Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вкехрсмоссмные факторы наследственности играют существенную роль в биологии различных видов микроорганизмов. С момента открытия у бактерий плазмид, кодирующих устойчивость к химическим и физическим агентам, катаболизм органических соединений и синтез бактериоцинов, интерес к внехромосомным элементам наследственности продолжает повышаться (Кудлай Д.Г.1977, Воронин A.M. 1983, 1984, Пехов А.П. 1986 и др.).
для изучения основнш элементарных генетических процессов, они составляют основу генноинженерных работ, поскольку используются в качестве векторов для клонирования различных генов (Харди К. 198U, Гловер Я.1988, 1989)
Особое внимание заслужили плаамиды в связи с детерминированием вирулентных свойств патогенных бактерий. В первую очередь, это касается токсинопродукции и капсулоооразования, кодирования ферментов агрессии и адгезинов, цитотоксинов и различных видоспецифических белков поверхностных структур микробных клетск (Пехов А.П. 1986, Uchlda I. 1985, Mikesell P. 1983, Ferber D.M. , Brubaker R.R. 1981 И др.).
Плазмиды широко распространены среди представителей рода Pseudomonas. Достаточно хорошо изучены половые факторы, плазмиды антибиотикореэистентности и биодеградации, обеспечивающие псевдомонадам адаптацию к разнообразным условиям существования а природе. Разнообразие биосинтетических и катаболических ре-акішй у представителей рода Pseudoronas, широко каселяккях биосферу и принимающие активное участие в процессах минерализации органических соединений, очистке окружающей среды от загрязнений, прямо или косвенно связано с плазмидными решшконами (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. 1990, Воронин A.M. 1983, Рубан Е.Л. 1936, Chakrabarty 1976).
Научный и практический интерес к бактериям данного рода дополнительно связан с возможностью псевдомонад вызывать различные заболевания у растений, животных и человека (Смирнов В. В.. Киприанова К. А. 1990, Вегцал Т. 1981). Из всех псе.члпмо-кад медицинского значения Pseuaomonas pseudomallel и Pseudomonas mallei до настоящего времени остаются в числе сравнительно малоизученных возбудителей тяжелых инфекционных заболеваний
(Беляков В.Д.. Ряпис Л.А., Илюхин В.И. 1990).
Культуральные и биохимические свойства возбудителя мелиои доза изучены достаточно подробно (Беляков В.Д., Ряпис Л.А. Илюхин В.И. 1990. Ширяев Д.Т. 1976. Fournler J.. Chambon L 1958). в то же время, генетика данного вида микроорганизма ос тается одним из наименее исследованных разделов. Методически приемы работы с внехромосомными факторами наследственност P.pseudatnallei разработаны недостаточно. В литератур» имеете: сравнительно небольшой материал об особенностях наследования і экспрессии плазмид 1псР-1 группы в штаммах возбудителей сапа і мелиоидоза и условиях передачи в бактерии данных видов различ ных плазмид антибиотикорезистентности (Агеева Н.П., Меринов Л.К. 1986, Петере М.К.. Шиповская Н.П., МериноваЛ.К. 1983 Сеймова И.К., 1988, Абаев И.В. 1995).
Собственные плазмиды P.pseudomallel остаются практическі не изученными. В единичных публикациях сообщается лишь о выявлении плазмидных репликонов у возбудителя мелиоидоза (Петере М.К. 1982. Tanphaichitra D, 1989). Однако, обнаружение плазмидных ДНК в одном или двух штаммах не дает представления с природном носительстве, закономерности выделения плазмид ) P.pseudomallel и их функциональной значимости. Следует заметить, что в литературе отсутствуют данные о размере плазмид J их физической структуре, нуклеотидном составе и гомологии нук-леотидных последовательностей.
Учитывая, что в литературе отсутствуют сведения о плазмид-ном анализе, структурной организации, и функциональной значимости плазмид P.pseudomallel, представлялись весьма актуальными исследования, направленные на изучение внехромосомных репликонов возбудителя мелиоидоза.
Дель работы заключалась в изучении плазмидногс спектра штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных в различны* географических регионах, проведении первичной характеристик* плазмид и оценки возможности их использования в качестве маркеров при внутривидовом типировании штаммов P.pseudomallel. а также для конструирования на их основе ДНК-зонда.
Основные задачи исследования: 1. Отработать эффективный метол плазмидного скрининга и препаративного выделения плазмидных ДНК P.pseudomallel.
- Б
-
Прозести сравнительный рестриутіионні,'* зяагиз оЗкйруг.еи-мх плазмид.
-
Изучить гомологию ДНК плазмид P-pseudeffiailel на внутри-вдогсч к межвидовом уровнях и оценить возкожностъ кокструиро-іанкк на кх основе специфического ДКК-зонда.
-
Осукествить передачу плазмид P.pseudomallei в гетеролс-'лчкь'е виды микроорганизмов для последующего изучения свойств
ЮЛучеКНЫХ ГИОрИДНЫХ ?АМОВ.
Научная новизна, Rnonnu-. -^;;;;- 7^,.««
;ичес!Г.!Х регионах. Предложен ускоренный вариант скрининга ітачмов P.pseudanallei на наличие в нехромосомных репликонов и ітработан метод препаративного выделения плазмид возбудителя (елиоидоза, позволяющий проводить их молекулярнс-биологическое гсследование. Впервые изучена взаимная гомология криптическкх їлазмид возбудителя мелиоидоза и гомология ДНК плазмид с ге-гомной ДНК близкородственных и гетерологичньк видов микроорга-іизмоа. На основе фрагмента критической плазмиды pFUl создан руппоспецифнческий гибридизационкыи ДНК-зонд для иденткфкка-ик патогенных псездсмснад. Осусествлека передача плазмидкых «пликоков P.pseudanallei в Етачм Р.паї lei, определен плазмид-мй профиль и изучены отдельные фекотипические свойства Полуниных культур.
Практическая ценность.
Практическая ценность работы заключается в конструировании руппоспецифкческого ДНК-зонда, с помощью которого возможна щентифккация патогенных псевдомонап от других представителей ода Ps'.'i'dononas методом молекулярной гибридизации, вкязлении :азличннх типов плазмид, которые ысгут быть использованы ДЛЯ '.арактеристкки втаммов и создании векторов для P.pseudomallei, і также получении набора штаммов патогенных псевдомонад, поз-юлягааэго изучать свойства плазмидных региккоков возбудителя іелиоидоза.
Материалы диссертационной работы использованы при оформле-іии методических рекомендаций "Ускоренный метод обнаружения їлазмид в бактериях рода Pseudoronas", утвержденных 16 декабря 933г. директором Волгоградского НИЖИ проф. Н.Г.Тихоновым: Іетодических рекомендаций "Лабораторная диагностика, лечение и
- б -
профилактика мелиоидоза", утвержденных і ноября 1994г. аам. председателя Госкомсанэпиднадэора России Г.Г.Онгааенко.
Плазмидный анализ и отработанная методика выделения внех-ромосомных репликонов P.pseudomallel используется в лабораториях Волгоградского НИПЧИ при изучении инсерционных мутантов и генетически измененных штаммов патогенных псевдомонад.
Положения, выносимые на защиту:
-
В штаммах P.pseudomallel выявлены внехромосомн^-- репли-коны различного размера, что открывает возможность использования пдазмидного анализа для внутривидового типировакия втаммов возбудителя мелиоидоза.
-
Идентичные по размеру и рестрикционному профилю плазии-ды обнаружены в штаммах P.pseudomallel. выделенных в различных географических регионах.
-
Плазмиды возбудителя мелиоидоза обладают взаимной комп-лементарностью и гомологией к ДНК P.pseudomallei, P.mallei и P. cepacia.
-
Сконструирован рекомбинантный фаг M13FM, содержащий фрагмент критической плазмиды рРМ1, который может быть использован в качестве продуцента группоспецкфического ДНК-зонда для идентификации P.pseudomallel и P.mallei.
-
Штаммы возбудителя сапа являются реципиентами критических плазмид P.pseudomallel, пригодными для изучения структурной организации и функциональной значимости плазмидных репликонов возбудителя мелиоидоза.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ (Волгоград. 1990, 1991. 1993), на Российской научной конференции 'Тенетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград. 1992).
По материалам диссертации опубликовано б научных статей.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 169 источников, в том числе 86 отечественных и 83 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 24 рисунками.