Введение к работе
v. .''.,, . І
Актуальность проблемы. Метилотрофньте микроорганизмы, использующие метан, метанол, метилированные амины и друпіе восстановленные С і-соединения в качестве источника углерода и энергии, давно привлекают внимание отечественных и зарубежных исследователей. Повышенный интерес к метилотрофам обусловлен их важной ролью в биосферном цикле углерода и других элементов, уникальными особенностями биологии, а также реальными перспективами использования в биотехнологии и генной инженерии.
В последние два десятилетия метилотрофы изучаются особенно интенсивно. Значительный прогресс в этой области отражен в монографиях (Малашенко, Романовская, Троценко, 1978; Anthony, 1982; Large, 1983; Кондратьева, 1983; Подгорский, 1983; Гальченко, Андреев,Троценко, 1986; Сузина, Фихте, 1986; Large, Bamforth, 1988; Романовская, Столяр, Малашенко, 1991; Goldberg, Rokem, 1991) и трудах специализированных Ст-симпозиумов. Однако ко времени начала данной работы (1969 год) исследования по метилотрофии ограничивались отдельными Еидами метан- и ме-танолиспользующих бактерий, у которых группа Квейла обнаружила сериновый и гексозофосфатный пути первичной ассимиляции Сі-соединений. Промежуточный (центральный) метаболизм метилотрофов был исследован недостаточно, поскольку априорно предполагалось, что он универсален у метилотрофов и гетеротрофов. В частности, неизученными были пути азотного и фосфорного метаболизма, уровни и механизмы ассимиляции С02 у различных метилотрофов. Неясными были причины облигатной зависимости ряда метилотрофных бактерий от Сі-соединений, а также функциональная роль внутрицитоплазматических мембран у метанотрофов. Практически неизученной оставалась группа метилотрофных дрожжей. В целом к началу 70х годов представления о биологии метилотрофов, в особенности о таксономии, организации и регуляции Сі-метаболизма, были весьма фрагментарными, что ограничивало возможности их практического применения.
Принятые сокращения: АДГ - алкогольдегидрогеназа, АО - алкогольоксидаза, ВЦМ -внутрицитоплазматические мембраны, ГАФ - глицеральдегидфосфат, ГлбФ - глюко-зо-6-фосфат, ГС - глутаминсинтетаза, ГОГАТ - глутамат-2-оксоглутаратаминотранс-фераза, ГФД - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, ГФС - гексулозофосфатсинтаза, GSH - восстановленный глутатион, ДГФЦ - диссимиляционный гексулозофосфатный цикл, ДОА - диоксиацетон, ДОАС - диоксиацетонсинтаза, ДОАК - диоксиацетонки-наза, ДОАФ - диоксиацетонфосфат, ИЦЛ - изоцитратлиаза, КДФГ - 2-кето-З-дезок-си-6-фосфоглюконат, Ксу5Ф - ксилулозо-5-фосфат, МА, ДМА и ТМА - моно-, ди- и триметиламины, МАДГ - метиламиндегидрогеназа, МАО - метиламиноксидаза, МГ -N-метилглутамат, МДГ - метанолдегидрогеназа, ММО - метанмонооксигеназа, МС -малатсинтаза; ПДГ - пируватдегидрогеназа, ПФ - полифосфат, РМФ - рибулозомо-нофосфатный, Ру5Ф - рибулозо-5-фосфат, РБФ - рибулозобисфосфатный, СБФ - се-догептулозо-1,7-бисфосфат, ТА - трансальдолаза, ТК - транскетолаза, ТМАДГ -триметиламиндегидрогеназа, ТМАО - триметиламиноксигеназа, ФАДГ - формальде-гиддегидрогеназа, ФБФ - фруктозо-1,6-бисфосфат, ФГД - 6-фосфоглюконатдегидро-геназа, ФДГ - формиатдегидрогеназа, ФЕП - фосфоенолпируват, ФМС -феназин-метосульфат, Фн и ФФН - неорганический орто- и пирофосфат, ФрбФ - фруктозо-6-фосфат, ФФК - фосфофруктокиназа, ГМГ - гидроксиметилглутатион.
Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным представлялось необходимым расширить спектр культур метилотрофов, детально охарактеризованных в таксономическом и физиолого-биохимическом аспектах для понимания особенностей организации и регуляции их метаболизма, а также расширения возможностей практического применения. Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:
-
Создать представительную коллекцию чистых культур метилотрофов и определить их таксономическое положение.
-
Исследовать пути первичного и центрального метаболизма у метилотрофов разных систематических групп.
-
Изучить регуляцию первичного С і-метаболизма у метилотрофов.
-
Выяснить причины неспособности облигатных метилотрофных бактерий расти на полиуглеродных (Сп) субстратах.
-
Исследовать роль внутрицитоплазматических мембран у метанотрофов.
-
Выявить перспективные для биотехнологии штаммы метилотрофов.
Научная новизна. Создана наиболее представительная и охарактеризованная отечественная коллекция чистых культур метилотрофных бактерий и дрожжей, а также их мутантов. Упорядочена систематика облигатных и факультативных метилотрофных бактерий, предложено 20 новых таксонов. Для основных коллекционных штаммов метилотрофных бактерий и дрожжей разработаны таксономические паспорта и метаболические карты. Выявлены особенности метаболизма углерода, азота, фосфора у метилотрофов разного систематического положения. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция множественных энзиматических дефектов (блоков) в путях центрального метаболизма, объясняющая неспособность облигатных метилотрофов расти на полиуглеродных субстратах. Определены уровни фиксации С02 и активности соответствующих карбоксилаз у метилотрофов с различными путями Сі-метаболизма. Установлены общие принципы и специфика регуляции первичных путей метаболизма различных метилотрофов. Наиболее детально эти закономерности изучены на примере диссимиляционного гексулозофосфатного цикла у бактерий и диоксиацетонового цикла у дрожжей. Специфические ферменты данных путей метаболизма получены в высокоочищенном состоянии, исследованы их свойства. Выявлены закономерности формирования мембранного аппарата метанотрофов и его роль в компартментации и регуляции ферментов Сі-окисления, а также участие в энергообеспечении метанотрофов. Установлено функционирование у метилотрофных дрожжей футильного цикла окисления формальдегида - нового механизма детоксикации СН2О. В результате комплексных исследований достигнуто более полное и глубокое понимание биологии и метаболизма прокариотных и эукариотных метилотрофов.
Научно-практическое значение. Полученные результаты создали научную основу и" методологические предпосылки практической реализации метаболического потенциала метилотрофов. Установлено, что метилотрофные бактерии, имеющие разные пути Сі-метаболизма, различаются по ряду биотехнологических показателей (скорости роста, выходу биомассы, ее составу). Разработаны способы получения ряда практически важных продуктов (ферменты, полисахариды, поли-^-гидроксибутират, кароти-ноиды), биологической очистки промстоков, содержащих токсичные одно- и полиуглеродные соединения. Результаты диссертационной работы вошли в монографии, 4
учебники и обзоры, используются в лекциях по микробиологии. Штаммы метило-трофов и препараты ферментов применяются в ИБФМ РАН, МГУ, ИнМи РАН, ИМВ АН Украины, ИМВ АН Казахстана, ВНИИГенетика, ВНИИСинтезбелок, ВНИИБио-технология, а также в ряде зарубежных лабораторий.
Апробация. Основные положения диссертационной работы были доложены на всесоюзных и международных конференциях по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино, 1972, 1978, 1983), всесоюзных микробиологических съездах (Ереван, 1975; Рига, 1980; Алма-Ата,1985), всесоюзных конференциях и школах по микробиологическому использованию С і-соединений (Пущино, 1971, 1976, 1986), международных симпозиумах "Рост микроорганизмов на С і-соединениях" (Токио, 1974; Пущино, 1977; Шеффилд, 1980; Миннеаполис, 1983; Харен, 1986; Геттинген, 1989), "Микробиологическое образование и потребление газов" (Геттинген, 1975), симпозиумах соцстран по биотехнологии (Лейпциг, 1980, 1982; Братислава, 1983)., симпозиуме по хемоавтотрофии, посвященном памяти С.Н.Ви-ноградского (Геттинген, 1987), международных конференциях "Роль формальдегида в биологических системах" (Балатоііфюред, 1985; Кештели, 1987), 15-м международном дрожжевом симпозиуме (Рига, 1991), а.также на отраслевых конференциях по проблемам использования метилотрофных микроорганизмов в биотехнологии. Публикации. По материалам диссертации опубликовано более, 150 работ, 2 монографии, получено 10 авторских свидетельств.
Благодарности. В исследованиях принимали участие студенты, аспиранты, стажеры и сотрудники лаборатории, руководимой автором, а также сотрудники ряда других лабораторий. Всем участникам этой работы автор глубоко признателен за сотрудничество, их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях.