Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1. 1 Препараты, применяемые для защиты растений. Поиск патентов по культивированию и применению микроорганизмов в защите растений 12
1. 2 Условия и требования к культивированию микроорганизмов 24
1. 3 Динамика урожайности зерновых культур 28
1.4 Возбудители болезней и насекомые-вредители озимой пшеницы 30
1. 4. 1 Грибные болезни пшеницы 32
1. 4. 2 Бактериальные болезни пшеницы 39
1. 4. 3 Насекомые-вредители пшеницы 42
2. Условия, материалы, объекты и методика проведения исследований 44
3. Результаты исследований 68
3. 1 Выбор питательных сред для культивирования микроорганизмов 68
3. 2 Приёмы ускорения и оптимизация условий культивирования микроорганизмов 82
3. 3 Применение антибиотиков и их влияние на культивируемые микроорганизмы 96
3. 4 Подбор активаторов роста для целевых культивируемых микроорганизмов 103
3. 5 Обоснование формирвания комплекса микроорганизмов для системной защиты озимой пшеницы 118
3. 5. 1 Особенности применения препаратов в баковой смеси для опрыскивания посевов 125
3. 5. 2 Использование микробиологических препаратов для предпосевной обработки семян пшеницы путем протравливания 128
3. 5. 3 Использование микробиологических препаратов для обработки озимой пшеницы в период вегетации 136
3. 5. 4 Влияние микробиологических препаратов для защиты озимой пшеницы на её фотосинтетическую активность 143
3. 5. 5 Влияние вносимых микробиологических препаратов на накопление супрессивной микробиоты в почве 145
3. 6 Совместимость микробиологических препаратов с гербицидом 150
3. 7 Влияние микробиологических препаратов для защиты растений на основные хлебопекарные показатели качества зерна 152
3. 8 Характеристика и показатели разрабатываемых препаратов, методы испытания и контроль производства 154
4 Экономическая и биологическая эффективность 159
Заключение 165
Список сокращений 170
Словарь терминов 171
Список использованных источников 172
Приложения 193
- Препараты, применяемые для защиты растений. Поиск патентов по культивированию и применению микроорганизмов в защите растений
- Выбор питательных сред для культивирования микроорганизмов
- Использование микробиологических препаратов для предпосевной обработки семян пшеницы путем протравливания
- Характеристика и показатели разрабатываемых препаратов, методы испытания и контроль производства
Препараты, применяемые для защиты растений. Поиск патентов по культивированию и применению микроорганизмов в защите растений
Как показывают данные, представленные в литературе, применение химических средств защиты является неотъемлемой частью современных агротехнологий. Так, ежегодно рынок химических препаратов и средств защиты растений пополнятся новыми названиями, например, фунгицид «Зантара» (http://www.agroxxi.ru/gazeta-zaschita-rastenii/novosti/novye-shagi-v-zaschite-agrokultur.html), из ранее известных фунгицидов применяются «ТМТД-плюс», «Бензазол», «Карбезим» и ряд других. Инсектициды представлены широким ассортиментом в т. ч. «Агент», «Айвенго», «Би-58 Новый», «Имидор» и т.д. Процент разрешённых химических препаратов для защиты растений в 2008 году составлял 16,1%, а в 2013 – 24,8% от общего числа всех средств защиты, но приоритеты уже отдаются интегрированной защите с включением в неё микробиологических средств защиты (Чулкина, 2006; Лаптиев, 2013).
Тема культивирования микроорганизмов на отрубях впервые открыта И. Такамине в 1894, и относится к поверхностному способу их выращивания. Вопросы культивирования микроорганизмов на малотоннажных предприятиях были затронуты в 70-80 годы прошлого века при поддержке Министерства сельского хозяйства РФ. Выращиванием микроорганизмов в жидких средах с использованием кукурузной муки вместо кукурузного экстракта для Bacillus subtilis, а также культивированием Trichoderma, ассоциативных азотфиксаторов на малотоннажном производстве НПА «Биота» занималась Боровая В.П. (2002). Начиная с 60-х годов прошлого столетия, сотрудники ВИЗР (Санкт – Петербург) ведут работы в этом направлении. В настоящее время В. А. Павлюшин, И. И. Новикова (ВИЗР) выделяют и депонируют новые штаммы микроорганизмов для микробиологических препаратов для защиты растений. Сотрудниками РГАУ МСХА им. К. А. Тимирязева разработан и испытан биологический препарат «Биоплант-К», применяемый для биологической защиты картофеля от ризоктониоза, зерновых и овощных культур от корневых гнилей. «Биоплант-К» способствует повышению устойчивости растений к стрессовым факторам и обеспечивает стабилизацию их минерального питания. В целом вопросами применения микроорганизмов в защите растений занимались Е. В. Талалаев, П.Н. Фатина (2007), Г. Ахмеджанов (2015), И.А. Тихонович, А.П. Кожемяков, В.К. Чеботарь, Ю.В. Круглов, Н.В. Кандыбин, Г.Ю. Лаптев (2009).
В 2015 году в ФГБУ «Россельхозцентр» производством биопестицидов было занято 30 филиалов, а энтомофагов – 4 филиала. В настоящее время налажено производство биофунгицидов: «Ризоплан», «Псевдобактерин-2», «Флавобактерин» и др., биоинсектицида «Метаризин», а также энтомофагов: трихограммы, златоглазки, габробракона и др. (http://rosselhoscenter.com).
Рынок биологических средств защиты представлен препаратами Российского производства. На их долю приходится 99,4% от общего объема. Из них инсектицидные препараты составляют – 6,5%, а фунгицидные – 84,5 (Лапина, 2014). Отсутствие импорта биопрепаратов объясняется ограничением сроков хранения, проблемами транспортировки, более высокой ценой в сравнении с отечественными препаратами. Поэтому промышленное производство и применение отечественных микробиологических средств защиты растений на территории России в последние годы XX века и начале ХХI века постепенно начинает возрастать (Кандыбин, 2009). Это связано и с увеличением интереса потребителей продукции растениеводства к вопросам экологизации и биологизации сельского хозяйства. Однако применение таких препаратов ограничивается недостаточной информированностью о пользе применяемых препаратов, низкой платежеспособностью хозяйств – потенциальных пользователей, и на территории Краснодарского края не превышает 5% от всех посевных площадей (Сокирко, 1994; http://rosselhoscenter.com). Число препаратов, применяемых на территории нашей страны, определяется перечнем препаратов, разрешённых к применению на территории Российской Федерации” (утверждаемых ежегодно) представленных в «Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов» и Федеральным законом от 19 июля 1997 г. N 109-ФЗ «О безопасном обращении с пестицидами и агрохимикатами».
При всём многообразии культур, представленных в Государственной коллекции микроорганизмов, число зарегистрированных препаратов на их основе и представленных в каталогах в 2014-2017 гг, составило 15-18 наименований родов. При этом препараты, на которые в 2014-2016 гг закончился срок регистрации, например, «Планриз» (Pseudomonas fluorescens), «Бактофосфин» (Bacillus mucilaginosus, Промышленные инновации, АО) практически не восполнились новыми регистрируемыми в каталоге препаратами 2017 г. Число микроорганизмов, применяемых в препаратах в Америке, представлено 70 родами.
Биологические препараты, относящиеся к группе пестицидов, в 2015-2018гг представлены в каталогах препаратами на основе различных штаммов (Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2015; 2016; 2017; 2018):
- бактерий Bacillus subtilis: Алирин-Б (ВИЗР), Бактофит («Август», ООО), Витаплан (ВИЗР), Гамаир (ВИЗР), БисолбиСан («Бисолби Интер», ООО) Фитоспорин М (НВП «Башинком», ООО);
- бактерий Pseudomonas aureofaciens: Псевдобактерин (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН), Елена (Институт биологии УНЦ РАН, ГУП "Опытный завод АН РБ");
- бактерий Pseudomonas fluorescens: Бинорам («АЛСИКО-АГРОПРОМ», ООО; «АГРОИМПЭКС», ООО), Ризоплан («Биопестициды», ООО);
- грибов Trichoderma harzianum: Глиокладин («Агробиотехнологи», ЗАО), Трихоцин (Управляющая компания «АБТ-групп», ООО), Стернифаг (УК «АБТ групп, ООО», ЗАО «Агробиотехнология», ЗАО).
Биологические препараты, относящиеся к группе инсектицидов и акарицидов, представлены препаратом «Метаризин» («Инвиво», ООО) на основе энтомопатогенного гриба Metarrhizium anisopliae Р-72.
Среди удобрений культуры микроорганизмов представлены теми же видами бактерий, что и среди пестицидов, включая Bacillus subtilis, грибы рода Trichoderma («Геостим», ООО «Биотехагро»), бактерии рода Agrobacterium («Ризоагрин», ООО «Биофабрика»), бактерии Bradyrhizobium japonicum («Нитрагин», «Инвиво», ООО), Azotobacter chroococcum («Азотовит», Промышленные инновации, АО), (Bacillus mucilaginosus («Фосфатовит», Промышленные инновации, АО) и др.
Кроме того, в каталоге представлен регулятор роста «Эмистим» (ИП Янина Маргарита Михайловна) на основе продуктов метаболизма симбионтного гриба-микромицета Acremonium lichenicola. В целом, в зависимости от используемого состояния микроорганизмов для всех биопрепаратов, микробиологических удобрений и регуляторов роста микроорганизмы можно разделить на 3 группы:
1. Жизнеспособные клетки микроорганизмов (сухие, жидкие, концентрированные, пастообразные).
2. Инактивированные микроорганизмы и продукты их переработки (высушенный грибной мицелий).
3. Очищенные продукты жизнедеятельности микрорганизмов (БАВ, витамины, антибиотики).
В научной литературе и при изучении патентов можно определить 2 основных направления в использовании микробиологических СЗ. Одно – работа с готовыми формами и препаратами, приобретаемыми в торговой сети, и второе – культивирование в т.ч. на базе хозяйств, ведущих деятельность в сфере растениеводства. Применение готовых микробиологических препаратов – просто, т.к. жидкие препаративные формы используются сразу. Сухие или пастообразные - после разведения в воде. Жидкие препараты содержат спорово-мицелиальную массу, клетки в вегетативной форме, продукты метаболизма микроорганизмов. Но следует учитывать, что при использовании жидких препаратов не рекомендуется их длительное хранение. Это связано с тем, что микробиота в них уже находятся в вегетативном состоянии, а жидкая среда, в которой они питаются и размножаются - истощается, её пополнения питательными компонентами не происходит, начинается процесс снижения числа жизнеспособных микроорганизмов.
Выбор питательных сред для культивирования микроорганизмов
Клетки микроорганизмов содержат (в % по сухой массе): углерода – 50, азота – 14, фосфора – 3. Остальные 33 % приходятся на прочие элементы (Нетрусов, 2007). Микроорганизмы нуждаются питательных веществах. Для биосинтеза клеточных компонентов микроорганизмов обязательным является поступление в клетку питательных веществ: углеводов, белков, жиров в доступной для них форме. Источники углерода должны иметь (частично окисленные) группы –СНОН; -СН2ОН; -СОН. Одни микроорганизмы способны вырабатывать ферменты, которые расщепляют и гидролизуют сложные полисахаридные или белковые соединения. Для других микроорганизмов необходимо, чтобы в питательной среде присутствовали готовые макроэлементы источники углерода, азота, фосфора, серы (Гусев, 1985; Асонов, 1989). И для одних, и для других микроорганизмов потребность в таких веществах (макроэлементах) определяется в г/л. К макроэлементам также относят магний, кальций, калий, железо, натрий. В клетках они находятся в виде ионов. Они необходимы для активности ферментов, устойчивости эндоспор к нагреванию, стабилизации рибосом, входят в состав цитохромов и т.д. Кроме того, необходимо обеспечить поступление микроэлементов (мг/л) и витаминов для формирования простетической группы ферментативной системы микроорганизмов. Это ионы хрома, молибдена, марганца никеля, селена, цинка, кобальта. Дополнительные потребности микроорганизмов в факторах роста приводят к тому, что микроорганизмы-прототрофы нуждаются в присутствии таких веществ в питательной среде. Так, многие микроорганизмы, нуждаются в пиридоксине (витамине В6), который в сочетании с фосфорной кислотой необходим для образования декарбоксилаз и трансаминаз, задействованных в азотистом обмене. Цианокобаламин (витамин В12) является фактором роста для большинства молочнокислых бактерий. Большую часть потребности микроорганизмов в витаминах группы В при выращивании микроорганизмов восполняют за счёт использования дрожжевого экстракта (Лабинская, 2004). В отличие от факторов роста, активаторы роста не являются обязательными в питании микроорганизмов. Рост и развитие МО возможны и без присутствия активаторов в питательной среде, но присутствие активаторов ускоряет процесс их развития или увеличивает количество микробных клеток в «культуральной жидкости».
В качестве источников углерода микроорганизмы используют ди- и моносахариды, многоатомные спирты, например, манит для культивирования A. chroococcum. Так, в классической микробиологии для культивирования A. chroococcum рекомендуют жидкую среду Бейеринка следующего состава (г/л водопроводной воды): глюкоза или манит – 20,0; К2НРО4 - 0,2; СаСО3 – 5,0; смесь микроэлементов по Федорову – 1 мл; MgSO4 7 водный – 0,2. Или агаризованную среду Эшби (г/л водопроводной воды): манит – 20,0; К2НРО4 - 0,2; СаСО3 – 5,0; MgSO4 7 водный – 0,2; NaCl – 0,2; K2SO4 – 0,1; смесь микроэлементов по Фёдорову – 1 мл; агар – 20,0. Обе среды содержат смесь микроэлементов по Фёдорову, включающую основную соль для работы ферментативного комплекса A. chroococcum – молибдат аммония (NH4)2MoO4 (Теппер, 2004).
Некоторые микроорганизмы, в т.ч. Рs. fluorescens нуждаются доступной для потребления форме липида – глицерине, поэтому они хорошо растут на среде Кинга Б (г/л): пептон – 20,0; K2НРO4 – 1,5; MgSO4 7Н20 – 1,5; глицерин – 10,0; агар – 15,0-20,0 (Лабинская, 2004). Спорообразующие бактерии B. megaterium отщепляют фосфорную кислоту, которая создает расщепление мела CaCO3, что в свою очередь образует зону просветления вокруг колоний B. megaterium. Эти бактерии хорошо растут на ГРМ-бульоне, среде №1, ГРМ-агар, мясо-пептонном агаре, среде Менкиной, содержащей нуклеиновую кислоту, на основе ГРМ- или МПБ-бульона. (г/л МПБ): нуклеиновая кислота (лецитин) – 5,0; CaCO3 – 20,0; агар – 30,0 (Теппер, 2004).
Бактерии B. subtilis обладают протеолитической, амилолитической пектолитической активностью, расщепляют полисахариды в виде крахмала, вызывают гниение белка. В классической микробиологии они растут на ГРМ-бульоне, крахмалсодержащих средах, а также среде №1, ГРМ-агаре, МПА (Лабинская, 2004).
Как видно, в качестве источника азота многие микроорганизмы используют белки (пептон). Как источник белка, пептон входит в состав практически всех синтетических сред для бактерий и грибов, аминокислоты, пептиды, а микроскопические грибы используют нитраты. При этом важно, чтобы азот, содержащийся в нитратах, был восстановлен до аммиака. Поэтому T. viride, B. bassiana, M. anisopliae хорошо растут: на бульонах и агаризованных средах Чапека (г/л воды: сахароза – 30,0; NaNO3 – 2,0; К2НРО4 – 1,0; MgSO4 - 0,50; KCl – 0,50; FeSO4 – 0,01); агаре – 15,0 (Лабинская, 2004) или бульоне и/ или среде Сабуро (г/л воды: глюкоза – 40,0, пептон – 10,0, агар – 12-15) (ГОСТ 10444.12-2013).
В нашей стране на крупных производствах для приготовления питательных сред часто используют отходы свеклосахарного производства, например, мелассу, содержащую до 60% углеводов, до 9% азотистых соединений и являющуюся источником кальция, а также патоку, содержащую редуцирующие сахара – глюкозу и фруктозу. В Узбекистане, например, хлопковый шрот, отходы помола зерновых культур (Муродова, 2014). Также распространённым и доступным сырьём при приготовлении питательной среды являются некондиционное зерно, пшеничные и кукурузные отруби.
Подготовка к процессу культивирования и сам процесс представляют собой ряд последовательно выполняемых операций и стадий:
-подготовка оборудования, инвентаря (мойка, дезинфекция); -подготовка сырья и культур микроорганизма к пуску в производство; -приготовление питательной или культуральной среды (смешивание компонентов, стерилизация;
- внесение культур микроорганизмов в / на среду;
- разводочный цикл;
- производственный цикл (культивирование или ферментация);
-выделение (разделение при необходимости культуральной жидкости на метаболиты и биомассу);
-очистка продуктов синтеза, ферментации микроорганизмов.
Типовая схема приготовления питательной среды и культивирования микроорганизмов предусматривает разводочный (лабораторный) и производственный цикл. В отдельных случаях выращивание микроорганизмов исключает разводочный цикл. За основу в диссертационной работе использована типовая схема, представленная на рисунке 15.
В дальнейшем работа проводилась, учитывая особенности малотоннажного производства, т. к. появившийся иетерес к биозащите у предприятий в сфере растениеводства диктует необходимость самостоятельного культивирования микроорганизмов в требуемых объемах. Необходимо учитывать, что такое производство располагается вблизи мест использования препаратов. Это исключает потерю времени на логистику и уменьшает риск потери жизнеспособности микроорганизмов в этом процессе, снижает стоимость транспортных расходов, но организационно-производственные работы при этом сезонны и привязаны к агротехническим мероприятиям (протравливание семенного материала, опрыскивание посевов в период их вегетации и послеуборочная обработка растительных остатков), поэтому схема культивтрования микроорганизмов предпочтительна периодического типа.
Малотоннажное производство, как правило, лишено воды, поступающей из источника, централизованного водоснабжения, поэтому используется вода из скважин для децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, которая по своим санитарно-эпидемиологическим показателям должна соответствовать требованиям СанПиН 2.1.4.544-96: «Требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения». При этом бактериальное загрязнение бактериями группы кишечной палочки БГКП (коли-индекс) в 1000 мл воды не должно превышать 10 КОЕ. Но, по нашему мнению, в СанПиН не учтены другие посторонние микроорганизмы, составляющие показатель «общее микробное число» (ОМЧ), например, бактерии Pseudomonas aeruginosa, которые могут влиять на чистоту получаемого микробиологического препарата.
Использование микробиологических препаратов для предпосевной обработки семян пшеницы путем протравливания
Исследование по определению эффективности протравливания разабатывемыми препаратами озимой пшеницы, как отдельно, так и в виде композиций проводилось на примере озимой пшеницы «Княгиня Ольга» и «Фортуна». «Культуральные жидкости», полученные путём ферментирования МО на среде из сахарозы и отрубей с добавлением активаторов роста - аминокислот, были применены для предпосевной обработки семенного материала в количестве 1 литр препарата с титром не менее 1х107 КОЕ/мл на 1 тонну семян. Для получения сравнительной оценки образцы пшеницы были протравлены фунгицидом «Раксил Ультра» (Bayer CropScience) и ростостимулирующими препаратами «Лариксин» (Биотехнологии, ООО) (Биологический регулятор роста и развития растений, индуктор иммунитета к грибковым заболеваниям) и «Мигим» ("Подворье "АЛЬБИН", ООО) (Комплекс гуматов, макро- и микроэлементов). Микробиологический комплекс «Мигим» улучшает условия роста и развития обрабатываемых культур, защищает их от болезней, способствует сохранению и повышению плодородия почв. Результаты представлены в таблице 20.
Контрольный образец имел 50% невсхожих семян, представленных материалом с отсутствием зародышевых корешков, почерневшим зародышем, что можно объяснить развитием фузариоза, гельминтоспориоза, альтернариоза, а также бактериозов (рис. 40), подтвердившихся при микроскопическом исследовании. Эндосперм большинства контрольных образцов был мягкий, разложившийся. Это свидетельствует о возможной мацерации тканей, размягчении стенок клеток и разъединении клеток, нарушении обмена веществ. Прорастание семян в контрольном варианте без обработки было отмечено через 48 часов, а в вариантах с обработкой семян «культуральными жидкостями» на основе ДВ микроорганизмов и фунгицидом «Раксил Ультра», препаратами «Лариксин» и «Мигим» – через 24 часа с момента начала опыта.
Обработанные микробиологическими препаратами и химическим фунгицидом семена пшеницы (рис. 41), в течение одних-двух суток с момента начала исследования прорастали 2-3 зародышевыми корешками размером более длины семени, и имели росток размером так же более половины длины самого семени, а эти показатели формируют «нормально взошедшие» семена, дающие наличие и корней, и ростков, достигающее значения 70-100%, против этого показателя в образце, протравленном фунгицидом «Раксил Ультра» 60% , что на 10% ниже. При этом доля невсхожих семян в образцах, обработанных микробиологическими препаратами была ниже, чем в контрольном варианте, и варьировала от 0 до 25%, а в образце, протравленном фунгицидом «Раксил Ультра» – 30 %, в сравнении с контрольным вариантом, где показатель «невсхожие семена» достигал значения 50%. Причём в образцах, обработанных микробиологическими препаратами, эти варианты представлены семенами, набухшими, но не раздавливающимися к концу исследования. Использование для предпосевной обработки семян пшеницы препаратов на основе КЖ микроорганизмов с титром не менее 1х107 КОЕ/мл (T. viride -1х106), снижает заболеваемость бактериальными и грибными болезнями на 5% и более. Протравливание химическим фунгицидом полностью исключало развитие грибов рода Fusarium, но не влияло на бактериозы. Протравливание «Лариксин» и «Мигим» стимулировало всхожесть до 95 %, что даже выше показателя «общая всхожесть» в сравнении с КЖ A.chroococcum VKM B-1616 и Рs. fluorescens AP33 на 15 и 10%, но совсем не оказывало подавляющего действия на фитопатогенные грибы, а в отношении Fusarium, даже стимулировало их рост.
Предпосевная обработка бактериальными микробиологическими препаратами, кроме увеличения показателя «всхожие семена» положительно влияет на длину корня и проростков, способствуя их увеличению. Но обработка семян путем протравливания, полученной «культуральной жидкостью» на основе ДВ гриба T. viride T-889), существенного влияния на биометрические показатели не оказало, а в отдельных вариантах даже снизило их (предел варьирования длины корня 14 см против максимума в отдельных вариантах на контроле 15 см). В связи с чем образцы семян были обработаны препаратом на основе T. viride T-889 с более низким титром 1х104 КОЕ/мл, что в меньшей степени оказывало фунгицидное влияние на фитопатогенные грибы, и средний % фузариозов в образцах повысился на 5% (в сравнении с образцом, протравленным T. viride T-889 титр 1х106 КОЕ/мл (10 % против 5%)).
Также следует отметить, что при определении всхожести семян пшеницы, протравленных Рs. fluorescens AP-33, выращенными на среде с добавлением 0,1% нитрата калия, прорастание семян озимой пшеницы было на первые сутки, в то время как в варианте, протравленном КЖ Рs. fluorescens AP-33 без использования этой соли, взошли на вторые сутки. При этом в первом случае всхожесть семян (на первые сутки) - 80%, а во втором (на вторые сутки) - 50%.
В таблице 21 приведены биометрические данные образцов пшеницы, протравленных «культуральными жидкостями» микроорганизмов, а также фунгицидом системного действия «Раксил Ультра», препаратами «Лариксин» и «Мигим».
Очевидно, что снижение поражения растений пшеницы бактериозами и грибными инфекциями после предпосевной обработки семян A. сhroococcum, B. megaterium и B. subtilis, Т. viride происходит за счёт действия антибиотических веществ, выделяемых МО в «культуральную жидкость», которая применяется для этого агроприёма. Кроме того, биологически активные вещества, попадая на/в семена пшеницы стимулируют рост растений (Асонов, 1989, Полевой, 1982; Штерншис, 2004). Так, в среднем, в вариантах с протравливанием семян биопрепаратами максимальное увеличение длины корней достигло 13 -13,5 см, а ростков - 10 см в сравнении с контрольным вариантом, где длина корней была 11,57 см, а ростков - 6,8 см. Увеличение средних значений биометрических показателей в эталонных образцах (протравленных фунгицидом «Раксил Ультра», «Лариксин», «Мигим») превышает это значение в сравнении с контрольными, но в целом предел их варьирования не превышает варьирования биометрических показателей образцов, потравленных препаратами на основе ДВ микроорганизмов. Эффективными для протравливания оказались различные комбинации микроорганизмов, снижающие проявление фузариозных, альтернариозных корневых гнилей до 5-10%, а гельминтоспориозных возбудителей – на 4,5% в сравнении с контролем, и увеличивающие биометрические показатели. Поэтому для предпосевной обработки семян нами рекомендованы следующие составы (по 1 л каждой культуры в пересчете на 1 тонну семян) с титром не менее 1х107 КОЕ/мл (T. viride -1х106) B. subtilis ИПМ-215 + B. megaterium 319; B. subtilis ИПМ-215 + B. megaterium 319+ A. chroococcum; A. chroococcum + T. viride T-889; T. viride T-889.
На основании полученных экспериментальных данных о чувствительности (взаимовлиянии) микроорганизмов (таблица 17), для протравливания семян нами рекомендованы следующие смеси «культуральных жидкостей»: B. subtilis ИПМ-215 + B. megaterium; B. subtilis ИПМ-215 + B. megaterium 319 + A. chroococcum VKM B-1616; A. chroococcum VKM B-1616 + T. viride T-889; T. viride T-889. Применять для протравливания смесь T. viride T-889 с B. subtilis ИПМ-215 и/или B. megaterium не рекомендуется, т. к. эти бактерии находятся в антагонистических отношениях с грибом. На рисунке 42 представлены результаты протравливания озимой пшеницы «Княгиня Ольга» фунгицидом «Раксил Ультра», а также смесью B. subtilis ИПМ-215 + B. megaterium 319 с нормой расхода по 1 л /1 т семян.
Характеристика и показатели разрабатываемых препаратов, методы испытания и контроль производства
При производстве препаратов необходимо обеспечить выполнение входного контроля сырья и контроль качества получаемых культуральных жидкостей путем определения титра целевых культур и посторонних микроорганизмов, контроля рН культуральных жидкостей и содержания редуцирующих сахаров, как индикатора завершенности прцесса.
Для обеззараживания различных объектов допускается применение дезинфекции и стерилизации. Эти мероприятия предполагают физические или/и химические методы воздействия на объекты обработки. Физические методы облучение, микроволновое излучение, термическая обработка. Химические – сильные окисляющие агенты (озон, хлор, 3% раствор перекиси водорода) (Сидоренко, 2005), озонирование (Нормов, 2013, 2014), применение антисептических веществ. Как установлено в ходе работы, из представленных методов, физические методы наиболее предпочтительны. Из них применяют: стерилизацию водяным паром под давлением, сухим жаром, электромагнитным излучением, механическая стерилизация фильтрованием, кипячение, прокаливание, ультразвуковое облучение ультрафиолетом (Лабинская, 2004; Сидоренко, 2005; Гусев, 2008). Для провеения мойки, стерилизации и поддержания санитарных условий в помещениях цехов применяют парогенераторы. Для мойки производственного оборудования и инвентаря рекомендован 4% раствор кальцинированной соды. Для обеззараживания и дезинфекции стен, пола, рабочих поверхностей в производственном помещении рекомендована обработка дезинфицирующими растворами, например, 015% раствор Клорсепт-25 (Инструкция 25/08 Самарово», ООО) способом протирания или орошения. Перед началом и после процесса культивирования и мойки выполняется обработка поменщения цеха с применением бактерицидных облучателей, например, ОБН различных модификаций, в зависимости от объемов помещений цеха. Ферментеры обрабатываются паром, затем проводится демонтаж разъемных частей и трубопроводов. После чего проводится мойка и повторная обработка паром. Для предотвращения инфицирования производства (по причине отсутствия лабораторного разводочного цикла, и использования препаратов сухих культур) исключается воспроизводство. Обработка ультрафиолетовым облучением осуществляется с помощью любого источника ультрафиолетовых лучей, например, бактериицидных ламп (Р. 3.5.1904-04). Их применяют для обеззараживания воздуха и помещений, оборудования, инвентаря, воды (Лабинская, 2004, Теппер, 2004). Бактерицидное облучение помещения с использованием ультрафиолетовых ламп проводят перед началом культивирования микроорганизмов и после его окончания (СП 1.3.2322-08).
Контроль эффективности работы бактерицидных ламп по ГОСТ Р 54354 (п. 6.4.4).
Контроль качества мойки и дезинфекции оборудования, помещения путем анализа взятых смывов с площади 10х10 см2.
Методы испытания:
Отбор образцов по ГОСТ 3885-73;
Определение рН по ГОСТ ГОСТ 13685-84;
Определение азотфиксирующей способности по методу Кьельдаля, аналогично методу, описанному в ГОСТ Р 53951-2010;
Определение содержания редуцирующих сахаров по методу Бертрана по ГОСТ Р 54667-2011 (п. 7).
Согласно данных, представленных в работе, разрабатываемые препараты по физико-химическим, микробиологическим и органолептическим показателям должны соответствовать показателям (таблица 30). Определение содержания целевых микроорганизмов, подсчет числа КОЕ/мл, аналогично методам, описанным в ГОСТ 10444.12-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов» и ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов». Для подсчета микроорганизмов допускается применение питательных сред ГРМ-агар, Среда № 2(Сабуро). Для идентификации и подсчета микроорганизмов рекомендовано применять селективные питательные среды (№1, Эшби, Менкиной, Кинг Б, среда с нуклеиновой кислотой (HY-MEDIA), Сабуро, Чапека, а также тесты: крахмальный, температурный и т. д. При необходимости дальнейшая иддентификация с использованием каталогов, классификаторов и разрабатывемых ТУ.
Т. к. грибы рода Trichoderma относятся к микроорганизмам IV класса опасности (СП 1.3.2322-08), деятельность, связанная с их культивированием, требует получения лицензии для работы с МО IV класса опасности и/или патогенности в органах Санитарно-эпидемиологического надзора.
К работе допускаются лица старше 18 лет, прошедшие обучение, ознакомленные с правилами техники безопасности и обеспеченные средствами индивидуальной защиты Область применения, назначение прпаратов.
Применяются в качестве средства для защиты озимой пшеницы в виде предпосевной (в качестве протравителя) обработки семян, обработки в период вегетации и для разложения послеуборочных растительных остатков. Рекомендуемый регламент применения представлен в таблице 31.