Введение к работе
з
Актуальность те?*ы. В настоящее время наблюдается значительный рост гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных условно-патогенными бактериями, развивающихся у ліщ со сниженной иммунобиологической резистентностью. Повсеместно отмечается увеличение удельного веса внутрибольничных инфекций, вызываемых представителями семейства кишечных (НА.Семииа и др.,1995; - Л.Т.Мусина и др., 199S). Среди условно-патогенных бактерий одно из ведущих мест занимают представители рода Klebsiella, в частности Klebsiella pneumoniae (Л~А.Березнпа п др., 1993; В.М.Бондарешсо н др., 1994; 'В.М.Фролов и др., 1994; Ф.Тиссо-Геррае и др., 1995). Внутрибольшгпше инфекции, обусловленные К.рпешпопіае, наблюдаются чаще всего в родо-вспомогательных учреждениях, в отделениях для недоношенных, урологических п хирургических клиниках. Довольно часто встречаются они и в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Особенно актуальной данная проблема является в "родо-вспомогательных отделениях и клиниках, когда клебсиеллы длительно выделяются от рожениц, родильниц, контаминируют ортанизм новорожденных, обусловливая персистентяую инфекцию, "часто проявляющуюся лишь затяжным бактерионосительством (H.A.Hirsch и др., 1985; F.Tissot-Guerraz к др., 1990; О.П.СельяиЕова и др., 1993; Л.И.Глатман и др., 1994).
Факторы патогенвости клинических штаммов К.рпешпопіае, связанные со способностью бактерий колонизировать эпителий открытых полостей организма и противостоять его защитным механизмам, изучены недостаточно. Известны фимбриальные структуры и белки наружной мембраны, сообщающие адгезивную активность К.рпеияїопіае (D.C.Old, R.A-Adegbola, 1981, 1983). Многие штаммы, вызывающие острый инфекционный процесс, характеризуются наличием лолисахаридной капсулы и мукоида (R.Wacharotayankun п др., 1993; S.Favre-Bonte и др., 1995), продуцируют цитотоксип (К.В.Калннн и др., 1992), вещества, инактивирующие лизоцим (В.М.Бондаренко и др., 1994) и бактершгядный компонент препарата интерферона (Е.В.Сурикова, 1994). Для штаммов ІСрпешпопіае, обусловливающих сепсис или токсико-септическое состояние у новорожденных, которые отличаются крайней тяжестью и высокой летальностью, характерна
выраженная адгезивная активность ,и способность продуцировата тиолзависимый гемолизин (I.L-Albeza и др., 1985; И.А.Руднев, В.М.Бондарсксо, 1993). Установлена хромосомная природа генетического контроля полисахарида капсулы, фимбриальных адгезинов, тнолзависимого гемолизина и связь синтеза мукоїща, антилнзопимной активности и агрегативной адгезивной активности с функцией плазкид (X.Nassif и др., 1989; S.Favr&-Bonte н др., 19SS; В.М.Бопдарепжо и др.,1988).
Персистируюнше штаммы К.рпешпопіаг только начинают исследовать и данные об их фенапшнческих и генетических характеристиках в литературе практически отсутствуют.
Пель настоящей работы - изучить биологические и генетические особенности персистнрующих штаммов клебсиелл, изолированных в динамике от рожениц, родильниц, новорожденных и детей равнего возраста с инапарашной и рецидивирующей клебсиеллезной инфекцией.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) создать коллекцию клинических персистирующих пггаммов
К.рпешпошае и охарактеризовать их по маркерам антибнотихо-
резистентиости а профилю длазмтуптах ДНК; - ...
2) получить генетически связанные пары пггаммов, отличающиеся
по наличию передаваемых в скрещивании или опытах мобилизации
плазмид, обнаруживаемых у персистирующих пггаммов ILpneumoniae;
3) в опытах на перевиваемых клеточных линиях и культуре
перитокеальных макрофагов морской свинки определить связь между
наличием у бактерий передаваемых плазмид и их адгезивной
агрегирующей активностью и способностью к размножению в
фаголизосомах профессиональных фагоцитов;
4) изучить иммуномодулирующие свойства штаммов путем оценки
пролиферативной активности спленопитов в присутствии В- и Т-
митогенов и при имммуноморфологическом исследовании органов
лабораторных животных в процессе развития клебсиеллезной инфекции.
Научная новизна и практическая значимость работы. У клинических пфсистируюпцгх пггаммов клебсиелл выявлены две оригинальные пдазмнды, связанные с патогенными свойствами этих условно-патогенных бактерий. Одна плазккда молехулярноы массы 55
5 MB (обозначенная как pAdh-55) контролирует адгезивную
агрегирующую активность возбудителя, определяющую дальнейшее
развитие инфекционного процесса. Вторая плазмида, мол. массы 100
MD (обозначенная как Rdf-100) связана с выраженным
иммуносулрессирующим воздействием клебсиелл, устанавливаемым на
основе расчета индексов пролиферации клеток селезенки мышей в
присутствии Т-митогена (КонА) и В-митогеиа (ЛПС).
Наличие у персистиругощих штаммов K.pneumoniae плазмид мол. массы 55 и 105 MD, связанных с вирулентностью указанных бактерий, свидетельствует о потенциальной опасности таких культур, что должно учитываться при оценке патогенетической значимости клинических бактериальных взолятов, требующих верификации их этиологической значимости.
Публикации. Основные материалы диссертации отражены в 4 статьях и 3 тезисах.
Апробация работы. Диссертация апробирована на конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НИИМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 8 апреля 1996 года.
Объем и сіруктура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Материал изложен на ... страницах.
Методы исследования. У селекционированных для исследования биологических и генетических характеристик штаммов клебсиелл определяли устойчивость к антибиотикам методами серийных разведений и дисков. Конъюгационное скрещивание и мобилизацию неконъюгативных плазмид осуществляли общепринятым методом (Д.Миллер, 1976). Наличие в лпзммах плазмидной ДНК регистрировали с помощью метода Кадо (CJLKado, 1981). Препаративное выделение плазмидной ДНК бактерий проводили по методу JLCBirnboim и JJLDoIy (1979).
Определение молекулярной массы плазмид осуществляли с учетом их электрсфоретической подвижности в 0.7-1.0% агарозном геле (F.A-Meyers и др., 1976). Элиминацию плазмид осуществляли при выращивании бактерий в жидкой среде, содержащей сублетальные дозы этидиума бромида.
Биологетес?зіе методы исследования. Адгезивную колонизирующую и циготоюигенную активность исследуемых штаммов оценивали на модели перевиваемых клеточных линий Нер-2 и L по методу, олисашюму в работе В.М.Боядареяко и др. (1973). Опыты с мечеными 3Н-глюкозой бактериями проводили согласно методике, описанной . ранее (В.М.Бопдаренко и др., .1975). Для оценки способности бактерий размножаться в фагот«ах>мах-лрофесснональньгх фагоцитов использовали модель перитонеальных макрофагов морских свинок (Т.Н.Маслвва в др., 1S73). Окраску препаратов осуществляли азур-эозином по Романошжому-Гпмае.
Эксперюкшальную инфекцию восглюшводнли в опытах на мышах линии СВА. В опытах использовано 1280 гашотшдх. На протяженин 76 суток на раїших сроках ішфекциогоіого процесса производили умерщвление животных эфиром и их вскрытие. Стерильно извлеченную селезенку гомогенизировали и делали высев гомогената на среду Эндо н Шоскпрева.
Параллельно в селезенках исследуемых мышей определяли общее количество спленоцитов Т- и В-лнмфоцнтов в цитотоксическом тесте с помощью ахгт-Т-глобулппа и аптп-В-сысороткл, а также содержание зрелых В-лшгфоцптов (ЕАС-РОК). Количество В-незрельгх лимфоцитов рассчитывали по разнице всех В-клеток и В-зралых лимфоцитов (НАЛСраскпна и др., 1988). Параллельно исследовали количество антител к убитым нагреванием бактерий в РИГА. Гистологический анализ проводили путем морфометрического определения" величины фолликулов и размера герминативных В-зон селезенки на серийных срезах, окрашенных гематоксилин-зозином.
Исследования проводили в динамике на 1, 3, 7, 14, 21, 28 п 60 сут. после введения мышам бактерий тенетически связанных пар штаммов. Результаты опытов обрабатывали статистически. Определяли средние арифметические и средние геометрические значения с. вычислением средних ошибок и доверительных интервалов. Достоверность различий- между группами и контролем определяли с помощью критерия Стьюдента.
Опыты на клеточной линии Нер-2 были выполнены совместно с к. м. и. Березиной Л. А. исследования на мышах линии СВА с к. м. н. Николаевой Т. Н. ( НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи „ Москва ).
7 Иммуноморфологкческие исследованния были проведены совместно с к.м.н. А. И. Смолягиным и х.м.н. И. И. Чайнизсосой (Медицинская академия, г.Оренбург).