Пилеобразование у микроорганизмов рода YERSINIAE Водопьянов, Сергей Олегович

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОВЛЕМЦ. Агрессивность чумного микроба издавна привлекала внимание исследователей,сломившихся понять иі/ичтш.обуїіловлііцаюіаіе високую вирулентность возбудителя (И,В.Лсм'_ралский 1960,1993,1¹. П. Рудоев 1933.R.R Brubacker іУ72,1985,Т.Butior 19&3).B начале 60-х годов,суммировав результаты многочисленных исследований по сравнительному изучению свойств разлитых штаммов воьбудителя чумы Т. W. Burrows (1963) сформулировал положение о комплексном характере ви-рулентносш.заключакжееся в том,что вирулентные штаммы чумного микроба должны обладать набором определенных признаков, обоскаченних как детерминанты вирулентности. В последующем это положение было подвергнуто всесторонней экспериментальной проверке,в ходе ітоторой було установлено, ото эти признаки недостаточно полію отражают такое свойство как ьируле.чт-ность. Нанример.били выделены штаммы возбудителя чумы не укладывающиеся в известную формулу вирулентности (ДИ.АНИСКМОВ И.др. ,197б,аВ.Кутырев,1992,Т.У.Burrows 1063). Логическим завершением усилий.направленних на углубленное изучение детерминант вирулентности.явилось полошше об интегративном характере вирулентности чумного микроба (Б.ЕКишенькип 1967). Суть концепции адашнаетея в предположении автора о существовании у полноценных штаммов возбуди-тедя чумы как детерминант вирулентности, оказывающих прямое деструктивнее действие на чувствительные мишени и тканях восприимчивого хс:шна,так и маркеїлв пгтіч,>іччжх:ти - 1&к-гогев, свягакиш с вирулентностью,НО Л'-'.Ж г<Н;« яшой ДС-СТ-РУКТИВНОЯ ФУНКЦИЯ. асСІїреССИїї ука:*ШШХ (Jut'.''-ОГОО йаІ'ИСЙГ

от функционирования аппарата управления,обеспечивающего их координированную экспрессию в пространстве и во времени в ответ на соответствующие внешние стимулы. Концепция указывает направление поиска и изучения новых детерминант и макеров вирулентности.

Развитию большинства инфекционных заболеваний предшествует этап адгезии возбудителя на тканях восприимчивого хозяина,в результате чего из немногих инфицирующих макроорганизм бактерий образуется значительное число потомков,достаточное для проявления факторов патогенности и развития инфекционного процесса (R.J.Gibbons 1977.Н.V.Smith 1977).Адгезивные свойства бактерий обусловлены наличием на поверхности орга-нелл,обозначенных как пили или фимбрии (K1R Езепчук 1985, J.D.Arbuthnott 1979, Е. II. ВеасЫу 1981, J.W.Jones 1983). Очень редко функцию адгезинов выполняют макромолекулы неидентичные нилям (М.В.Далин,Н.Г.йіП! 1985.Ю. В. Езепчук 1385, B.B.Finlay 1989).ІІили (фимбрии) обнаружены у большинства грамотрицатель-них и у многие грамголожительных бактерий (K1R Езепчук 1985). Роль пклей, как факторов .способствующих развитию инфекционных заболеваний,установлена для гонококков,протея,кишечной палочічіі,клебсиелл,коринебактерий;сальмонелл,шигелл,холерного вибриона,геликобактеров.псевдомояад (М.аДалин,ЕГ.Фиш 1985/ IUR Езепчук 19&5,J.D.Arbuthnott 1979,E.H.Beachey 1981, J.J.Mekalanos 1992,0.A.Mints 1983, J.W.Jones 1983).ї*гот список продолжает расширяться.

Вопросы адгезии у представителей рода Yersinia и.оеобен-но.у воэудителя чумы изучены крайне недостаточно.

Имеются отдельные сообщения о способности возбудителей кишечного иерсиниоза и пеевдстуберкулеза продуцировать несколько типов пилей.но их наличие не коррелировало с адгезией к клеткам зукарнотов (A.Farris 1983). В тоже вреш у этих Еозбудителей обнаружены специфические макромолекулы,постро-егаше из белка Уор 1 .весьма перспективные в плане выполне -вия адгезивных функций (G.Kapperud 1965).

Вопросы адгезии у возбудителя чумы, опосредованной наличием специализированных органелл,практически не изучены. По мнению А. И. Дятлова (1986) "чумной микроб не имеет приспособ лений для адгезии к клеточным мембранам-хозяина". Другие авторы при изучении адгезии на первый план выдвигают энергию электростатического и гидрофобного взаимодействия (А. И. Дятлов 1991). При специальном изучении клеток чумного микроба методом электронной микроскопии пилеподоОних структур не выявлено (П. А. Черепанов 1991).

Таким образом,на основании имеющихся данных невозможно судить о наличии у возбудителя чумы и других иерсиний специ -алиаированного аппарата адгезии ,а тем более о роли феномена адгезии в патогенезе чумной инфекции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Заключалась в обнаружении и изучении роли и значения феномена пилеобрашвания у возбудителя чумы и других иерсиний.

ОСНОБНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Поставленная цель была дос
тигнута решением следующих задач: . '

1. Изучения принципиальной возможности пилеобразования клетками чумного шжроба на модели гетеродогичиых пилей антигена К 88 кишечной палочки. . .;

2. Поиска и выявления собственнных пилей и нилеподобных структур возбудителя чумы.

3. Селекции итамшв-продуцентов,разработки способов получения гомогенных и високоактивних препаратов пилей адгезии.

4. Разработки способов выявления различных форм шлей и опре- деления степени их нативности. .

Б. Изучения закономерностей пилеобразования.идентификацин факторов.пришмавдих участие в экспрессии пилей. 6.0цешш возможности экспрессии пилей адгезии в условиях макроорганизма. ..

7.Изучения биологических свойств пилей.их патогенетического
действия и возможной роли в экспрессии вирулентности.
8. Определения места пилей адгезии чумного микроба в ряду из
вестных антигенов чумного микроба.'.' ,'"
9.Изучения распространения феномена.пилеобразования у предс
тавителей рода Yersinia ';.
10. Изучения' рецепторов для связывания пилей адгезии. '
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ ; / >/''.' , ' '_
.<. 1. Установлена способность возбудителя чумы продуцировать
как пили адгезии,так и новый тип поверхностных структур -
курлинов. "^;< : ;''.' "..'-. ;.;.'.

2. Установлена тождественность пилей адгезии одному из ' антигенов чумного микроба,описанному под названием рН 6,4,1.

Установлено, что экспрессия'пилей в клетках возбудители и нсевдотуберкулеза скоординировано регулируется ютвием трех внешних сигналов : температуры культивнро-37-43 «низкого рН и присутствием катионов. Показано,что экспрессия пилей адгезии является частью лы стрессового ответа возбудителя чумы. Показано, что пили адгезии являются высокоактивным лек-, способным связываться со многими гликопротеинами : юзидом.муцкном.фибронектином,коллагеном. Показана возможность экспрессии пилей адгезии прн кон-шшлированных клеток чумного микроба с макрофагами.при ими возбудителя в мочу и при нахождении в подкожно км-деовакных диффузионных камерах. Уегажюлепа связь медду функциональной активностью пи-ігезйи я степенью их поликерности (нативности). Изучение биологической активности пилей адгезии на жых моделях показало влияние этого поверхностного ан-1 возбудителя чумы на все этапы инфекциоішого процесса. Изучено распространение феномена пилеобразования у :авителеи рода Уегзіпіа.предложена схема классификации к^рсиний.

.Установлена возможная биологическая роль пилей і се-1 возбудителя кишечного иерсиниога.как способствующих 1нию микроорганизма во внешней среде. . Селекционировал штамм возбудителя чумы.дафекпшй по щии натиЕНЫх.ко не субьединичных форм пилей адгезии/

5. Показано,что в качестве индугагора факторов виру.' пости у возбудителя чумы выступает сигнал "низкого pF лизуемый через изменение цитоплазматического рН.

6. Предложена гипотетическая схема реализации сигн "низкого рН" в ответ на изменение трансмембранного грз протонов, включающая участие системы циклических нукт;< и ДНК-гависимрй рш-полимеразы.

З.Предложна мо де ль, повышения бактерицидной актив хлорактивных соединений при ішзком рЕ Сформулирована sa, показывающая биологический смысл закислення фагсш макрофагов.

4. Предложен оригинальный механизм участия пи лей ад в антигенной мимикрии возбудителя и развитии аутоимму процессов.

Б. Установлена возможная роль пилей как фактора кол ции при инфицировании возбудителем мочевыводящих путеї

6. Показано существование системы стрессового ответе возбудителя чумы,в которой поверхностные антигены пиле: гезии и фракции 1 являются стрессовыми белками.

7. Пили адгезии возбудителя чумы можно рассматривав ноеый фактор вирулентности.

1. Разработан способ обнаружения пилей у микрооргаю рода Yersinia (Авт.свид. N 1074204).

2. Селекционировано четыре штамма-продуцента пилей і ний,защищенных авторскими свидетельствами ( NN 111 1103555,1211921,1632034).

3. Разработан способ получения гомологичных апилирован-ных юриантов из іота»йюв-продуцентов (Авт.спид. N 1302699), чго позволяет пользуясь несложным методом абсхзрбции,сравнительно легко полудіть специфические агглютинирующие сыворотки.

4 Разработан простой и эффективный способ получения высокоактивного лектина возбудителя чумы,использование которо-го расширяет возможности экспериментаторов.

5. Разработан способ идентификации возбудителя псеидоту-беркулеза (Авт. сеид. N1193170). -

6. Получета рекомбинантная плазммдная ДНК pRD 65,обладающая удобным селективным маркером и способная отменять или существенно снижать взаимодействие бактериальных клеток с фагоцитами (Авт.евид. N 1652627).

7. Разработанная теоретическая модель повішення бактери
цидной активности хлорактивных соединений при иизііом ріг
обеспечивает основу для более широкого использования продук
тов электролиза (анолнт) в целях обеззараживания и дезшіфек-
ции. .

. 8. Разработанный способ обнаружения' фибронектина с но -мощью ИФА может быть использован для виявлення отого ВЧЖ-ного клеточного компонента в биологических жидкостях.

-9.Получена ишобилииированная форма нили адгезии (заявка N 930324Я5 от 21.06.93.), которая может быть иеполыхжша для идентификации рецепторов пилей адгееии.

Jla основании получешіь'х результатов разработаны : "Методические рекомендации. Обкарумеїше пилей адгезии у

возбудатедей чуш и псевдогуоеркулеза",ЫоскБа,1985 . "Мвїодичєскііє рекомендации .Способ быстрой дифферекциа-.

НИИ Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica". ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ ІЮЛОйЕНІШ.ВШЮСИШЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Возбудитель чумы способен к экспрессии пидей адгезии и поверхностных структур,подобных ФН-связывающим курлинзм ки-шечиой палочки. ..

2. Возбудитель Гіревдотуберкулеза продуцирует пили адгезии, идентичные по свойствам пилям возбудителя чумы. У некоторых штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза имеется два серологически отличных типа гилей.

'&'Экспрессия шлей адгезии скоординировано регулируется сочсїакнш гооДей'г-сРием на клетки чумного ыикроба трех факторов : повышенной температуры, низкого рН и наличием в среде

'.культивирования катионов и реализуется через,изменение вели
чины рН цитоплазмы возбудителя. .. - \ ..''...
* 4. Зізхірессия шглей адгезии у клеток возбудителя чумы ре- ;
і истрируется в уезоьиях восприимчивого макроорганизма при

. контакт*? с макро&«гимн,попадании возбудителя в мочу й в под-

- козгло имммш:рзшнных, диффузионных камерах. '-.-.'"'.

' 5. Шли адгезии ъообудителя чуш являются высокоактивным лектшюм,способным фиксироваться на ряде макромолекул макро-оргашша : фибронектияе, коллагене, муцьне, г.чнглиовиде, кото -^:рі5е обладапт.нгйтралкгуйііюй активностью.

' '., 6. Пили адшчж в нативной полимерной форме являются вы-сокйагг/'И.адым биадогичепеш ізещеотвсм,обладающим спооса'тоотью. .стикулиговать взийт пилнрогпняых клеток,оказывать янролш-

ное цитотоксическоо действие .угнетать процесс фагоцитоза, сцособствун его неаавершенности.^ыгывать внраяениое мято-генное и кожнореактивное действие. Совокупность выявленных свойств пилей объясняет механизм их функционирования в качестве фактора вирулентности.

7. Восбудэтсль чумы способен к индукции стрессового отве-та.при этом пили адгезии и капсульний антиген фракции 1 являются стрессовыми белками возбудителя.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации юлоиеш па :

-ВсесОЮЗНОЙ ШКОЛе-СеМИНаре МОЛОДЫХ уЧеНЫХ ПРОТИВОЧУМНЫХ

учереддений Ш СССР (Саратов, 1962).

-Всесоюзной конференции "Молекулярная биология,гекетака и иммунология возбудителей особо опасных инфекцйй"( Ростов , 1984).

-Рабочем совещании молодых ученых и специалистов : "Эпидемиология, молекулярная биология .генетика и и иммунология возбудителя чумы" (Саратов,198б).

-Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки. "(Ленинград.I960).

'.' -Российской научной конференции "Холера. Вопросы эпидемиологии, микробиологии и лабораторной диагностики"(Росгсв,1993)

-Научных конференциях Ростовского отделения Всесоюзного іяікросиологичєского общества. .

-Научных конференциях Ростовского научно-исследовательского противочумного института

ПУБ ПИКАНИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Основное содержаїгае дас-сертациошюй работы отражено в 55 опубликованных работак.а также в 2 отчетах по научно-исследовательским разработкам.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Монография изложена на 244 страницах машинописного текста,отражавших обсуждение проблемы с использованием собственных материалов и специальной литературы, заключения и выводов .содержит 39 таблиц и 35 рисунков. Библиографий представлена 95 отечественными и 155 8а-рубелными работами.