Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .15
1.1 Роль макроорганизма в формировании вагинального микробиоценоза 16
1.2 Роль лактобацилл в противоинфекционной защите влагалища и поддержании стабильности вагинального микробиоценоза .18
1.3. Молекулярно-генетические методы в изучении вагинального микробиоценоза: новые взгляды на микробиоту влагалища 26
1.4. Нарушения и методы коррекции вагинального микробиоценоза .29
1.5. Влияние хлоргексидина на микроорганизмы и применение кавитированных антисептических растворов в акушерстве и гинекологии 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Характеристика обследованных групп женщин и дизайн исследования 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Микроскопическое исследование 43
2.2.2. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени для оценки микробиоценоза влагалища .44
2.2.3. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени для генотипирования вагинальных лактобацилл 48
2.2.4. Статистические методы 50
Глава 3. Видовой состав вагинальных лактобацилл у женщин репродуктивного возраста с различными вариантами микробиоценоза влагалища 51
3.1. Частота выявления и доминирования отдельных видов лактобацилл во влагалище у женщин репродуктивного возраста с нормоценозом и дисбиотическими нарушениями .51
3.2. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании отдельных видов лактобацилл .53
3.2.1. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus crispatus .56
3.2.2. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus iners .57
3.2.3. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus gasseri 58
3.2.4. Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании Lactobacillus jensenii 60
Глава 4. Изучение изменений качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза после обработки влагалища кавитированноым низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина .62
4.1. Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на количество и долю лактобацилл в вагинальном микробиоценозе .62
4.2. Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на видовой состав лактофлоры 67
Глава 5. Оценка эффекта последовательного применения обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% водным раствором хлоргексидина и пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые Lactobacillus crispatus, на вагинальную микрофлору у женщин с дисбиозом влагалища в зависимости от доминирущего вида лактобацилл 69
Заключение .80
Выводы 87
Практические рекомендации 88
Список сокращений .89
Список использованной литературы .
- Роль лактобацилл в противоинфекционной защите влагалища и поддержании стабильности вагинального микробиоценоза
- Микроскопическое исследование
- Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании отдельных видов лактобацилл
- Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на видовой состав лактофлоры
Роль лактобацилл в противоинфекционной защите влагалища и поддержании стабильности вагинального микробиоценоза
Одним из ключевых факторов поддержания стабильности вагинального биотопа считаются микроорганизмы, колонизирующие вагинальный эпителий, и тем самым обеспечивающие сниженную восприимчивость к урогенитальным инфекциям [155, 254, 266]. Микроорганизмы, населяющие влагалище, находятся в сложных и тесных взаимоотношениях, как между собой, так и с макроорганизмом. Качественный и количественный состав вагинальных микроорганизмов различается среди индивидуумов [129, 160, 240], а также изменяется под действием различных эндо- и экзогенных факторов [82, 111, 112, 226, 251], в том числе при беременности [294]. Причем кардинальные изменения в составе вагинального микробиоценоза могут происходить в течение короткого промежутка времени [75, 232, 268]. В то же время в долгосрочной перспективе состав вагинального микробиоценоза является относительно стабильным. Например, в одном из исследований было продемонстрировано, что состав вагинальной микробиоты у здоровых женщин не претерпевает существенных изменений во время менструального цикла [162]. Хотя в другом исследовании был получен диаметрально противоположный результат [268]. Весьма узкий спектр микроорганизмов выделяется в качестве доминирующих, особенно в группе лактат-продуцирующих бактерий [232]. Более того, по сравнению с другими биотопами человека, состав вагинальной микрофлоры является наиболее постоянным среди индивидуумов, особенно если проводить оценку на родовом уровне [157]. По всей видимости, со стороны макроорганизма имеются факторы, обеспечивающие селекцию отдельных групп микроорганизмов [148, 232].
Одним из ключевых факторов, влияющих на состав и количество микроорганизмов, населяющих влагалище, является уровень эстрогенов [115]. При повышении уровня эстрогенов увеличивается количество гликогена в вагинальном эпителии [69, 115], который является питательным субстратом для лактобацилл [60]. Значительное повышение уровня эстрогенов и прогестерона наблюдается при беременности, что также приводит к утолщению вагинального эпителия и увеличению содержания гликогена [69]. Лактобациллы ферментируют гликоген до лактата, закисляя среду (до значений pH 4,5), что традиционно является одним из показателей здоровья влагалища [60]. Некоторые исследователи демонстрируют, что лактобациллы не способны утилизировать гликоген [189, 238, 270]. В таком случае питательным субстратом является продукт его деградации (за счет низкого pH или клеточных ферментов) – глюкоза [67]. Поэтому до сих пор не ясно, что именно ферментируют лактобациллы in vivo – гликоген или глюкозу, однако в конечном итоге все равно происходит сбраживание до молочной кислоты. По мере уменьшения уровня эстрогенов после менопаузы наблюдается постепенное снижение количества вагинальных лактобацилл или их полное исчезновение [146, 152, 213, 303]. Восстановление же уровня эстрогенов при заместительной гормональной терапии приводит к реколонизации вагинального эпителия лактобациллами [146]. Кроме лактобацилл влагалище здоровых женщин могут населять другие микроорганизмы, продуцирующие молочную кислоту: Atopobium vaginae, Megasphaera spp. и Leptotrichia spp. [237, 310, 311]. Молочная кислота, продуцируемая данными микроорганизмами, наряду с другими факторами микробного и немикробного происхождения, подавляет рост остальных бактерий [68, 210]. Помимо продукции молочной кислоты представители нормальной микрофлоры блокируют адгезию патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на клетках вагинального эпителия [66, 86, 212, 296, 308] и продуцируют другие вещества с прямой антимикробной активностью [57, 142, 204].
Ряд исследователей отмечают, что качественный и количественный состав микроорганизмов, населяющих влагалище, значительно отличается среди представителей различных рас и этнических групп [56, 218, 232, 310, 311]. Данный факт свидетельствует о том, что существуют генетические факторы, обеспечивающие селективные преимущества отдельным видам вагинальных микроорганизмов. В проспективном исследовании Srinivasan et al. было продемонстрировано, что во время менструаций наблюдается транзиторное снижение количества лактобацилл и увеличение количества Gardnerella vaginalis, рост которой по предположению авторов может стимулироваться ионами железа, присутствующими в менструальной крови [268].
Таким образом, противоинфекционная защита вагинального эпителия опосредована как самим эпителием и факторами врожденного и адаптивного иммунитета, так и населяющими его микроорганизмами (главным образом лактобациллами). В то же время качественный и количественный состав вагинальной микробиоты во многом регулируется макроорганизмом.
Впервые о вагинальных лактобациллах упоминает профессор Додерлейн, опубликовавший в 1892 году монографию, в которой описал бактерии, продуцирующие молочную кислоту, способную ингибировать рост патогенных микроорганизмов in vitro и in vivo [102]. В 1928 году Thomas et al. идентифицировали палочки Додерлейна как Lactobacillus acidophilus, но при этом предположил, что в дальнейшем данная группа микроорганизмов будет реклассифицирована [282]. В 1980 году было продемонстрировано, что L. acidophilus является гетерогенной группой бактерий с общими биохимическими свойствами [175]. Эта группа была разделена на основании гомологии ДНК (чего нельзя было сделать биохимически) [163], в результате были выделены несколько видов лактобацилл внутри комплекса L. acidophilus [105, 114, 247]:
Микроскопическое исследование
Для изучения видового состава вагинальных лактобацилл у женщин репродуктивного возраста в исследование были включены 608 женщин в возрасте от 18 до 45 лет, (средний возраст 30,3±6,6 лет), наблюдавшихся в медицинском центре «Гармония» или обратившихся на прием к гинекологу в период с сентября 2011 по август 2014 года. Помимо возраста критериями включения в исследуемую группу являлось отсутствие у пациенток ВИЧ-инфекции, парентеральных гепатитов, возбудителей ИППП: Treponema pallidum, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis, а также отсутствие системного или местного приема антимикробных препаратов в течение четырех недель перед исследованием.
Всех женщин обследовали однократно: оценивали состояние микробиоценоза влагалища и проводили генотипирование 6 видов лактобацилл с помощью метода ПЦР-РВ (рисунок 2.1).
С целью изучения изменений качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза, возникших в результате воздействия КНУЗ РХ были обследованы 104 пациентки, планировавшие искусственное прерывание беременности (ИПБ) в сроках от 5 до 12 недель методом вакуум-аспирации. Средний возраст беременных составил 29,3±6,7 лет.
С целью профилактики воспалительных осложнений ИПБ всем женщинам, планировавших проведение вакуум-аспирации [26, 29], проводили обработку влагалища КНУЗ РХ с помощью аппарата АУЗХ-100 в соответствии с руководством [26]: время воздействия – 1-2 минуты, мощность – 6-8 единиц, объем используемого раствора – 150-200 мл. Беременным с клинико-лабораторными признаками вагинита или БВ назначали три процедуры, обработку проводили один раз в сутки, последнюю – за 1-2 часа до манипуляции; клинически здоровым женщинам с профилактической целью выполняли одну процедуру за 1-2 часа до манипуляции.
Состояние микробиоценоза влагалища исследовали до и после обработки влагалища КНУЗ РХ микроскопическим методом и методом ПЦР-РВ. У 71 из 104 пациенток в дополнение к оценке микробиоценоза до и после обработки генотипировали вагинальные лактобациллы (рисунок 2.1).
Для оценки эффекта последовательного применения обработки влагалища КНУЗ РХ и пробиотического препарата для перорального применения, содержащего живые L. crispatus, на вагинальную микрофлору у женщин с дисбиозом влагалища в зависимости от доминирующего вида лактобацилл в исследование были включены 84 женщины в возрасте от 18 до 44 лет (средний возраст 30,7±5,5) с дисбиозом влагалища, подтвержденным методом ПЦР-РВ. В зависимости от выраженности дисбиотических нарушений обследованные были разделены на две группы: 32 женщины с умеренным анаэробным дисбиозом (группа I) и 52 женщины с выраженным анаэробным дисбиозом (группа II).
С целью коррекции дисбиоза влагалища всем пациенткам на первом этапе проводили обработку влагалища КНУЗ РХ с помощью аппарата АУЗХ-100 в соответствии с руководством [26] (время воздействия – 1-2 минуты, мощность – 6-8 единиц, объем используемого раствора – 150-200 мл, кратность – один раз в день в течение трех дней подряд). На втором этапе все пациентки получали пробиотический препарат на основе L. crispatus «Экофемин Флораваг» (ЭФ) по 1 капсуле 2 раза в сутки в течение 10 дней перорально. ЭФ является биологически активной добавкой, содержащей три вида лактобацилл: L. crispatus, L. brevis и L. acidophilus.
Клиническую оценку состояния нижних отделов гениталий и определение видового состава лактобацилл проводили до начала и после окончания лечения. Состояние микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ исследовали трехкратно: до лечения – на этапе первичного консультирования; непосредственно после третьей обработки влагалища КНУЗ РХ; через месяц после окончания приема ЭФ (рисунок 2.1).
Особенности вагинального микробиоценоза при доминировании отдельных видов лактобацилл
L. iners оказался самым часто выявляемым видом лактобацилл у женщин, в том числе в качестве доминирующего. L. iners выявляли у 366 (60,2%) пациенток, в том числе в качестве доминирующего – у 295 (48,5%).
Индекс доминирования для L. iners был наибольшим в группе пациенток с выраженным дисбиозом – 96% (таблица 3.1). То есть L. iners при выраженном дисбиозе являлся доминирующим видом лактобацилл в 96% случаев его выявления. Реже данный вид доминировал при умеренном дисбиозе (86% случаев) и еще реже при абсолютном нормоценозе (70% случаев). Таким образом, частота доминирования L. iners была достоверно выше при дисбиотических состояниях и составила 96% (против 70% при абсолютном нормоценозе, p 0,001) при выраженном и 86% при умеренном дисбиозе (против 70% при абсолютном нормоценозе, p=0,028).
При нормоценозах на фоне доминирования L. iners отмечали более высокие средние количества УПМ: Eubacterium spp. (104,7 против 103,7, p=0,007), микроорганизмов группы MVD (103,4 против 103, p=0,001) и микроорганизмов группы GPP (104 против 103,6, p=0,001). A. vaginae выявляли в среднем количестве 102,9, что достоверно не отличилось от аналогичного показателя в референтной группе (рисунок 3.2).
При дисбиозах на фоне доминирования L. iners отмечали наибольшую кратность прироста трех из четырех групп УПМ (группы GPP и MVD, A. vaginae): среднее количество микроорганизмов группы GPP увеличивалось в 2512 раз, Eubacterium spp. – в 20 раз, группы MVD – в 5012 раз, A. vaginae – в 19553 раза. Примечательно, что только при доминировании L. iners наблюдается такой колоссальный прирост сразу трех групп УПМ: группы GPP, группы MVD и A. vaginae.
Таким образом, в обследованной нами группе женщин L. iners оказался наиболее распространенным видом вагинальных лактобацилл, причем присутствовал как у женщин, состояние микробиоценоза которых соответствовало нормоценозу, так и у пациенток с дисбиотическими нарушениями. При этом частота его доминирования зависела от доли лактофлоры в микробиоценозе и значительно повышалась именно при дисбиозах, особенно при выраженных.
Lactobacillus gasseri L. gasseri выявляли у 117 (19,2%) женщин, в том числе у 75 (12,3%) – в качестве доминирующего вида. Индекс доминирования для L. gasseri был наибольшим в группе пациенток с умеренным дисбиозом – 74% (таблица 3.1). То есть, данный вид при условии его выявления доминировал у женщин с умеренным дисбиозом в 74% случаев, в то время как при выраженном дисбиозе L. gasseri доминировал только у 57% женщин, у которых выявляли данный вид, а при абсолютном нормоценозе – у 53% обследованных.
При нормоценозах на фоне доминирования L. gasseri не выявили значимых различий по количеству УПМ в сравнении с референтной группой (рисунок 3.2). Среднее количество микроорганизмов группы GPP составило 103,9, Eubacterium spp. – 104, группы MVD – 102,9, A. vaginae – 102,8.
На фоне доминирования L. gasseri при дисбиозах отмечали увеличение количества микроорганизмов группы GPP в 501 раз, Eubacterium spp. – в 100 раз, группы MVD – в 6 раз. Среднее количество A. vaginae оставалось прежним. То есть, при доминировании видов L. crispatus и L. gasseri наблюдали примерно одинаковую картину: неизменное количество (или даже небольшое снижение) A. vaginae и умеренное увеличение количества остальных УПМ, в основном за счет группы GPP.
Таким образом, L. gasseri являлся третьим по частоте доминирования видом вагинальных лактобацилл после L. iners и L. crispatus. Исключение составляют промежуточные состояния микробиоценоза, а именно умеренный дисбиоз, при которых значительно повышалась частота доминирования L. gasseri. Количества УПМ на фоне доминирования L. gasseri при нормоценозах минимальны и не отличаются от аналогичных показателей при доминировании L. crispatus, а при дисбиозах наблюдается умеренное увеличение количеств УПМ (в основном за счет группы GPP).
Значение выявления L. gasseri в качестве доминирующего вида в каждом конкретном случае нуждается в индивидуальной интерпретации. Потенциально неблагоприятным может быть сочетание L. gasseri с L. iners, так как на фоне доминирования последнего наблюдается самый большой прирост УПМ при дисбиозах. Сочетание L. gasseri/L. crispatus возможно расценивать как более благоприятное, так как количества УПМ и кратность их прироста при доминировании данных видов минимальны.
Влияние обработки влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05% раствором хлоргексидина на видовой состав лактофлоры
Для проверки этого предположения было решено установить частоту доминирования отдельных видов лактобацилл среди женщин с различными вариантами микробиоценоза влагалища. С помощью метода ПЦР-РВ нами были изучено состояние вагинального микробиоценоза и состав лактофлоры у 608 женщин репродуктивного возраста. Было продемонстрировано, что влагалище каждой женщины могут колонизировать до пяти видов лактобацилл одновременно. Однако, доминирующее положение, как правило, занимает один вид, тогда как остальные присутствуют в значительно меньших количествах и являются сопутствующими. Данный факт обуславливает возможность смены доминирующего вида лактобацилл в случае изменения условий в биотопе.
Наиболее часто выявляемыми видами лактобацилл являлись L. iners и L. crispatus, реже выявляли L. jensenii и L. gasseri. L. johnsonii и L. vaginalis не вносили существенного влияния в формирование вагинального микробиоценоза. Первый вид выявляли крайне редко, всего у 3 из 608 пациенток, то есть менее чем в 1% случаев. Второй вид выявляли относительно часто, но, как правило, в низких количествах – в 81% случаев доля этого вида не превышала 10% от суммарного количества Lactobacillus spp. в исследуемой пробе.
Частота доминирования отдельных видов лактобацилл зависела от суммарной доли Lactobacillus spp. в микробиоценозе. L. crispatus с большей частотой доминировал у женщин с долей лактофлоры более 80%, что соответствует критериям нормоценоза. Наибольшая частота доминирования L. gasseri и L. jensenii была отмечена у женщин с долей лактофлоры 20-80%, данные варианты микробиоценоза расценивают как умеренный дисбиоз. Наиболее часто встречающийся вид – L. iners – как доминирующий выявляли при любых вариантах микробиоценоза, однако по мере снижения общей доли нормофлоры в микробиоценозе увеличивалась частота обнаружения его как единственного вида лактобацилл. При доле лактофлоры менее 20% (выраженном дисбиозе) L. iners, как правило, оставался единственным детектируемым видом лактобацилл. По всей видимости, это связано с метаболической пластичностью данного вида и способностью быстро адаптироваться к новой среде обитания, посредством оперативного изменения уровня экспрессии разных групп генов [183, 184].
Объективные микробиологические данные, полученные в настоящем исследовании, позволяют заключить, что наиболее благоприятным вариантом вагинального микробиоценоза является нормоценоз (микробиоценоз с долей лактофлоры не менее 80%) с доминированием L. crispatus. При доминировании данного вида лактобацилл отмечается наименьшее количество УПМ и не так высок прирост их количества при развитии дисбиоза. Роль L. iners в формировании различных видов микробиоценоза влагалища окончательно не ясна. С одной стороны, частота доминирования данного вида более высока при пониженной доле лактофлоры, что соответствует критериям дисбиоза, а количество УПМ при нормоценозах и их прирост при дисбиозах на фоне доминирования данного вида максимальны. Эти наблюдения позволяют предположить, что L. iners обладает сниженным протективным потенциалом в сравнении с другими видами лактобацилл, особенно L. crispatus. С другой стороны, способность данного вида доминировать при нормоценозе и сохраняться при дисбиотических состояниях с повышенным уровнем рН наводит на мысль, что адаптивный потенциал L. iners может обеспечивать реколонизацию влагалища другими видами лактобацилл после устранения инициирующего фактора дисбиоза [184]. В таком случае L. iners можно рассматривать как буфер между нормоценозом и дисбиозом, а его выявление в сочетании с L. crispatus, как дополнительный маркер устойчивости микробиоценоза к воздействиям факторов окружающей среды. В качестве альтернативного препарата для коррекции вагинального дисбиоза возможно использование хлоргексидина, который активен в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе облигатных анаэробов [176]. В то же время было показано, что некоторые представители рода Lactobacillus обладают сниженной чувствительностью к хлоргексидину [45, 181, 245, 309]. В настоящее время для лечения и профилактики инфекционно-воспалительной патологии женских половых органов активно используют методику обработки влагалища кавитированными НУЗ лекарственными растворами, в том числе раствором хлоргексидина [9, 10, 11, 18, 26, 27, 28, 32]. В литературе имеются данные о том, что грамотрицательные микроорганизмы более чувствительны к НУЗ, чем грамположительные [1, 224]. В экспериментах была продемонстрирована способность НУЗ сенсибилизировать бактериальные биопленки к действию антимикробных препаратов [224,228]. Данные факты позволяют предположить, что обработка влагалища кавитированным НУЗ раствором хлоргексидина может оказаться действенным инструментом в коррекции дисбиотических состояний в силу селективного подавления ассоциированных с дисбиозом влагалища грамотрицательных бактерий.
Методика обработки влагалища кавитированным НУЗ 0,05% раствором хлоргексидина (КНУЗ РХ) рекомендована для использования в акушерско гинекологической практике [9, 26, 32]. Получены убедительные доказательства клинической эффективности предложенного метода при лечении кандидозной, микоплазменной и уреаплазменной инфекции репродуктивного тракта [10, 11, 17, 19, 36], неспецифического вагинита [25], послеродовых гнойно-септических заболеваний [26], использовании с целью профилактики инфекционно-воспалительных осложнений перед внутриматочными вмешательствами [29] и хирургическим лечением пролапса гениталий [22]. Однако изменения качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища в результате воздействия КНУЗ РХ недостаточно изучены. На сегодняшний день оценка эффекта от обработки влагалища кавитированными НУЗ лекарственными растворами на вагинальную микрофлору проводилась только с помощью микроскопии или культуральных исследований [25, 29].
С целью оценки влияния обработки влагалища КНУЗ РХ на качественный и количественный состав микрофлоры влагалища были двукратно обследованы 104 беременных, планировавшие ИПБ методом вакуум-аспирации. Обработка КНУЗ РХ проводилась данным пациенткам с целью профилактики развития инфекционно-воспалительной патологии после процедуры ИПБ. Всем беременным проводили анализ микробиоценоза, а 71 пациентке дополнительно генотипировали вагинальные лактобациллы до и после процедуры. В результате было продемонстрировано, что КНУЗ РХ селективно воздействует на условно-патогенную микрофлору и практически не оказывает воздействия на качественный и количественный состав лактобацилл, что приводило к увеличению доли лактофлоры у пациенток с дисбиозом влагалища. Данные наблюдения оправдывают применение КНУЗ РХ с целью коррекции нарушений вагинальной лактофлоры.