. В комплексе миромицетов почвы с ПМ Ф род Trichoderma был представлен тремя видами (Т. viride, Т. koningii, Т. harzianum), род Aspergillus — тремя видами (A. niger, A. flavus, A. terreus). В то же время в род Penicillium в комплексе подзолистой почвы (ПМ 1), загрязненной пестицидами, был представлен пятью видами {Penicillium notation, P. purpurogenum, P. cetrinum, P. thommii, Penicillium spj, в то время как в комплексе почвы с ПМ Ф этот род микромицетов представлен тремя видами {Penicillium notatum, P. purpurogenum, P. thommi). В силу того, что представители различных видов микромицетов одного рода отличаются по чувствительности к пестицидам (Bioindicator sysytems of ..., 1996), мы предполагаем, что внутриродовые различия в комплексах подзолистых почв обусловлены пестицидным загрязнением. Важной частью биомониторинга является сравнение комплексов микромицетов по значениям индексов видового разнообразия. Необходимым и достаточным условием при определении этих показателей является разделение особей по видам на основе фенотипических признаков (Андреев, 2002).
Видовое разнообразие мицелиальных грибов в почвах, загрязненных пестицидами, (ПМ 1) было в 2 раза ниже (Н=2,14), по сравнению с аналогичной почвой на фоновой территории (Н=5,04).
При исследовании взаимоотношения видов микромицетов в комплексе подзолистых почв с ПМ1 и ПМ Ф методом рангового распределения (Уиттекер, 1980), ними было показано, что кроме снижения биоразнообразия меняются и взаимоотношения видов в комплексе микромицетов подзолистых почв с ПМ 1 и ПМ Ф (рис. 7). Кривая доминирования-разнообразия комплекса микромицетов ПМ 1 имеют более крутой наклон, чем аналогичная кривая ПМ Ф. Это свидетельствует о большем доминировании видов-доминантов в комплексе микромицетов почв с ПМ 1 по сравнению с комплесом почв с ПМ Ф. Эти различия могут быть обусловлены пестицидным загрязнением почвы, в районе влияния объекта. Вообще, такой вид кривых характерен для сообществ на начальных стадиях сукцессии (Yoshioka, 2008).
Сравнение комплексов микромицетов, выделенных из исследованных почв, с помощью коэффициента сходства Сьеренсена (Ks=0,52) подтверждает существенные различия в комплексах микромицетов, возможно, также обусловленных воздействием пестицидов.
Таким образом, полученные результаты, свидетельствуют о наличии изменений в структуре микробных комплексов подзолистых почв, загрязненных ТМТД и симазином. Однако, эти изменения могут быть следствием хронического воздействия, связанного с вымыванием пестицидов из захоронения. Поэтому целесообразно проводить постоянный экологический мониторинг данных территорий для предупреждения более серьезных негативных последствий.
При сравнении собственных результатов исследования с ранее опубликованными, посвященных влиянию различных пестицидов на микробиоту почв, были обнаружены общие закономерности. В частности, A.D. Ayansina и В.А. Oso (2006) было отмечено снижение разнообразия микромицетов почв, загрязненных триазиновыми пестицидами, при этом наиболее часто в таких комплексах встречались представители pp. Penicillum, Trichoderma, Aspergillus. Li X. и соавторами (2008) в модельном опыте по определению влияния на почвенные микромицеты пестицида метамидофоса установили, что при внесении данного химического препарата даже в малых концентрациях наблюдается снижение общего видового разнообразия грибов.
Однако, что в исследованиях других авторов приводятся противоположные результаты. Например, Ratcliff A.W. и соавторами (2006) при изучении влияния гербицида глифосата на комплекс микромицетов лесных почв не выявили существенного влияния на структуру микромицетов, но при этом было отмечено увеличение общей грибной биомассы. Следовательно, вопрос о влиянии пестицидов на структуру комплекса почвенных микромицетов нуждается в дальнейших исследованиях.
Особенности комплексов микромицетов дерново-подзолистой и болотной почв
Комплекс микромицетов дерново-подзолистой почвы с ПМ 2 был представлен видами шести родов. К разряду доминирующих относились виды рода Trichoderma, к типичным частым - Penicillium, Acremonium, типичных редких — Paecilomyces, а к случайным — Geomyces.
Микромицетный комплекс аллювиальной болотной почвы с ПМ 3 включал представителей четырех родов. Виды рода Trichoderma доминировали в комплексе, представители pp. Penicillium, Geothrichum были типичными частыми, а грибы p. Geomyces — типичными редкими (рис. 6).
Несмотря на различия в генезисе и свойствах почв с площадок мониторинга, расположенных в зоне влияния объекта, нами были отмечены общие закономерности в структуре комплекса микромицетов всех трех площадок мониторинга:
1) узкий (4-6 родов) спектр почвенных микромицетов;
2) доминирование в комплексе рода Trichoderma.
Отмечено, что вид Trichoderma viride имел наибольшую частоту встречаемости в комплексах микромицетов почв с ПМ 1 (80%), ПМ 2 (80%), ПМ 3 (100%о). Возможной причиной этого может быть присутствие в этих почвах пестицидов.
Выявление морфобиологических адаптивных реакций Т. viride SI 1 на присутствие в среде ТМТД и симазина
Реакцию микромицетов на присутствие поллютантов в среде можно фиксировать по накоплению биомассы. Под влиянием пестицидов наблюдалось снижение биомассы в 1,5-2 раза в опытных вариантах на первые и третьи сутки культивирования Т. viride S11 по сравнению с контролем (табл. 10).
Необходимо отметить, что значение биомассы гриба в вариантах с ТМТД было примерно в 2 раза меньше, чем в аналогичных вариантах с симазином, что возможно связано с фунгистатическим эффектом, оказываемым ТМТД. На седьмые сутки значение биомассы гриба в контроле достоверно не отличалось от каждого из опытных вариантов. Это может косвенно свидетельствовать о преодолении Т. viride S11 токсического действия пестицидов.
В структуре биомассы Т. viride S11 в зависимости от концентрации пестицида в среде также были выявлены отличия по вариантам опыта.
При глубинном культивировании биомасса Т. viride S11 была представлена различными морфологическими структурами: мицелиальные агрегаты, свободный неассоциированный мицелий и споры (рис.11). Известно, что формирование каждой морфобиологической структуры зависит от большого количества факторов: возраста и посевной дозы гриба, химического состава и рН среды, температуры, а также наличия различных органических соединений, таких как полимеры, сурфактанты и др. (Thomas, 1992; Lejeune et al., 1995; Pazouki, Pand, 2000; Papagianni, 2004).
Характерной морфобиологической реакцией Т. viride S11 на повышение концентрации пестицидов в среде было увеличение концентрации мицелиальных агрегатов. На первые сутки культивирования ни в контрольном, ни в опытных вариантах не наблюдалось формирования мицелиальных агрегатов. На третьи сутки культивирования количество данных структур превышало контрольное значение в вариантах с симазином в 1,3-3,6 раза, а в вариантах с ТМТД - в 1,1-4,2 раза в зависимоти от концентрации пестицида в среде. На седьмые сутки культивирования только при высоких значениях содержания пестицидов (5 и 10 ПДК) концентрация мицелиальных агрегатов Т. viride S11 достоверно отличалась от контроля. Количество мицелиальных агрегатов гриба в контроле уступало вариантам с ТМТД в 2,5 и 2,8 раза, а симазина - в 1,8 и 2,2 раза (табл. 11). Эти результаты указывают на важную роль агрегации мицелия в преодолении грибом Т. viride S11 токсического действия симазина и ТМТД.
С повышением исходной концентрации пестицида в среде было отмечено увеличение степени ассоциации мицелиальных агрегатов Т. viride S11 в более сложные структуры, представляющие собой ассоциацию 2-3 агрегатов. При этом количество мицелиальных агрегатов гриба, входящих в состав таких сложных образований, колебалось по мере увеличения концентрации пестицида в среде от 19,0 до 76,0% от общего количества агрегатов для вариантов 2, 5, 10 ПДК с симазином и 1, 2, 5, 10 ПДК с ТМТД (табл.11). Таким образом, выявлена закономерность увеличения концентрации мицелиальных агрегатов гриба Т. viride S11 при повышении концентрации пестицидов в среде.
В присутствии пестицидов значение диаметра мицелиальных агрегатов Т. viride S11 достоверно не отличалось от контрольного значения на третьи и седьмые сутки культивирования. Несмотря на это, на седьмые сутки удалось выявить тенденцию изменения диаметра мицелиальных агрегатов от концентрации пестицида в среде: в вариантах опыта с малыми концентрациями (от 0,5 до 2 ПДК) пестицидов средние значения диаметра агрегатов были в 1,5-2,5 раза больше, чем в контроле. В то же время в вариантах с симазином и ТМТД, взятых в концентрациях 5 и 10 ПДК, значения этого показателя существенно не отличались от контроля. Таким образом, нами не установлено зависимости размера мицелиального агрегата Т. viride S11 от концентрации пестицида в среде и от времени культивирования.
Необходимо отметить, что при измерении диаметра и площади мицелиальных агрегатов Т. viride S11 в контрольном варианте на седьмые сутки культивирования было выявлено уменьшение значений данных параметров в 3,2 раза по сравнению со значениями этих параметров на третьи сутки культивирования. Возможным объяснением этому является действие центробежных сил при перемешивании среды. Подробно это было исследовано Edelstain L. и Hadar Y. (1983). Авторами было установлено, что при постоянном перемешивании агрегаты мицелиальных грибов под действием механических сил распадаются на несколько частей. Дальнейший рост этих фрагментов приводит к формированию новых агрегатов меньшего диаметра (рис. 12). При этом в наибольшей степени подвержены разрыву наименее плотные агрегаты, у которых периферическая зона преобладает над центральной (Metz, Kossen, 1977).
Большинство исследований по влиянию факторов среды на морфологическую структуру микромицетов проводится на примере грибов рода Aspergillus. При этом во всех работах отмечается тот факт, что явление агрегации мицелия грибов рассматривается как вариант приспособления гриба к неблагоприятным условиям среды в целом. Например, в исследованиях Cui Y.Q. и соавторов (1997) на примере Aspergillus awamori было показано, что усиление ассоциации мицелия является неспецифической реакцией гриба на экстремальные условия среды: низкие температуры, низкая степень аэрации и др. VillenaG.K. с соавторами (2010) на примере A. niger методами сканирующей и криосканирующей микроскопии было показано, что мицелиальные агрегаты представляют собой плотно переплетенный мицелий с небольшим количеством каналов. Формирование данной структуры рассматривается авторами как вариант уменьшения площади взаимодействия со средой. Таким образом, наши исследования так же подтвердили тот факт, что агрегация является адаптивной реакцией на действие неблагоприятных факторов среды на примере гриба Trichoderma viride.
Необходимо отметить, что появление мицелиальных агрегатов только на третьи сутки культивирования можно объяснить некоторыми специфическими отличиями механизмов формирования этих структур грибами рода Trichoderma. Сразу после инокуляции происходит агрегация частиц (фрагменты мицелия, споры и т.д.) посевного материала. Затем происходят процессы прорастания спор, удлинения нитей мицелия, формирующих агрегат (Grimm et al., 2004). В случае инокуляции среды спорами их агрегации предшествует набухание. Этот феномен описан для грибов pp. Aspergillus, Phanerochaete и Syncephalastrnm. Однако, сообщается, что споры Trichoderma reesii набухают и прорастают без агрегации (Fontaine et al., 2010), что замедляет процесс образовании мицелиальных агрегатов по сравнению с другими микромицетами. Образование мицелиальных агрегатов на примере Т. viride S11 показано в Приложении 3.
Известно, что физиологическое состояние мицелия гриба зависит от его локализации в составе агрегата. Для гифов периферической зоны характерна большая чувствительность к действию поллютантов, по сравнению с гифами центральной зоны (Znidarsic, Pavko, 2001), поэтому доля периферической зоны в структуре агрегата также может служить индикатором воздействия факторов среды на гриб (Cui et al., 1998).
Значение KD определяли на третьи и седьмые сутки культивирования. В вариантах с пестицидами было выявлено уменьшение значения KD мицелиальных агрегатов Т. viride SI 1 на 5-16% в вариантах с симазином и на Ъ— 2% - с ТМТД по мере культивирования, что свидетельствует о возрастании плотности этих структур. В то же время в контрольном варианте было установлено увеличение значения коэффициента KD мицелиальных агрегатов Т. viride SI 1 в 1,9 раза по мере культивирования (рис. 13).
Таким образом, на седьмые сутки культивирования значение коэффициента KD мицелиальных агрегатов Т. viride SI 1 в каждом из опытных вариантов уменьшалось в 2,1-3,5 раза по сравнению с контролем (85,7%) по мере увеличения концентрации пестицида в среде. Эти данные позволяют нам предполагать то, что увеличение плотности мицелиальных агрегатов является адаптивной морфобиологической реакцией гриба Т. viride S11 на присутствие ТМТД и симазина в среде. Наглядно уменьшение периферической зоны мицелиальных агрегатов Т. viride S11 при увеличении пестицида в среду показано на Рис. 14.
Степень биодеструкции пестицидов ассоциациями микроорганизмов
Нами был поставлен модельный опыт по выявлению способности к биодеструкции ТМТД и симазина ассоциациями наиболее резистентных к данным пестицидам штаммов микроорганизмов.
Были составлены три вида искусственных ассоциаций: бактериальная (использовали штаммы Psendomonas sp. BAC8S1, Psendomonas sp. BAC11S2, Psendomonas sp. ВАС 15S2, Psendomonas sp. BAC20S2); грибная (использовали штаммы микромицетов Mycelia sterilia ТІ 1, Trichoderma viride SMI, Mycelia sterilia S22) и смешанная ассоциация (использовали штаммы бактерий и грибов). Культивирование микроорганизмов проводили в жидкой среде Чапека (рН 5,0) с использованием в качестве источника углерода ТМТД и симазина в концентрациях 0,2 и 0,4 мг/мл, соответственно. Контролем служили аналогичные варианты ассоциаций с добавлением глюкозы в концентрации 2% в качестве единственного источника углерода (рис. 17).
Выявлено, что все экспериментальные ассоциации микроорганизмов были в разной степени способны к биодеструкции ТМТД и симазина (табл. 18).
Продолжительность деструкции симазина и ТМТД исследуемыми микробными ассоциациями заметно различалась. Полная деструкция симазина бактериальной ассоциацией была отмечена уже на третьи сутки, тогда как грибной и смешанной - на седьмые сутки с начала культивирования. За период наблюдения полная деструкция ТМТД ни в одном из вариантов опыта не была достигнута. На 14 сутки инкубации наибольшее значение степени деструкции было в варианте бактериальной ассоциации (67,4%) по сравнению с грибной (59,3%) и смешанной (61,2%) ассоциациями.
Заслуживает внимания тот факт, что в пробах культуральной жидкости в вариантах с симазином не было обнаружено циануровой кислоты, что свидетельствует о биодеструкции данного пестицида до более низко молекулярных соединений.
В целом, для бактерий и микромицетов были характерны различные темпы биодеградации пестицидов. В варианте с бактериальной ассоциацией по мере культивирования происходит уменьшение темпов биодеструкции ТМТД в 2 раза, в вариантах грибной и смешанных ассоциаций, напротив, было характерно увеличение темпов биодеструкции этого пестицида в 1,2 раза.
Биомасса является важным параметром оценки процессов биодеградации пестицидов микроорганизмами (Sniegowski et al., 2009). Была отмечена тенденция увеличения значения данного показателя в ряду ассоциаций: бактериальная грибная смешанная. Биомасса бактериальных ассоциаций в опытных вариантах по сравнению с контрольным была меньше в 5 - 8 раз, а грибной - в 3 раза. В присутствии ТМТД смешанная ассоциация уступала контролю по биомассе в 3 раза, а в варианте с симазином значения достоверно не отличались (табл. 19).
Данные результаты дают основание предполагать, что ТМТД и симазин оказывают тормозящее действие на развитие микроорганизмов.
Вполне вероятно, что биодеструкция пестицидов осуществлялась неделящимися клетками организмов.
Среди пестицидов ТМТД наиболее медленно разлагался исследуемыми искусственными ассоциациями. Такие же результаты были получены $ahina N. и Tamer І). (2000). В эксперименте по разложению ТМТД бактериальными изолятами в подобных условиях было установлено, что степень биодеградации пестицида достигала 43,7%. В аналогичном эксперименте Rhichardson L. Т. (1954) было установлено, что ТМТД подвергается биодеструкции микроорганизмами более чем на 95% после 55 дней культивирования. Возможным объяснением этому является .снижение ферментативной активности микроорганизмов в присутствии данного пестицида (Aggarwal et al., 1973), либо снижение скорости синтеза некоторых гидродитических ферментов под действием ТМТД (Rahden-Staron et al., 1993).
Возможным объяснением меньшей скорости биодеструкции пестицидов на третьи сутки грибной ассоциацией по сравнению с бактериальной может служить то, что грибы, как эукариоты, имеют более продолжительную лаг-фазу по сравнению с прокариотами (Physiology of fungi, 1998), что отражается в более медленной биодеструкции ксенобиотиков на начальных стадиях. Такая же тенденция была отмечена Osman К.А. и соавторами (2008) при сравнении темпов биодеградации высокоперсистентного пестицида дикофола (кельтан) бактериальной ассоциацией {Azospirillium barasilense, Azotobacter chroococcum, Klebsilense pneiimoneae, Pseudomonas cepacia, Bacillus subtilis, Pseudomonas Jluorescens and Bacillus polymyxd) и ассоциацией микромицетов рода Trichoderma {T.viride, T.harzianum). Авторы установили, что на начальных этапах темпы биодеградации ассоциаций были примерно равными, а при дальнейшем культивировании грибы более интенсивно разлагали данный пестицид.
В целом, для бактериальных ассоциаций характерна высокая скорость биодеструкции симазина. Mondragon-Parada М.Е. и соавторами (2008) описана биодеградация симазина на 96% почвенным бактериальным консорциумом, состоящим из представителей родов Ochrobactrum, Mycobacterium, Celhdomonas, Arthrobacter, Microbacterium, Rhizobiiim и Psendomonas. Было показано, что продукты биологической минерализации симазина активно включаются в метаболизм данных микроорганизмов. Так, Smith D.S. и соавторы (2005) в модельном опыте изучали биодеграцию атразина при совместном культивировании восьми бактериальных штаммов: Agrobacterium tumefaciens, Caidobacter crescentus, Psendomonas putida, Sphingomonas yanioknyae, Nocardia sp., Rhizobiiim sp., Flavobacterium oryzihabitans и Variovorax paradoxus. Каждый микроорганизм контролировал определенный этап гидролиза атразина. При удалении представителей Nocardia sp. данный консорциум терял способность к деградации атразина. Эти результаты свидетельствует о высоком уровне взаимодействия бактериальных штаммов при биодеградации сим-триазиновых пестицидов.
Возможным объяснением более низкой скорости биодеградации пестицидов в вариантах смешанных ассоциаций является возникновение конкурентных и антагонистических отношений между бактериальными и грибными штаммами. В предварительных исследованиях на богатых питательных средах антагонизма между этими микроорганизмами не было установлено. Однако, при совместном длительном культивировании в средах с ограниченным количеством питательных веществ возможно возникновение конкуренции и антагонизма между грибами и бактериями. Так, в работе Mille-Lindblom С. с соавторами (2006) сообщается, что быстро растущие штаммы микромицетов наиболее чувствительны к присутствию бактерий при совместном культивировании. Между такими штаммами возникает конкуренция за субстрат. Это выражается в снижении скорости метаболизма микромицетов. Для многих бактерий p. Pseudomonas и почвенных микромицетов обнаружен антагонизм к широкому спектру микроорганизмов. При глубинном культивировании для грибов рода Trichoderma характерно выделение в среду вторичных метаболитов, обладающих широким спектром биологической активности: ингибиторов роста, токсинов, пигментов, антибиотиков (Singh, Singh, 2009). Среди последних наиболее часто встречаются бактериоциды (Brewer et al., 1982; Hanson, Howell, 2002) и фунгициды (Xiao-Yan et al., 2006; Microdes at ..., 2009). Данные соединения существенно снижают ферментативную активность присутствующих в среде бактерий и других грибов, что может снижать скорость ферментативной деградации пестицидов. В свою очередь, некоторые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, в частности, фенозин-1-карбоновая кислота, сидерофоры, ксидерофоры (Романенко и др., 2008), также проявляют фунгистатический эффект. Так, Hubbard J.P. и соавторами (1983) показано ингибирование роста Т. hamatum как при совместном культивировании со смешанной культурой псевдоманад, так и при добавлении только очищенного флуоресцирующего пигмента. Hassanein W.A. и соавторами (2009) показан фунгистатический эффект некоторых метаболитов P. aeruginosa zag2: пиоцианина, сидерофора, синильной кислоты - на представителей несовершенных и сумчатых грибов. Эти факты могут служить объяснением замедления темпов биодеструкции ТМТД смешанной ассоциацией по сравнению с бактериальной.
Снижение биомассы бактерий в опытных вариантах возможно объяснить ингибирующим действием пестицидов на клеточное деление. Chen H.L. и соавторы (2009) в серии опытов изучали влияние на P. putida трех пестицидов: р-цеперметрина, бенсульфурон-метилового и прометрина. Авторы установили линейную зависимость между коэффициентом ингибирования деления клеток и вносимой дозой каждого из ксенобиотиков.
Таким образом, данные результаты свидетельствуют о том, что наибольшая скорость биодеградации изучаемых пестицидов была характерна для бактериальной ассоциации в сравнении с грибной и смешанной ассоциациями.
