Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
I. Почвенная кислотность как средообразующий фактор для микроорганизмов 7
II. Ацидофильность — свойство почвенных бактерий и грибов 9
III. Ацидофильные актиномицеты 14
1 .Распространение и численность ацидофильных актиномицетов в почвах 17
2.Таксономическое разнообразие ацидофильных актиномицетов 20
3.Особенности ацидофильных актиномицетов по сравнению с нейтрофильными
3.1 .Изучение рН-требований ацидофильных актиномицетов 23
3.2.Морфологические признаки ацидофильных актиномицетов 26
3.3.Физиологические признаки ацидофильных актиномицетов 27
3.4 Генетические отличия ацидофильных актиномицетов 29
3.5. Антибиотическая активность ацидофильных актиномицетов 31
IV. Термофилия и ацидофилия у прокариот 35
V. Место ацидофильных актиномицетов в системе современных научных знаний 38
Объекты и методы исследования 39
Результаты и обсуждение
Глава 1. Численность и таксономический состав актиномицетных комплексов в исследованных почвах, выявленные на подкисленных и нейтральных средах 47
Глава 2. Видовое разнообразие комплексов стрептомицетов на подкисленных и нейтральных средах 55
Глава 3. Таксономическое разнообразие комплексов микромоноспор, выявляемых на подкисленных и нейтральных средах 60
Глава 4. Установление диапазона значений рН для роста выделенных культур стрептомицетов 67
Глава 5. Особенности морфологической дифференциации почвенных ацидофильных актиномицетов 74
Глава 6. Антибиотическая активность культур ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов 86
Заключение 94
Выводы 95
Список использованной литературы 96
- Ацидофильность — свойство почвенных бактерий и грибов
- Антибиотическая активность ацидофильных актиномицетов
- Таксономическое разнообразие комплексов микромоноспор, выявляемых на подкисленных и нейтральных средах
- Антибиотическая активность культур ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов
Ацидофильность — свойство почвенных бактерий и грибов
Способность большинства организмов выживать при низких значениях рН ограничивается такими факторами, как состояние доступных питательных веществ, концентрация токсичных метаболитов и нестабильность при высоких концентрациях в среде ионов водорода (гидроксония). Следовательно, организмы, освоившие такие экониши, должны обладать особыми механизмами устойчивости.
В то же время способность расти и развиваться при низких значениях рН дает определенные преимущества ацидофилам, так как в этих условиях конкуренция со стороны других организмов почти отсутствует.
Изменение рН окружающей среды могут вызывать у многих микроорганизмов компенсаторные ферментативные сдвиги. Например, Escherichia coli реагирует на повышение кислотности среды синтезом декарбоксилаз аминокислот. Образующиеся в результате амины приводят к снижению кислотности среды. И напротив, повышение щелочности среды стимулирует образование дезаминаз аминокислот, что приводит к снижению рН (Ленгуорси, 1981).
Большинство активно метаболизирующих алкалотолерантных микроорганизмов имеют склонность к снижению рН в процессе роста. Предполагали, что такая реакция может являться вторичным механизмом устойчивости микробных клеток к щелочной среде {Kushner, 1964). Однако, не известно, каков первичный механизм, обеспечивающий организмам возможность роста в условиях высокой концентрации гидроксильных ионов.
Для факультативных ацидофилов и особенно ацидотолерантных организмов таких наблюдений не проводилось, хотя для облигатных ацидофильных экстремофилов не было показано изменения рН в процессе активного роста. Очевидно, экстремофилы не просто переносят крайне низкие значения рН, а нуждаются в них для своего роста и развития (Жизнь микробов в экстремальных условиях, 1981).
В зависимости от отношения к кислотности среды прокариоты могут быть разделены на несколько групп (рис.1). Оптимальный рН для роста подавляющего большинства прокариот, называемых нейтрофилами, — область, близкая к нейтральной, а рост возможен, как правило, в диапазоне значений рН от 4 до 9. Предельные концентрации ионов водорода, выше и ниже которых известные на сегодняшний день организмы прекращают рост и размножение, выражены значениями рН 1 и 11 (Жизнь микробов в экстремальных условиях, 1981). Хотя многие прокариоты способны расти или выживать при значениях рН, лежащих за пределами нормального диапазона от рН 4 до рН 9, оптимум их роста обычно находится внутри этого интервала. Такие прокариоты считаются ацидо- или алкалотолерантными (кислото- или щелочеустойчивыми).
У некоторых видов адаптация к кислотности среды привела к тому, что оптимум рН для роста переместился в кислую (рН 4 и ниже) или щелочную (рН от 9 и выше) зону. Такие прокариоты названы ацидо- или алкалофильными (кислото- или щелочелюбивыми) соответственно. Среди обеих групп выделяют облигатные формы, потерявшие способность расти в нейтральной области, и факультативные, сохранившие эту способность (Гусев, Минеева, 1992). Типичными нейтрофилами являются разные штаммы Escherichia coli, Bacillus megaterium и многие другие.
К кислотоустойчивым относятся многие бактерии, продуцирующие органические кислоты, например уксуснокислые, молочнокислые и др. Некоторые молочнокислые бактерии, например, Pediococcus, Streptococcus могут начинать рост в нейтральной среде или щелочной среде, но представители рода Lactobacillus неспособны развиваться в среде с начальным рН выше 6. Рост всех молочнокислых бактерий продолжается до тех пор, пока в результате брожения величина рН не упадет до 5 или ниже (Стейниер и др., 1979).
Хотя понятие "внутриклеточный рН" не вполне определено, этот показатель может иметь определенную ценность, так как дает представление об условиях внутри клетки. Считается доказанным, что внутриклеточный рН у ацидофильных бактерий не соответствует рН внешней среды. Ферментные системы, выделенные из этих организмов, обладают оптимумом действия в нейтральной или слабокислой области (Жизнь микробов в экстремальных условиях, 1981).
Наиболее хорошо изученными представителями экстремальных ацидофилов являются Thiobacillus thiooxidans и Thiobacillus ferrooxidans. Первый микроорганизм способен к автотрофному росту в диапазоне значений рН от 0,9 до 4,5 с оптимумом при 2,5. Для близкородственной бактерии Т.ferrooxidans, окисляющей железо и восстановленные соединения серы с образованием серной кислоты, диапазон рН, пригодных для роста зависит от природы субстрата, однако оптимумом роста считается уровень кислотности близкий к 2. Определения, показавшие, что внутриклеточный рН этих организмов близок к нейтральному согласуются с данными исследования их очищенных ферментных систем: оптимальные величины рН для этих ферментов лежат в диапазоне от 5 до 9 {Ленгуорси, 1981).
Одним из классических примеров ацидофильной бактерии является Sulfolobus acidocaldarius, которую можно охарактеризовать как факультативный автотрофный серуокисляющий организм. Архебактерия растет в интервале рН от 0,0 до 5,8 с оптимумом при рН 2-3. При этом температурный оптимум для данного организма наблюдается при 70-80С, очевидно, перед нами экстремальный ацидофил и термофил. Было установлено, что рН внутри клеток близок к нейтральному значению, есть основания полагать, что данный организм поддерживает трансмембранный градиент рН благодаря активным метаболитическим процессам (там же).
Помимо автотрофов среди ацидофилов встречаются и гетеротрофные организмы, например спорообразующая палочковидная эубактерия Bacillus acidocaldarius. Представители данного вида растут в диапазоне от 2 до 6 рН и имеют оптимум роста рН 3. Температурный оптимум наблюдается при 60С. Величина внутриклеточного рН, определяемая у этого организма различными методами, составляет около 5,8 и поддерживается за счет активного транспорта протонов через мембрану (Жизнь микробов в экстремальных условиях, 1981).
Среди ацидофильных прокариот встречаются даже представители порядка Mollicutes, лишенные клеточной стенки — Thermoplasma acidophilum. Мембрана этого организма постоянно подвергается воздействию горячей и кислой среды, поскольку в терриконах угольных шахт температура колеблется от 32 до 80С, а рН около 2. Величина рН клеточного лизата оказалась близка к нейтральной — 6,3-6,8. Изменение внешних условий — температуры и кислотности среды культивирования — не сказалось на величине внутриклеточного рН. Предположительно, данный организм выживает за счет непроницаемости клетки для ионов водорода (Hsung, Hang, 1975).
Изучение химической структуры ацидофильных бактерий позволяет заключить, что мезофильные ацидофилы имеют достаточно типичный состав клеточной стенки и мембраны. А вот у термофильных ацидофильных бактерий обнаружены вещества необычного и уникального химического строения (Жизнь микробов в экстремальных условиях, 1981). Общей чертой для изученных в настоящее время термоацидофилов является циклизация внутри углеводородных участков мембранных липидов, но нельзя однозначно сказать, что именно эта структурная особенность обуславливает ацидофилию организмов (там же).
Оптимальные значения рН для роста большинства дрожжевых грибов находятся в области значений А—6. Однако отдельные виды способны развиваться в более кислой среде. Например, некоторые штаммы Saccharomyces cerevisiae хорошо растут при рН 2,5-3. К кислотоустойчивым дрожжам относится также ассоциированный с кишечным трактом животных Cyniclomyces guttulatus, растущий при рН 2. Дрожжи, которые могли бы расти при щелочных значениях (рН выше 8) до настоящего времени не известны {Бабьева, Чернов, 1992).
Самыми устойчивыми к кислотности организмами среди всех известных, по-видимому, являются некоторые виды грибов.
Среди микромицетов широко распространена ацидотолерантность и вообще рост в широком диапазоне рН. Различные виды Aspergilus, Penicillium и Fusarium могут расти в диапазоне рН от 2 до 10 и в зависимости от условий культивирования повышать или понижать уровень кислотности в среде {Буга и др., 1996).
Антибиотическая активность ацидофильных актиномицетов
Главными конкурентами ацидофильных актиномицетов в кислых почвах являются грибы, поэтому логично было бы предположить наличие у ацидофильных актиномицетов антигрибных свойств. Результаты проведенных лабораторных экспериментов по изучению антибиотикообразования in vitro показали, что антигрибная активность, по-видимому, распространена среди ацидофильных актиномицетов {Khan, Williams, 1975).
Трудно переоценить важность такого вывода. Урон, наносимый фитопатогенными грибами сельскому хозяйству и пищевой промышленности, во много раз превосходит ущерб, причиняемый фитопатогенными бактериями {Павловича, 1978). Наряду с разработкой химических средств борьбы против патогенных организмов, не прекращается поиск веществ, действие которых основано на антагонистических взаимоотношениях микроорганизмов {Козловская и др., 1998). Микробиологические препараты на основе высокоэффективных штаммов в отличии от синтетических препаратов — пестицидов — менее токсичны, быстро разлагаются, не накапливаются в пищевых продуктах, гипоаллергенны, дешевы и удобны в промышленных масштабах применения.
Установлено, что присутствие в почве актиномицетов-антагонистов снижает заболеваемость растений {Павловича, 1978). При изучении вертикального распределения актиномицетов-антагонистов фитопатогенных грибов в почвах Японии показано, что они приурочены к верхним горизонтам почв {Ishizawa, Araragi, 1971). В литературе широко сообщалось об антагонистических действиях определенных видов актиномицетов или стрептомицетных штаммов против определенных видов грибов {Elson et ah, 1994; Becker et ah, 1999). В то же время делались попытки доказать возможность обобщенного действия актиномицетов на грибы (Lockwood, 1959).
Известно, что актиномицеты помимо выделения антибиотических веществ воздействуют на другие микроорганизмы комплексом литических ферментов. Было показано, что у ряда стрептомицетов во время спорообразования происходит активное выделение экстрацеллюлярных ферментов — глюканазы и хитиназы — которые разрушают мицелий фитопатогенного гриба Fusarium culmorum {Skujins et ah, 1965).
Группой российских исследователей {Козловская и др., 1998) было показано, что при селективном выделении из почвы грамположительных коринеподобных нокардиоформ, изолируемые культуры проявляют антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов. Интересным фактом в данном случае является то, что изученные микобактерии, проявлявшие интенсивную антифунгальную активность, обладали кислотоустойчивостью — одним из дифференцирующих признаков родов нокардиоформных бактерий {Нестеренко и др., 1985).
В работе корейских исследователей по разнообразию актиномицетов с антигрибной активностью в обрабатываемых почвах Кореи {Lee, Hwang, 2002) традиционно показано, что стрептомицеты доминируют во всех исследованных почвах (с различными уровнями кислотности, влажности и запасами органического вещества) и составляют более 50% от всех выделенных штаммов актиномицетов с антигрибной активностью. Более интересно отметить, что большинство представителей родов Micromonospora, Dactylosporangium, Streptosporangium было выделено авторами из кислых почв агроценозов (рН 4,0-5,0). Микромоноспоры проявили сильную противогрибную активность против многих фитопатогенных грибов, в том числе Fusarium oxysporumf.sp. cucumerinum.
Вообще, фитопатогенные микромицеты рода Fusarium, вызывающие фузариозы у растений и выделяющие токсические вещества, представляют существенные проблемы для сельского хозяйства. Они поражают сосудистые системы и ткани растений, приводя к гибели большинства сельскохозяйственных культур. Но для борьбы с фузариозом до сих пор не найдено достаточно эффективных методов, поэтому поиск и выделение активных актиномицетных штаммов продолжается.
В работе исследователей из Малазии (Getha, Vikineswary, 2002), посвященной антагонистическому воздействию штамма Streptomyces violaceusniger на Fusarium oxysporum f.sp. cubense (возбудителя вилта банана), показано, что вещества, выделяемые стрептомицетом, вызывают лизис концов грибных гиф, провоцируют морфологические "уродства" мицелия, ингибируют прорастание спор. Таким образом, представлено прямое доказательство того, что антибиоз — один из механизмов антагонизма, который проявляет стрептомицет против фитопатогенного микромицета в почве. Кроме того, было показано, что у стрептомицетов, в частности Streptomyces plicatus, которые оказывают подавляющее действие на прорастание спор, удлинение гиф и радиальный рост фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Altrernaria alternata и Verticillium albo-atrum, наблюдается интенсивное образование хитиназы (Abd-Allah, 2001).
Группа ученых из Египта выделила из возделываемых почв штаммы актиномицетов, проявлявшие интенсивные антагонистические свойства по отношению к фитопатогенным грибам и кислотоустойчивым бактериям {е\-Abyad et al., 1996). Streptomyces pulcher, S. canes cens (синониме, albidoflavus) и S. citreofluorescens (синоним S. anulatus) оказались самыми активными антагонистами против Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (возбудителя вилта томатов), Pseudomonas solanacearum (возбудителя бактериального увядания) и Clavibacter michiganensis (возбудителя бактериального рака).
Из культуры Streptomyces humidus были выделены противогрибные вещества, очищены и идентифицированы как фенилуксусная кислота и фенилацетат натрия. Эти вещества полностью ингибировали рост таких болезнетворных для растений организмов, как Fusarium oxysporum f fabae, Pythium ultimum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani и были столь же эффективны как коммерческие фунгицидные препараты (Hwang et aL, 2001). Антибактериальный и противогрибной антибиотик, выделенный из фильтрата культуры Streptomyces 201 и определенный как 2-метил-гептил-изоникотинат, продемонстрировал высокую активность широкого спектра действия как в отношении бактерий, так и против фитопатогенных грибов Fusarium moniliforme, F.semitectum, F.oxysporum, F.solani и Rhizoctonia solani (Bordoloi et aL, 2001).
Было показано, что актиномицет Streptomyces lydicus, проявляющий активность в отношении фитопатогенов Pythium ultimum и Rhizoctonia solani in vitro, может являться обитателям ризосферы гороха, хлопчатника и кукурузы, обеспечивая растению защиту от инфицирования и сохраняя численность собственной популяции на постоянном уровне (Yuan, Crawford, 1995). Внесение штамма Streptomyces plicatus в почву одновременно с посевом томатов существенно снижает возможность заражения растений фитопатогенными грибами (Abd-Allah, 2001).
Недавно группой австралийских ученых впервые было показано, что актиномицеты способны проявлять антинематодную активность (Park et aL, 2002). Культура Streptoverticillium albireticuli интенсивно подавляла паразитарную нематоду Caenorhabditis elegans и в то же время выделяла антибиотические вещества против фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Phytophthora cinnamom. Открытие того, что актиномицеты проявляют антинематодную активность может служить потенциалом для использования их как агентов биологического регулирования численности вида паразитных нематод, в дополнение к способности подавлять фитопатогенные грибы.
Поиски актиномицетов, активных против фитопатогенных грибов, велись и ведутся среди традиционно выделяемых нейтрофильных актиномицетов. По-нашему мнению, ацидофильные актиномицеты могут послужить источником новых эффективных средств борьбы с грибными болезнями растений.
Таксономическое разнообразие комплексов микромоноспор, выявляемых на подкисленных и нейтральных средах
При сравнительном исследовании комплекса актиномицетов почв разных типов мы не раз отмечали увеличение доли микромоноспор на подкисленных средах по сравнению с нейтральными. Из-за того, что микромоноспоры, как правило, не являются доминирующими в большинстве исследованных почв, увеличение их численности при применении подкисленных сред значительно влияет на изменение таксономической структуры комплекса в целом.
Поскольку посев проводился традиционными методами без применения селективных приемов, ограничивающих рост банальных стрептомицетов, значительное возрастание доли микромоноспор в комплексе актиномицетов при использовании подкисленных сред ни могло не привлечь нашего внимания. Возможность впервые обнаружить среди микромоноспор ацидофильные штаммы направила нас на поиск микромоноспор в природных субстратах.
Проводимые в нашей лаборатории работы по установлению закономерностей пространственной организации актиномицетных комплексов и положения в них отдельных родов позволили нам руководствоваться следующими принципами (Звягинцев, Зенова, 2001):
1. Микромоноспоры составляют неотъемлемую часть актиномицетного комплекса в лесных, луговых, степных и пустынных биогеоценозов, и не могут считаться редкими формами порядка Actinomycetales;
2. В почвах южных зон микромоноспор всегда обнаруживается больше, чем в северных;
3. Доминирование микромоноспор в ряде экосистем характерно для растительных ярусов, вследствие их требовательности к влаге и питательных потребностей; 4. В сухой степи местом локализации микромоноспор, где они обнаруживаются с высокой частотой встречаемости, составляя потенциальные доминанты актиномицетного комплекса, являются растения полыни.
Поэтому объектом исследования для подробного рассмотрения комплекса микромоноспор, выявляемых на подкисленной среде, для расширения наших знаний о биоразнообразии микромоноспор в наземных экосистемах и поиска среди них кислотоустойчивых форм мы избрали растительные ярусы степного биогеоценоза на каштановой солонцеватой почве и лугового биогеоценоза на аллювиальной дерновой почве. Как неоднократно отмечалось {Звягинцев, Зенова, 2001), в филлосфере степных растений микромоноспоры обнаруживаются с высокой частотой, но, как правило, в небольшом числе и остаются минорным компонентом актиномицетного комплекса.
Исследование актиномицетного комплекса растительного яруса злаково-полынной степи и разнотравно-полынного луга на подкисленном и нейтральном вариантах среды с пропионатом натрия показало {табл. 8), что при использовании подкисленной среды выделения общая численность актиномицетов возрастает на порядок по сравнению с численностью на нейтральной среде {рис. 5).
На нейтральных средах при посеве из растительных ярусов обоих биогеоценозов доминируют стрептомицеты. Несмотря на применение селективных приемов (состав среды, прогревание), направленных на выявление микромоноспор, их численность на порядок ниже, чем стрептомицетов. Как и отмечалось другими исследователями (Звягинцев, Зенова, 2001), они являются минорным компонентом степных экосистем (таблЯ).
Однако на подкисленной среде картина численности меняется. Количество стрептомицетов на подкисленных средах изменилось незначительно — в пределах одного порядка, в то время как количество микромоноспор на подкисленной среде резко возросло: на 1,8 порядка при высеве из травянистого яруса на каштановой солонцеватой почве, и на 2 порядка — на аллювиальной дерновой. Мы уже сталкивались с подобными изменениями при исследовании почв исследованных биогеоценозов: в низинной торфяной почве доля микромоноспор от всех выявляемых родов возросла с 58% до 73% на подкисленной среде, по сравнению с нейтральной, в оторфованной подзолистой — с 22 до 33%, серой лесной от 0 до 14% (табл.5).
Таким образом, возрастание общей численности актиномицетов — при посеве материала растительных ярусов — на подкисленной среде происходит за счет мицелиальных прокариот из рода Micromonospora.
Разумеется, и по таксономической структуре актиномицетные комплексы растительных ярусов обоих биогеоценозов на подкисленной среде кардинально отличаются от таковых на нейтральных. Если на нейтральной среде при высеве из растительного яруса биогеоценоза на каштановой солонцеватой почве доминируют стрептомицеты (рис. 6), а микромоноспоры составляют приблизительно четвертую часть, то на среде с рН 5,0 «минорный компонент» составляет уже почти 90%. Подобные наблюдения можно сделать и при исследовании таксономического структуры растительного яруса лугового биогеоценоза на аллювиальной дерновой почве. Доля микромоноспор составляет на нейтральной среде 9%, а на подкисленной 95% (рис. 6). Применение подкисленных сред оказывает влияние и на обнаружение видового разнообразия представителей рода Micromonospora. В комплексе микромоноспор на среде с пониженным рН выявлено четыре-пять видов, в то время как на нейтральной среде — только по одному (рис. 7).
Антибиотическая активность культур ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов
Практический интерес к актиномицетам обусловлен их способностью вырабатывать антибиотические вещества.
У равного количества — 14 ацидофильных и 14 нейтрофильных штаммов стрептомицетов изучались наличие антибиотической активности и спектр ее проявления (табл. 12).
Исследование антагонистического действия выделенных штаммов на традиционно используемом тест-наборе бактерий и дрожжей показало, что статистически значимое отличие антимикробной активности ацидофильных и нейтрофильных штаммов проявляется в отношении Staphylococcus aureus шт.209 и штамма Staphylococcus aureus, облученного ультрафиолетом (УФ-мутанта), а также дрожжей Candida albicans и Saccharomyces cerevisiae. Так, нейтрофильные штаммы стрептомицетов более активно подавляли бактерии, а ацидофилы активнее действовали в отношении дрожжей (рис. 16).
Из литературы известно, что актиномицеты, выделенные из кислых почв, подавляют рост грибов (Khan, Williams, 1975), в том числе фитопатогенных (Широких и др., 2002). Поскольку среди ацидофильных штаммов стрептомицетов чаще отмечалась антидрожжевая активность, чем среди нейтрофильных, целесообразно было изучить антимикробные свойства ацидофильных и нейтрофильных стрептомицетов против дрожжей и фитопатогенных грибов (табл. 13).
Среди выделенных нами нейтрофильных актиномицетов антигрибная активность, если и обнаруживалась, то только на нейтральной среде. На подкисленной среде у нейтрофильных актиномицетов зоны лизиса не регистрировались (табл. 13,рис. 17). У ацидофильных штаммов, обладающих антигрибной активностью, на подкисленной среде зоны подавления грибов были значительно шире, чем на нейтральной среде {табл. 13, рис. 17).
Обработка результатов методом многомерного дисперсионного анализа показала, что по проявлению антигрибной активности группы ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов значимо различаются. Статистически значимой оказалась более высокая активность ацидофилов на подкисленной среде, чем на нейтральной {рис.18). Наиболее чувствительными к антибиотикам стрептомицетов оказались дрожжевые организмы, а среди фитопатогенных грибов — виды F.sporotrichiella и F.oxysporum.