Оптимизация условий культивирования Melissococcus pluton в лабораторных условиях и разработка реакции коагглютинации для его индикации Чернышова, Лариса Владимировна

Введение к работе

Актуальность темы. Среди инфекционных заболеваний медоносных пчел по распространению и наносимому экономическому ущербу европейский гнилец занимает одно из первых мест. Пги-лец обнаруживают на всех континентах в местностях, где развито пчеловодство.

Европейский гнилец - сборное понятие, охватывающее группу болезней расплода, которые при некотором сходстве внешних признаков имеют различную этнологию. По данным L.Bailey (1957, 1969, 1984), E.W.Herbert, H.shiraanuki (1964), основным причинным' агентом заболевания является Иеііазососсиз pluton (G.F.White), роль других микроорганизмов, обнаруживаемых при данной болезни, отрицается. В отечественной литературе в качестве возбудителей европейского гнильца рассматривают и.pluton, Bec.alvei, Ent.faeoalia (В.И.Полтев, 1964; А.М.Смирнов, IS84 и др.). Французские, немецкие исследователи (A.Borchert, 1974; W.Fritzsch, И.Вгеюег, 1975; A.Brizard, J.Albiaefcti, 1977) И некоторые отечественные авторы (О.Ф.Гробов, Л.Н.Гузєва, 1992) считают, что существуют три самостоятельных заболевания: европейский гнилец, вызываемый M.plutoa, доброкачественный гнилец (возбудители Bac.alvei, Bao.laterosporush кислый гнилец (возбудитель Ent.faecalis). Несмотря на различит ">тих взглядов, роль м.pluton, как причинного агента поражения личинок в настоящем считается признанной.

1Л.pluton открыт в 1908 году G.F.white. Описан им в 1912 году под названием Bacillus pluton. В 1957 году микроорганизм был охарактеризован на основании морфологических особенностей как Streptococcus pluton (L.Bailey, 1957). В последние годы ои рекласси.м'цирован как типовой вид нового рода

Helissococcus по нуклеиновой кислоте, содержащей в клетке 29-30$ молекул гуанин-шатозин против характерного для рода Streptococcus 35-44$ (L.Bailey, U.Collins, 1982).

Идентификация u.pluton на основе бактериологического исследования ослоїшяотся трудностью выделения бактерии из патологического материала из-за частого присутствия других микроорганизмов, угнетающих размнокешіе искомого возбудителя. Некоторые авторы считают, что из личинок последней стадии разложения ii.plufcon невозмо^чо высеять. Для выделения данного микроорганизма требуются специальные среды и условия культивирования. Значительные осложнения в изоляции бактерии и ее идентификации, обусловлены также морфологической вариабельностью H.pluton. В лабораторных условиях на искусственных питатель- . пых средах поддерживать u.pluton удается непродолжительное время.

В последние года в нашей стране получили широкое применение серологические методы исследования некоторых заболеваний медоносных пчел. К сожалонию, диагностика европейского гнильца путем серологической идентификации отсутствует, нет данных по идентичности штаммов u.plutoa. В связи с этим весьма актуальна разработка простых, высокочувствительных, специфичных, экс-прессшх методов диагностики возбудителя европейского гнильца.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования является разработка специфичного, чувствительного и экономичного экспресс-метода индикации возбудителя европейского гнильца пчел. В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:

I. Выделить культуры li.pluton из патологического материала из различных регионов страны.

1. Изучи тт. морфологические, культуралы-ше и биохимические особенности выделенных штаммов u.plutoa.

2. Разработать оптимальные условия для роста u.plutoa с целью максимального накопления бактериальной массы.

3. Полугать пшериммунную сыворотку на u.pluton, отработать условия приготовления днагностикума и проведения реакции коагглютинации (РКОА).

4. Провести сравнительные испытания соролопічесіаїх методов'индикации U.pluton в пробирочной и капельной реакции агглютинации (РА) и РКОА.

Научная новизна. Отмечены штаммовые различил iJ.pluton, выделетшых из различных реглонов России и ближнего Зарубежья, а также показаїш некоторые биологические особенности возбудителя европейского гнильца пчел, отношение u.pluton к различным питательным средаїл. Определена скорость размножения данного микроорганизма в организме личинок при окспериментальлом заражении.

Практическая ценность. Па результатам проведенной работы разработаны: "Лабораторный регламент изготовления днагностикума для цитирования культур возбудителя европейского гнильца медоносных пчел", рассмотренный и одобренный Методической ко-шссие.1 БПЭВ (10.11.92 г., протокол № 10), Ученым Советом БПЭВ (10.11.92 г., протокол ti 16), и метод индикации u.pluton , с помощью-РКОА; предложен способ длительного поддержания U.pluton в лабораторных условиях.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции "Экологические проблемы глвотноводотва" (Троицк,

1992. г.), моклабораторном совещашщ сотрудников БПЭВ (20 июня

1993. г.).

Пуолнпашиї.

По ьатириалам диссертации опубликовано 2 статьи.

Обі.еі-і _н_ струіст.у].а диссертации.

Диссертация изложена на іУ? страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, соОстеєшшх исследований, ьюшчаыцих разделы "Материалы и методы", "Результаті; исследовании'', обсуждение, выводы, практические предложения, описка литературы, содержащего отечественных и tf^¹ заруоешнх источшілоь.

г. матёршш и ыкголи

Исследования проводили в период с 1689 по Го92 гг. в лаборатории профилактики полезней л экологической охрани пчел, на карантинной насеке Ы1ЭВ, а также в неблагополучних хозяйствах, где оші зафиксировал европейский пшлец медоносных пчел.

За указанный период в опытах по заражению находилось 8 кроликоь, около 500 личинок пчел. Длл выделения u.pluton была исследована 51 проба пораженных личинок, полученных из различных регионов страны (Московская, Калининская, Калужская, Амурская области, Краснодарский край) и Казахстана.

В работе мслолъзоьали эпизоотические штаммы U.pluton й 531, "3", "К", "Л", выделенные из патологичееко.го,материала, присланною из Московской, Калужской, Амурской областей и-Казахстана; bBo.elvei типовой штам;.: В - 502 - АТСС 6314, штаммы 333, 332; beo.lefceroaporua штс: v.m 424, 499, а также Kutei-ococDua foecalis штаммы 180, 52, 324 из музея микроорганизмов лаборатории профилактики болезней и экологической охраны пчел В11ЭВ.

Выделение M.pluton и изучение морфологических и культу-

ральїю-рпохінічческих свойств исследуемо» группы микроорганизмов производил! согласно иртошлєокші рекомгщданшім по nadopa-торпой диагностике американского гнильна, еоропрїіокого гичльна, парагнильца, септпнемнп ч сальчонпллеза птегс (А.П.О.'ирнон и др., І9Ви), а таклє другінпі ооЪепрчннтнпи мот^памч в пастерчо-лоттш О.І.О.Бчргер. 1981). Битіопую принавлечнорть иіпелчнішх культур шкрооргашіз'/ов устанавливали ч<- онрапочитялгсм (. ІІолт'Т), T0G4; Бєрдяо, 1986), в сравнении о ііг:рчі;п'"чся пшовн-ми культурами.

Для ііррвичнпі'п Г'і'п^ллртіня. культивирования ті накопления бактериальной паг'он K.pluton испьпивялті ряалн^тчш>-; нптательнче средн. как трерлие, так и к-ілпіа: отяндартная oper' Брили, а такие соотаплринь'га по материалам работ Боліли н Коллинза (урала J' Т о пептоном, среда '.' 2 г пептоном v пигтрино" в вине чрпто-но-шістричорого. атара (ІГИА) п їїчлкпіі прпт'.'Нє-hbotphhotou рро-дн). Б исследованиях таклє нппольгюва.'гн срелн, нропназнанотінча для культивирования культур тканей ^ клеток, миканла?'" (?.І'.!-с, 'І'Г..І-c, о^огадеинни. ТБК сыворотки лошади. Т'М. г.ррпя .''? ЇЮ, 0,3* агар из перевара бнчьего серпня, обога'цсичн!і 2(]~'> сиворотки лошади).

Ллл опрепеиення накопление возОучтел" в ^m"tp личинок іртрл ' гчявлєігпя сохранности паторрнннх сгоіі'Л'з M.pinfcon ит. 534 в хода лдптельного лабораторного ку.тьтнрпрорлння и nancavcipopamm. на 7 иасса~е длиной кутьтурн пропел" іара"^,.^ґ>ччз ллчинок медоносних гппл 3-4-пнгного возраста, тсу>гт,тнвчрурмад в условиях лаборатории на чайках Натри ча ср«міл Чнхазлл-Лс'га-мгвича (водопровоїчіпя в^яа. натура.'Р-нгп мпд, -н-'отглкт или чпстчс покяредпе лрстзі в соот^,"^і'і!оч!ш 1,5:?,,'і: [).

Зярялпние ОСущеоТЕЛПЛГ! СІІРІПІПДЬННМ 'ПЧ'.РОИЧЬ'ЛСТОрО.'Л. '_t^Ta

головноіі конец личинок опытных групп наносили бактериосодержа-щий материал в концентрации 10 млн.бак.кл/мл в дозах 0,03 и 0,025 мкл. 'Личинок контрольных групп содержали в отдельных чашках Петри на чистой питательной среде, на ротовой конец наносили физиологический растЕор в таком ке'объеме. Осмотр личинок проводили через каждиз 24 часа. Повторность опытов трехкратная. Длительность опыта 6 суток. Полученные данные были подвергнутн статистической обработке по общепринятым методикам (Ю.К.Баюн, 1989).

Для изготовления гипериммунных сывороток при иммунизации кроликов в качестве антигенов использовал) штаммы микроорганизмов: M.pluton шт. 534; Eecelvei шт. 332, Bac.laterospo-rua шт. 424, 499; Eaterococcus faecalis ит. 180.

Антигены готовили в концентрации I млрд. микробных клеток в I мл, путем сшва-суточной культуры с поверхности ШІА, а в случае с M.pluton брали 4-6-ти суточные культуры, выращенные на жидкой поптоно-цистеиновой среде, трижды отмытые в стерильном физиологическом .растворе центрифугированием при 3000 g в течение 10-15 минут с последующим ресуспендироЕанием до указанной концентрации. Материал разливали во флаконы по 1-2 мл и замораживали (-4С).

Иммунизацию кроликов осуществляли трехкратно по следующей схеме: I мл антигена смешивал:! с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 и вводили кролику в подушечки задних лапок по 0,2 мл, в бедренные мышцы по 0,5 мл и внутрикокно в шести точках стиш по 0,1 мл; вторую и третью внутривенные инъекции антигена проводили без адъюванта в объеме I мл в той же концентрации соответственно через 21 и 28 дней. В процессе иммунизации кроликов через кагдае 7 дней брали кровь из ушной

- д -

в єни для стремления титра сивороток. Обескровливании хпвотішх проводил;! на v-IO день поело последней ппьекцпп, кровь брали из сонной артерии или из сердца в стернлышо колби, Ы1дир>ли;а-. ли при 37 І час, образовавшийся шуеток отдолллл от сістюіс стерильними стеклятлшмп палочкаш. Носче отстаивания ^рп 4 в течение 10-20 часов отделившуюся сиворгтку отсасиеалл ілериль-іші.ш пипетками, а в случае необходимости, для освобождения от эритроцитов, центріпуіпровалл при очХОц 10 мшу т. л подученным сивороткам добавляли мортполяг до коночной концентрации 1:10 000, хранили в замороженном, виде. От комдого кролика било получено около 50 ил сиворотки.

Активность и специфичность іЮиіуч&шшх гпперпигуклих сивороток определяли в реакции гатлютшіацип в пробирках, придерживаясь методики Б.А.ЇрцЛ'.'.Чісо (ГобЗ). Постановку реакции мпкре-агглютннащ.и проводил! согласно общепринятой методики.

'. Ка основе пшерш.імунноЛ сиворотки против ii.pimou ;іір.531 ц стафилококкового реагента (взвесь Staphyicaoconc am-eua пташа Ca',ven-I), выпускаемого Санкт-Петербургским яаучно-пс-

СЛеДОПаТелЬСШІМ ИНСТИТУТОМ 0ГСІДІ.МОЛ0гаи И МИКрОбПО.Г.СГПИ И!1.

Л.ІІастера, готовили коагглытпнпрунщн¹. реагент, необходимый для постановки FKDA. Предварительно осуществляли! контроль си- воротки на содержите противостарилокекковых антител и антител к тканям личинок; на предметном стекле оценивала! ее- о каплей ІСЙ суспензии стафилококкового реагента или с ГО;, экстрактом из здорових ЛИЧИНОК.

Отрабативалп условия прпготовлеїшн диогностикуга, пелучз-1ПШ антигена из больных и 'погибах личинок пчел и постановки реакции. Каждип отшт сопровождали несколькими отрпцатслыпеш контролями: старнлококкевш реагент, сенепбллнзнропашшй нор-

малыши сывороткой + испытуемый антиген; г.оагглптинярующий реагент + экстракт из заведомо здорових личинок пчел; коагглюти-ннруюпгпй реагент + физиологический раствор; испытуемый антиген + физиологический раствор. В качестве контрольного положительного антигена использовали смыв 4-6-суточной культуры M.pluton шт. 534 с жидкой гшптоно-цистєшіоеой среды в кон-

цеитрзіиш 10 бак.кл/мл. Постановку РКОА осуществляли в виде обычной реакшп на стекле. Опроделч.та условия и длительности хранения даагноотикуїла и контрольного положительного антигена. Специфичность ГГОА проверял;. путем постановки перекрестных ре-агадй о гомологичным н гетеролопгппг.т антигенами. ГКОЛ сравнивали с РА (капельной и пробирочной).