Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 CLASS Обзор литератур CLASS ы
1.1 Почвенная кислотность как средообразующий фактор для микроорганизмов 7
1.2 Алкалофилия и ацидофилия - свойства микроорганизмов. 8
1.3 Экологическая ниша актиномицетов 18
1.4 Ацидофильные актиномицеты , 21
1.4.1 Распространение и численность ацидофильных актиномицетов почвах 21
1.4.2 Таксономическое разнообразие ацидофильных актиномицетов 24
1.5 Особенности ацидофильных актиномицетов по сравнению с нейтрофильными 27
1.5.1 Изучение рН-требований ацидофильных актиномицетов 27
1.5.2 Морфологические признаки ацидофильных актиномицетов 29
1.5.3 Физиологические признаки ацидофильных актиномицетов 31
1.5.4 Генетические отличия ацидофильных актиномицетов 32
1.5.5 Антибиотическая активность ацидофильных актиномицетов 34
1.6 Термофилия и ацидофилия у прокариот , 38
1.7 Алкалофильные актиномицеты 41
1.7.1 Выделение алкалофильных актиномицетов из почв, их таксономическая принадлежность 41
1.7.2 Алкалофильные актиномицеты как продуценты ферментов и метаболитов 47
1.7.3 Место ацидофильных и алкалофильных актиномицетов в системе современных научных знаний 49
Глава 2 Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования 52
2.2 Методы исследования 53
Глава 3 Результаты исследований
3.1 Численность актиномицетов в различных почвах при выделении на кислых, щелочных и нейтральных средах 59
3.2 Таксономическая принадлежность актиномицетов, выделенных из различных почв на кислых, щелочных и нейтральных средах 65
3.3 Сравнительное исследование актиномицетных комплексов низинной торфяной почвы и пирогенных образований, формирующихся при пожарах на торфянниках 69
3.4 Диапазон значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, выделенных из почвы на средах с различными значениями рН 16
3.5 Особенности морфологической дифференцировки мицелия алкало- и нейтрофильных стрептомицетов 86
Обсуждение 91
Выводы 97
Список использованной литературы 98
- Особенности ацидофильных актиномицетов по сравнению с нейтрофильными
- Место ацидофильных и алкалофильных актиномицетов в системе современных научных знаний
- Таксономическая принадлежность актиномицетов, выделенных из различных почв на кислых, щелочных и нейтральных средах
- Особенности морфологической дифференцировки мицелия алкало- и нейтрофильных стрептомицетов
Введение к работе
Почвенная кислотность является важным физико-химическим показателем свойств почв и зависит от многих факторов. Она может влиять на почвенные микроорганизмы двояко: или непосредственно на внутреннюю среду клетки, или косвенно, путем изменений во внешней среде. Разграничить эти две формы влияния удается редко. Долгое время полагали (Стейниер и др., 1979), что из основных групп почвенных микробов устойчивостью по отношению к кислотности обладают грибы, в то время как большинство бактерий и актиномицетов неустойчивы(Alexander, 1964).
В 70-е годы группе американских исследователей удалось выделить и изучить коллекцию культур актиномицетов, способных расти в кислой среде.
В настоящее время возможность существования актиномицетов, способных расти в кислой или щелочной среде, уже не вызывает сомнений, изучены их свойства и особенности, однако об экологии этих мицелиальных прокариот по-прежнему известно немного.
Вопрос о месте и роли актиномицетов в почве весьма актуален. Изучение почв на территории России (многие из которых по естественным или антропогенным причинам являются кислыми или щелочными) должно предполагать рассмотрение характерных представителей микробоценоза данных местообитаний.
С другой стороны, изучение почвенных ацидофильных и алкалофильных актиномицетов несомненно представляет интерес для биотехнологии. Поиск продуцентов новых антибиотиков и ферментов с особыми рН-оптимумами действия, применение популяций актиномицетов для биоконтроля и биоремедиации, борьба с фитопатогенными грибами-практические задачи, для решения которых знания об ацидофильных и алкалофильных актиномицетах могут быть весьма ценными.
Целью работы явилось исследование экологических особенностей ацидофильных и алкалофильных актиномицетов и их места в комплексе почвенных мицелиальных.
Задачи исследования
Разработка селективных методов выделения и учета ацидофильных и алкалофильных актиномицетов из кислых, щелочных и нейтральных почв.
Сравнительный анализ актиномицетных комплексов, выявляемых на подкисленных, нейтральных и подщелаченных средах из почв и антропогенных субстратов с разной актуальной кислотностью.
Оценка радиальной скорости роста выделенных из почв ацидофильных, нейтрофильных и алкалофильных актиномицетов при различных значениях рН
А. Изучение особенностей дифференцировки мицелия нейтрофильных и алкалофильных актиномицетов на нейтральных и щелочных средах.
Научная новизна. Впервые установлено распространение алкалофильных актиномицетов в широком ряду почв и определена таксономическая структура их комплексов. Отмечена приуроченность алкалофильных актиномицетов к щелочным почвам, подтверждена установленная ранее приуроченность ацидофильных актиномицетов к кислым почвам.
Впервые рассмотрены особенности жизненного цикла алкалофильных актиномицетов на щелочной среде: -высокая скорость освоения субстрата (высокая радиальная скорость роста) наряду с ускоренным спорообразованием, -уменьшение значения рН среды культурой алкалофильного актиномицета до нейтрального при росте на щелочной среде.
Практическая значимость. Установление экологической ниши алкалофильных актиномицетов важно для расширения наших представлений о биоразнообразии микробного комплекса почв.
Знания об особенностях распространения и жизнедеятельности алкалофильных актиномицетов могут представлять существенный интерес для биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ по проекту 03-04-48324
Апробация работы. Основные положения работы доложены на пяти конференциях, в том числе двух международных, на заседании кафедры биологии почв совместно заседанием ВОП (Всероссийского Общества Почвоведов)
Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 8 печатных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 108 страницах текста, содержит 28 иллюстраций, 10 таблиц. Список литературы включает 111 наименований, в том числе 73 на иностранных языках.
Особенности ацидофильных актиномицетов по сравнению с нейтрофильными
Итак, было предложено, штаммы, растущие при 4-5 рН, но не растущие при 7,5 рН считать ацидофильными, а штаммы, растущие в диапазоне рН от 5,5 до 8,5 с максимумом при 7 рН — нейтрофильными. "Никакой штамм, растущий при рН 3,5 не мог расти выше 6,5. Только несколько культур с максимумом при 7,5 рН давали очень слабый рост при 4,5 рН. Таким образом, ацидотолерантность в отличие от ацидофильности — крайне редкое свойство и нетипичное явление для актиномицетов" (Williams et al., 1971). Эта точка зрения стала базовой и используется в литературе и по сей день.
Изучение способностей выделенных стрептомицетов выдерживать различные уровни рН позволило Хагедорну заключить, что большинство стрептомицетов наилучшим образом растет при том уровне рН, при котором их выделили из почвы (Hagedorn, 1976). В отличие от Вильямса, Хагедорн установил, что большинство стрептомицетов, выделенных из кислых почв и лучше растущих при пониженных значениях рН, способны выдерживать нейтральные условия среды. Тем самым, он ввел понятие об ацидотолерантных стрептомицетах, и показал, что их численность весьма высока (он сравнивал с данными Вильямса, что было, на наш взгляд, не вполне корректным, так как исследовались разные почвы).
Японские исследователи, направлено изучавшие актиномицеты в кислых почвах чайных полей (Nioh et ah, 1995), четко разделяли в своих исследованиях ацидофильные и ацидотолерантные формы по способности расти на нейтральной среде (накопление биомассы атиномицетами при разных значениях рН среды культивирования). Они заключили, что ацидотолерантные актиномицеты распространены среди стрептомицетов и близких к ним родов, а штаммы, предположительно отнесенные исследователями к семейству Pseudonocardiaceae, родам Actinoplanes и Glycomyces, являются ацидофильными (Nioh et aL, 1995).
Китайские исследователи (Jiang, Xu, 1993) выделяли актиномицеты из кислых мест обитаний на среды с уровнем рН 4,5. Выделенные актиномицеты были разделены ими на три типа:
Тнп 1 объединял ацидофильньие актиномицеты с оптимумом роста при 4,5» диапазоном роста рН 3,0—6,5 и отсутствием роста при рН 7,0.
К данному типу принадлежали более 70% выделенных штаммов.
Тнп 2 включал нейтрофильные стрептомицеты, растущие в диапазоне от 4,5 до 9,0 рН и состоял менее, чем из 30% выделенных штаммов.
Тнп 3 представлен только одним штаммом с диапазоном роста рН от 10 до 9,0 и оптимумом — при рН 4,5—6,5, ацидотолерантный актиномицет.
Поскольку Вильяме был первым и единственным исследователем, довольно подробно описавшим экологическую группу ацидофильных актиномицетов, все последующие авторы опирались на его мнение. Он считал, что ацидофилы не могут жить в нейтральных условиях, поэтому, когда другие исследователи выделили ацидофильные актиномицеты, у которых эта возможность была, им пришлось вводить понятие "ацидотолерантные . Так появилось представление о верхней рН-границе роста актиномицетов, как критерии "истинной ацидофильности".
Нам не представляется необходимым применительно к почвенным актиномицетам разграничивать ацидофильные и ацидотолерантные формы. Критерий, положенный в основу этого разделения — способность выживать в нейтральных условиях — демонстрирует степень приспособленности организма к своему месту обитания. Поскольку почва является гетерогенной системой со множеством микрозон, рН в которых может существенно отличаться от среднего значения, то чем шире границы значений рН, пригодные для выживания организма, тем более он приспособлен к обитанию в почве. Логично заключить, что об ацидофильности почвенного организма, в том числе актиномицета, следует судить по значению рН, являющемуся оптимальным для роста этого организма.
Поэтому нам представляется целесообразным использовать термин "почвенные ацидофильные актиномицеты" для культур актиномицетов, имеющих оптимум роста при значениях рН равным 4-5. Границы значений рН, пригодные для выживания этих актиномицетов, в зависимости от свойств почвы, из которой они выделены, могут находиться и в области нейтральных значений рН.
Термин "почвенные ацидофильньие актиномицеты" применим для всех культур актиномицетов, выделяемых на подкисленных средах и имеющих оптимум роста при рН 5 и менее.
Место ацидофильных и алкалофильных актиномицетов в системе современных научных знаний
Помимо перечисленных было выделено и описано множество антибиотиков из алкалофильных культур, однако, многие антибиотики оказываются нестабильными в щелочных условиях. Существует большая вероятность того, что продуцируемые антибиотики могут быть разрушены за время культивирования. Однако многие алкалофилы, в особенности актиномицеты, могут расти на нейтральных средах в заданных условиях, вырабатывая стратегии для восстановления биоактивных составляющих (Horikoshi, 1999).
Таким образом, алкалофилы являются активными продуцентами ферментов, ингибиторов ферментов и антибиотиков и имеют большой потенциал промышленного использования.
Мнение, бытовавшее в литературе прошлого века, о том, что "актиномицеты не являются чемпионами по устойчивости к условиям внешней среды" (Преображенская и др., 1978), становится все менее популярным. Причиной тому может служить широкое изучение антропогенных экосистем, условия в которых порой являются экстремальными для микроорганизмов.
С момента открытия алкалофильных бактерий было опубликовано более 1000 статей по различным аспектам их биологии (Horikoshi, 1999). Алкалофилы - уникальные микроорганизмы с большим потенциалом микробиологического и биотехнологического использования. Основными аспектами, привлекающими внимание исследователей к этой группе организмов в последите годы являются: внеклеточные ферменты и их генетический анализ, механизмы мембранного транспорта и рН-регуляция, таксономия алкалофильных микроорганизмов
В будущем, по-видимому, будут найдены новые области применения щелочных ферментов. Алкалофилы являются очень хорошим генетическим ресурсом для таких областей применения как производство сигнальных белков для гиперпродукции ферментов.
Сравнительное изучение почвенных алкалофильных, ацидофильных и традиционно выделяемых нейтрофильных актиномицетов позволит не только по-новому взглянуть на экологическую нишу, занимаемую мицелиальными прокариотами в целом, но и расширить спектр организмов, использующихся для поиска продуцентов антибиотически активных веществ.
Необходимость в защите культурных растений от фитопатогенных грибов — на фоне сомнений в безопастности выведения генетически устойчивых сельско-хозяйственных культур — стимулирует изучение естественных организмов, способных препятствовать инфицированию растения и не создавать угрозы для человека.
Таким образом, экстремофильные актиномицеты являются важным объектом изучения. Сведения о границах устойчивости актиномицетов к внешним факторам неуклонно пополняются. Ацидофильные и алкалофильные, психрофильные и термофильные, наконец, галофильные актиномицеты — возможность существования таких организмов уже не вызывает сомнения у специалистов (Goodfellow, Williams, 1983). Но, к сожалению, самостоятельным объектом изучения экстремофильные актиномицеты становятся не часто. К сожалению — ибо у этих организмов большие потенциальные возможности как объектов для биотехнологии. В настоящее время в литературе довольно много сведений о термофильных, галофильных и ацидофильных актиномицетах. Особенности алкалофильных актиномицетов изучены пока сравнительно хуже, однако и они, в последнее время вызывают все больший прикладной интерес со стороны ученых.
Таксономическая принадлежность актиномицетов, выделенных из различных почв на кислых, щелочных и нейтральных средах
В ходе исследования было установлено, что видовой состав актиномицетного комплекса на средах с различными значеними рН различен. В исследованиях ацидофильного и алкалофильного почвенного актиномицетного комплекса было отмечено, что в почвах разных типов в составе ацидофильных и алкалофильных актиномицетов преобладают представители рода Streptomyces. Как было установлено ранее Закалюкиной (Закалюкина и др., 2002), среди ацидофильных стрептомицетов преобладают виды, относящиеся к секции Imperfectus. Нами было установлено, что среди алкалофильных актиномицетов доминируют виды относящиеся к секции Cinereus. При этом среди нейтрофильных стрептомицетов в разных почвах могут доминировать виды, относящиеся к различным секциям.
В аллювиальной луговой карбонатной засоленной почве комплекс нйтрофильных стрептомицетов, выделяемый на нейтральной среде представлен стрептомицетными видами секции Cinereus Achromogenes, С.
Chromogenes и секции Helvolo-flavus Helvolus. Стрептомицеты разных видов в комплексе представлены примерно в равных долях (рис. 9). В комплексе алкалофильных стрептомицетов, выделяемом на щелочной среде, отмечается сужение видового разнообразия по сравнению с разнообразием нейтрофильного комплекса. Доминирующими здесь являются виды секции Cinereus Achromogenes (рис. 10).
В такыровидных солончаках (рис. 11) отмечено преобладание в стрептомицетном комплексе видов секции Cinereus серии Chromogenes. Это справедливо как для комплекса, выявляемого на нейтральной так и для комплекса на щелочной среде. Однако на среде с рН 8,4 среди видов секции Cinereus отмечены виды серий Chromogenes и Achromogenes (рис. 11).
В актиномицетном комплексе хемотехнозема грунтово-оглеенного присутствуют представители двух родов Streptomyces и Micromonospora (рис. 12). Доля микромоноспор оказывается наибольшей в актиномицетном комплексе, выявляемом на щелочной среде, по сравнению с долей микромоноспор в комплексах, выявляемых на нейтральной и подкисленной средах (рис 12, 13).
Рис. 12 Разнообразие актиномицетного комплекса в хемотехноземе грунтово-оглеенном на нейтральной (а) и подкисленной (б) средах В нейтрофильном стрептомицетном комплексе на нейтральной среде выявляются представители 3 серий и 4 секций (рис. 12, а). По сравнению с нейтральноым и ацидофильным комплексами в алкалофильном комплексе
Особенности морфологической дифференцировки мицелия алкало- и нейтрофильных стрептомицетов
Сравнительное исследование культуральных и морфологических свойств алкалофильных и нейтрофильных актиномицетов в процессе их роста на щелочной, подкисленной и нейтральное среде показало, что стрептомицеты двух групп имеют свои особенности.
Наблюдения за дифференцировкой мицелия проведено на примере нейтрофильного стрептомицета Streptomyces canescens штамм 7402 и алкалофильного стрептомицета S. resistomycificus штамм 8402.
Как алкалофильные, так и нейтрофильные стрептомицеты оказались либо не способными расти на среде с низким значением рН, либо их рост был значительно более слабым по сравнению с ростом на нейтральной питательной среде. Эта особенность оказалась наиболее ярко выражена у алкалофильных стрептомицетов. Так, образование воздушного мицелия у нейтрофильного стрептомицета 5. canescens штамм 7402 при росте на подкисленной среде наблюдалось уже к 5-м суткам роста, тогда как у алкалофильного S. resistomycificus штамм 8402 - только к 10-м суткам роста.
У нейтрофильного стрептомицета на нейтральной среде отмечен максимальный размер колоний по сравнению с колониями на подкисленной щелочной средах во все сроки наблюдения (рис. 24, 25). На подкисленной и щелочной среде эти стрептомицеты росли медленнее (рис. 24, 25).
Размер колоний алкалофильного стрептомицета на среде с рН 8 оказался большим, чем размер колоний на подкисленной и нейтральной средах, во все сроки наблюдения (рис. 24, 28). На щелочной среде у этого стрептомицета отмечены более интенсивная, чем на на нейтральной и подкисленной средах, коричневая окраска субстратного мицелия и питательной среды.
У нейтрофильного стрептомицета на подкисленной среде на 5-е сутки роста наблюдается колония с плохо развитым воздушным мицелием, гладкие споры на прямых спороносцах формируются к 10-м суткам роста и на 15-е сутки отмечено их освобождение из цепочек (рис. 24, 26). На нейтральной среде созревание и освобождение спор отмечено уже к 10-м суткам роста. На среде со значением рН 8,0 к 5-м суткам роста наблюдается образование коротких прямых спороносцев, спорообразование заканчивается к 10-м суткам роста, к 15-м суткам отмечается освобождение спор.
Мицелий и споры алкалофильного актиномщета Streptomyces resistomycificus ( штамм 8402). Шкала на фотографиях соответствует
а-20 мкм, 6=10 мкм, в, г=1 мкм Алкалофильный штамм при росте на подкисленной среде формирует голые колонии, лишенные воздушного мицелия (рис. 24, г). Только к 10-м суткам роста отмечено образование воздушного мицелия, спор в коротких спиральных цепочках, (спираль 1-3 оборота). Формирование более длинных спиральных цепочек спор (6-8 оборотов) (рис. 27) и освобождение спор из цепочек отмечено к 15-м суткам роста (рис. 28). На нейтральной среде к 5-м суткам роста полностью формируется колония с субстратным и воздушным мицелием, короткими спороносцами на воздушном мицелии (1-3 оборота) (рис. 27, 28). К 10-м суткам заканчивается процесс спорообразования и начинают освобождаться споры.
На щелочной среде уже к 5-м суткам роста на воздушном мицелий формируются длинные спиральные цепочки спор (6-8 оборотов) (рис. 28), освобождение спор отмечено к 10-м суткам роста. У алкалофильного штамма на 10-е сутки отмечено подкисление среды в процессе роста (с рН 8 до рН 7).
Таким образом, особенностью нейтрофильного стрептомицета является меньшая скорость роста колоний и замедление скорости спорообразования на подкисленной и щелочной средах по сравнению с ростом и развитием этого стрептомицета на нейтральной среде.
Особенностью алкалофильного стрептомицета является удлинение стадий жизненного цикла, которое выражается в задержке образования воздушного мицелия и спор на подкисленной среде по сравнению со скоростью образования воздушного мицелия и спор на нейтральной и щелочной среде и по сравнению с ростом нейтрофильного стрептомицета на подкисленной среде. Алкалофильный стрептомицет характеризуются высокой радиальной скоростью роста колоний (скоростью колонизации субстрата) и высокой генеративной активностью, выражающейся в более быстром созревании спор, при росте на щелочной среде по сравнению с этими показателями на нейтральной и подкисленной средой.
Можно предположить с достаточной степенью вероятности, что алкалофильные стрептомицеты обладают особым механизмом адаптации к условиям повышенного рН, проявляющимся в их способности интенсивнее колонизировать щелочную среду, чем нейтральную. Обладание этим механизмом позволяет алкалофильным формам снижать конкуренцию нейтрофильных стрептомицетов и развиваться в условиях щелочных почв.