Введение к работе
Актуальность темы. Ферменты - высокоспецифические катализаторы белковой природы, осуществляющие регуляцию клеточного метаболизма, незаменимы в клинической практике, промышленности, сельском хозяйстве и ааутпах. исследованиях. Поиск и селекция продуцентов ферментов, оптимизация условий их куяътивярованид, рпзр'^ткя способов получения и применения ферментных препаратов яэсохояиад для развития современной биотехнологии. Изучение закономерностей образования ферментов микроорганизмами и механизмов, регулирующих продукцию ферментов, - ключевые вопросы клеточной биологии, основа целенаправленного и эффективного использования биосинтетического аппарата микроорганизма-продуцента.
Анализ имеющейся информации по проблеме показывает, что регу-ляторнае механизмы синтеза ферментов изучены, в основном, на про-кариотических организмах. Значительно меньше данных о контроле образования секретируемых эукариотами ферментов, осуществляющих деградацию растительных полимеров.
Экзоферменты грибов являются специфическими продуктами вторичного метаболизма. В ряде обзоров (Шапошников, 1968; Bezborodov.
1978: Calem. 1979s Hose. 1979: ФеОфИЛОВЙ, 1981; Campbell. 1984)
обобщены данные по образованию микроорганизмами вторичных метаболитов. Изучение контрольных механизмов синтеза внеклеточных ферментов эукариотами - необходимый этап развития теории вторичного метаболизма. Эти исследования также важны для расширения наших представлений о роли грибов-деструкторов органического вещества растительных остатков в биогеоценозах.
Общебиологическая значимость проблемы обусловливает необходимость проведения широкого сравнительного изучения образования эк-зодвполимераз грибами и установления механизмов, контролирующих синтез. Ценность и актуальность таких исследований подтверждается также практической значимостью данной группы ферментов. Деполиме-разы, катализирующие расщепление растительной клеточной стенки, незаменимы в технологических процессах переработки растительного сырья. Особенно важны пектиндеполимеразы - ведущие ферменты в мацерации растительной ткани. Пектиндеполимеразы обеспечивают увеличение выхода, улучшение качества продуктов пищевой промышленности. Перспективно их использование в винодельческой, легкой и фармацевтической промышленности. Препараты могут применяться в качестве биохимреактивов для выделения растительных клеток, протопластов.
клеточных, структур, для изучения строения растительных полимеров.
Пвктиндеполимеразные ферментные препараты в республике Беларусь не производятся. Экономическая целесообразность их использования в процессах переработки растительного сырья определяет необходимость разработки отечественных препаратов для решения проблем народного хозяйства, здравоохранения и науки.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссер
тационная работа выполнена в лаборатории ферментов Института мик
робиологии АН Беларуси в течение 1983-1994 гг. как часть четырех
плановых тем: "Изучение индуцированного и конститутивного синтеза
экзодеполимераз у микроорганизмов различных таксономических групп"
(1983-1985), n Госрегистрации 01.83.0006337; "Изучение биогенеза-
микробных деполимераз" (1986-1988), ы Госрегистрации 01.86.
0003709; "Регуляция образования полиферментных систем микроорга
низмов, расщепляющих природные полимеры" (I989-I99I), н" Госрегист
рации 01.890005269; "Исследование синтеза и характеристика фер
ментных белков у микромицетов и их регуляторных мутантов" (1992-
1995), ы Госрегистрации 01.92.0004533. Ряд разделов работы выпол
нен в рамках КП НТП СЭВ, тема n I "Разработка и внедрение техноло
гии и техники производства шюдово-оводаых соков с использованием
мацерируюших и иммобилизованных ферментных препаратов" (1989-
ГЭЭ1). '
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении закономерностей образования экзодеполимераз грибами, определении физиолого-биохимических особенностей регуляции их синтеза. В качестве основного объекта выбраны пектиндеполимвразы - ведущие ферменты в мацерации растительной ткани.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
изучение способности грибов различных родов продуцировать внеклеточные деюлимеразы;
отбор грибов - высокоактивных продуцентов ферментов, их морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика;
выяснение влияния факторов среды нз образование пектиндепо-лимераз;
сравнительный кинетический анализ синтеза ферментов, регулируемого различными механизмами;
исследование участия специализированных и неспециализированных регуляторов в механизмах контроля синтеза ферментов;
изучение полиферментных систем пектиндеполимераз грибов;
получение и оценка перспективы применения ферментных препаратов мацерирующего действия.
Научная новизна полученных результатов. Показана широкая распространенность у мицелиальнах гриоов различных родов способности рассепяятъ- 'растительные по-лисз^гридч и особенно пектиновые веще-ства. Установлено, что для Солъетютвэ иослчлованньа. грп'св гярга-терея индуцированный синтез пектингидролаз и целлюлаз, а тзкжэ индуцированный и конститутивный, частично репрессируемый глюкозой, синтез п^ктинлиаз и ксиланаз.
Впервые проведен сравнительный кинетический анализ индуцированного и конститутивного синтеза пектиндеполимераз с различной чувствительностью к катаболитной репрессии. Установлено, что, независимо от контрольного механизма, продуцирование пектингидролаз и пектинлиаз характеризуется общими закономерностями, присущими процессам синтеза вторичных метаболитов. Показано, что при участии в регуляции образования деполимераз двойного контроля - индукции и катаоолитной репрессии, конститутивности и катаболитной репрессии - происходит значительное разобщение фаз роста гриоов и продукции фэрментов, снижение скорости синтеза, удлинение времени достижения ее максимального значения по сравнению с процессами, регулируемыми одним контрольным механизмом.
Детально исследовала катаоолитная репрессия образования пек-тпвдояолкмерез грибами: установлена неспецифичность репрессии, зависимость эффекта от концентрации и времени действия рэпроссорэ. Впервые показано, что специализированный регулятор ц-З'.Ь'-АМФ участвует в контрольном механизме катаболитной репрессии как конститутивного, так и индуцированного синтеза пектиндеполимераз. Выявлено, что реализация катаоолитной репрессии синтеза пектингидролаз осуществляется на уровне транскрипции.
Показано, что грибные нектингидролаза и пектинлиазы представлены множествеиными молекулярными формами. Впервые выявлено, что молекулярные формы ферментов различаются как по способу действия, субстратной специфичности, оптимальным условиям деградации субстратов, так и по механизмам регуляции их синтеза. Контрольные механизмы синтеза, такие как конститутивность, индукция, катаоолитная репрессия, обеспечивают продукцию необходимого в данных условиях спектра множественных. молекулярных форм ферментов с определенной функциональной значимостью. Впервые выявлено, что конститутивний.
л устойчивый к репрессии KafactojaiTOM контроль является обязательным, базовым механизмом регуляции образования наиболее функционально важных ферментов пектиндеполимеразных комплексов.
Можно полагать, что установленная молекулярно-функциональная гетерогенность пектиндеполимерзз грибов представляет собой эволю-ционно закрепленную экологическую вариабельность ферментного аппарата, возникшую в условиях использования гетерогенных природных биополимеров. Биологическая целесообразность существования различных контрольных механизмов образования пектиндешлимераз у грибов заключается в обеспечения необходимого состава полифэрментных комплексов посредством дифференциального синтеза ферментов, что может рассматриваться как элемент сложной системы адаптации, высокой конкурентоспособности и экологической пластичности культур.
Впервые ПОКаЗВНа СПОСОбНОСТЬ ШТеММОВ Aspergillus alliaceue,
выделенных из различных природных источников, продуцировать пек-тиндеполимеразы и предложено использовать это свойство в качестве дополнительного таксономического критерия вида.
Полученные в работе результаты существенно дополняют и расширяют представление о синтезе и контрольных механизмах образования эукаркотами внеклеточных ферментов и имеют большое значение для ввкнейшего раздела микробиологии - физиологии и биохимии микроорганизмов.
Практическая значимость полученных результатов. В результате проведенной работы выделены перспективные в промышленном отношении продуценты пектолитических.и ксиланолитических ферментов. Отселек-тированы и защищены авторскими свидетельствами СССР высокоактивные
Продуценты ПеКТИНДеПОЛИМераЗ Aspergillus alliaceus БИМ-83. БШ-87, Fenicilllum adamotzii БИЫ-90. P.digitatum 324, P.citrlnu» БИМ-9І, p. jenthineiium БШ-303, p.soiitum ЛБФ-І5. p.ianosum ЛБФ-3. Получены морфологически и Оиосивтетически стабильные мутантные' штаммы
Aspergillus alllaceus, ПрвВЫШаоЦИе В Z-3 раЗВ ПО ПРОДУКТИВНОСТИ
ферментов пектингидролазного комплекса исходный штамм.
Предложены и защищены авторскими свидетельствами СССР питательные среда для культивирования Peniciiiium digitatum. Рвзрабо-тан и защищен авторским свидетельством СССР способ получения комплекса мвцерирупцих ферментов, содержащего пектингидролазы и протеазу Aspergillus aiiiaceus. Отработаны условия получения мацэриру-вдих ферментных препаратов Пектомацерин ГЗх, ПОх, Г20х. Нектал-диацин ГОх, ГЮх.
Разработан лабораторный регламент и временная технологическая инструкция на производство препарата Поктомацерин. Технология получения препарата апробирована на Московском и Вильнюсском ОПЗ ферментных препаратов, Ладыжинском заводе ферментных препаратов. Приволжском и Унгенском биохимзаводах. Препараты Пектомацерин и Пекталлиацин проверены на безвредность и разрешены для применения ї пищчвой прошшйшюстя. '
Разработаны ферментатимше способы получения экстрактов для производства безалкогольных напитков; комплексной переработки пряно-ароматического сырья; получения льняной тресты и пищевого цитрусового пектина; акспресс-определения устойчивости клубней картофеля к внутренним механическим повреждениям. Указанные способы защищены авторскими свидетельствами СССР и могут служить основой для создания новых промысленных технологий.
Перспективно использование препаратов Пектомацерин и Пектал-лиацин в технологиях получения фруктово-ягодных, плодовых и овощных таре, нектаров, соков с мякотью. Ферментативная обработка сырья увеличивает выход продукта на 8-18. Эффективность применения препаратов подтверждена полупроизводственными и производственными испытаниями, проведенными на Кипгиневском экспериментальном консервном заводе, Павловском пищекомбинате, консервном комбинате "Адыгейский" (Краснодарский край). Показано, что Пектомацерин эффективен при осветлении яблочных соков, обработке мандаринов и винограда сорта "Изабелла", а Пекталлиацин - при получении эфирного масла из лепестков розы.
Выявлена возможность применения препаратов мацерирующего действия как биохимреактивов в научных исследованиях для получения жизнеспособных изолированных растительных клеток и протопластов.
Препараты Пектомацерин и Пекталлиацин отмечены дипломами I и II степени на ВДНХ БССР (1987 г.), экспонировались на ВДНХ СССР (1988 г.). Международных выставках в Чехословакии (1968 г.) и Германий (1989 Г.).
Экономическая значимость полученных результатов. Штаммы грибов - . высокоактивных продуцентов пектиндеполимераз, технологии I получения ферментных препаратов, новые ферментные препараты мацерирующего действия, разработанные на их основе ферментше способы получения из растительного сырья ценных продуктов'для пищевой, легкой, фармацевтической промышленности и научных- исследований являются коммерческими продуктами и могут быть реализованы заинтэ-
ресованнш предприятиям и организациям.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Широкая распространенность у мицелиальных грибов способности продуцировать внеклеточные деполимеразы, катализирующие расщепление растительных полимеров, участив индукции, конститутивности, катаоолитной репрессии в регуляции их образования. Характеристика катаоолитной репрессии синтеза пектиндеполимераз, роль ц-3',5"-АМФ в механизме катаболитноя репрессии индуцированного и конститутивного образования пектингидролаз и пектинлиаз. Конститутивный, устойчивый к репрессіл катабслитом контроль - базовый механизм регудящш наиболее функционально важных ферментов иектиндеполимеразных комплексов.
Множественность молекулярных форм пектиндеполимераз, их отличие по механизмам регуляции образования, способу действия, субстратной специфичности, оптимальным условиям деградации субстратов. Молекулярно-функционалъная гетерогенность пектиндеполимераз грибов как эволюшонно закрепленная вариабельность ферментного аппарата, возникшая в условиях использования гетерогенных природных полимеров. Биологическая целесообразность различных механизмов контроля образования пектиндеполимераз, заключающаяся в формировании комплексов определенного состава посредством дифференциального синтеза ферментов. Различные контрольные механизмы'образования пектиндеполимераз как элемент сложной системы адаптации, высокой конкурентоспособности и экологической пластичности грибов.
Новые продуценты пектиндеполимераз, отличающиеся от известных, в том числе используемых в промышленности, составом ферментных комплексов и активностью компонентов. Разработанные ферментные препараты и созданные на их основе способы выделения из растительного сырья ценных продуктов для пищевой, легкой, парфюмерной, фармацевтической промышленности и научных исследований.
Личный вклад соискателя. Михайловой Р.В. научно аргументировано направление исследований, осуществлена постановка задач, разработаны подходы их решения, получен, обобщен и обоснован экспериментальный материал диссертационной работы. Соавторами научных трудов диссертанта являются сотрудники лаборатории ферментов, участвовавшие в,выполнении экспериментов.
Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены на vi и vn Съездах Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980; Алма-Ата, 1985), vin Между-
народном микробиологическом конгрессе (Бостон, США, 1902), VII международной конференции по прикладной микробиологии (Хельсинки, Финляндия, 1985), Советско-финском семинаре по микробиологической деградации лигно-целлюлозного сырья (Тбилиси, 1985), їх Международном симпозиуме "Непрерывное культивирование в биотехнологии и охрана окружающей среды" (Кралов-Градец, Чехия, 1987), iv Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Советско-Линокпм гоцинэро по биоксаьирсйк раети*«льнкх МЙ. териалов" (Зспо. Финляндия, 1990). В заверенном виде диссертационная работа доложена на расширенном заседании лаборатории ферментов и лаборатории биохимии института микробиологии АН Беларуси, на заседании Ученого Совета Института микробиологии АН Беларуси (Минск, 1995).
Опубликованность результатов. Результаты исследований опубликованы в 2 коллективных монографиях, 34 статьях в научных журналах, 8 сборниках и 20 тезисах конференции, защищены 13 авторскими свидетельствами на изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, анализа и обобщения результатов исследований, выводов, списка использованных источников, приложений.