Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Обзор литературы 11
1.1 Соя – ведущая зернобобовая культура 11
1.2 Формирование взаимовыгодных – растительно-микробных систем . 14
1.3 Использование препаратов на основе эндомикоризных грибов и клубеньковых бактерий . 22
Раздел 2. Методы исследования и условия проведения опытов 27
Раздел 3. Выделение ассоциаций грибов арбускулярной микоризы и оценка их эффективности 34
3.1 Выделение грибов ам из разных фитоценозов крыма 34
3.2 Первичный скрининг эффективности накопления микоризы и продуктивности растений при использовании новых ассоциаций грибов ам 38
Раздел 4. Идентификация новых ассоциаций эндомикоризных грибов 45
4.1 Морфологические признаки внутрикорневых структур микоризы и спор. 45
4.2 Идентификация на основе последовательности рибосомальной днк 47
Раздел 5. Эффективность аборигенной расы эндомикоризных грибов в агроценозе сои 52
Раздел 6. Формирование симбиотических систем растений сои с b. Japonicum 36 и ассоциациями грибов ам 59
6.1 Штамм B. JAPONICUM 36 – активный симбиотический азотфиксатор 59
6.2 Влияние разных компонентов субстратно-корневой смеси с ассоциациями грибов ам на эффективность симбиоза с растениями сои 61
6.3 Эффективность применения субстратно-корневой смеси с новыми ассоциациями грибов ам в технологиях возделывания сои 66
Заключение 99
Перечень условных обозначений, единиц, сокращений и терминов 101
Список использованной литературы
- Формирование взаимовыгодных – растительно-микробных систем
- Использование препаратов на основе эндомикоризных грибов и клубеньковых бактерий
- Первичный скрининг эффективности накопления микоризы и продуктивности растений при использовании новых ассоциаций грибов ам
- Влияние разных компонентов субстратно-корневой смеси с ассоциациями грибов ам на эффективность симбиоза с растениями сои
Формирование взаимовыгодных – растительно-микробных систем
Соя относится к наиболее ценным сельскохозяйственным культурам. Ее культивирование обеспечивает производство полезных для человека пищевых продуктов, высокопитательных кормов для животных и сырья для перерабатывающей промышленности [5]. Также соя имеет большое агротехническое значение [74]. Как и любая другая бобовая культура, она содействует повышению плодородия почв: за счет симбиоза с клубеньковыми бактериями обогащает ее азотом и потому является одним из лучших предшественников для большинства сельскохозяйственных культур [81].
Широкое применение сои обусловлено, прежде всего, биологическими особенностями культуры. Оптимальная территория для возделывания сои по климатическим условиям определяется следующими параметрами: сумма активных температур (выше 10С) 2000-2500С, средняя температура самого теплого месяца 18-22С и годовая сумма осадков на уровне 500-800 мм [3]. Соя является теплолюбивой культурой короткого светового дня [49]. Оптимальная температура для формирования урожая зависит от фазы развития: 8-14С при прорастании, 18-25С при цветении и созревании. Продолжительность вегетационного периода до 170 дней.
Культура среднеустойчива к засухе в промежутке от начала всходов до цветения, однако во время цветения и формирования бобов – зависима от наличия влаги в воздухе (не менее 75%) и почве (70-80% от полной влагоемкости) [75]. Требования к влаге меньше в начале вегетации благодаря интенсивному развитию корневой системы и медленному – надземной части, поэтому испарение воды в это время незначительное. Недостаток воды во время цветения и роста бобов приводит к опадению бутонов, цветков, плодов, уменьшению массы семян и урожая [49]. Наиболее пригодны для сои почвы с нейтральной реакцией, плодородные, с высоким содержимым органического вещества. В засушливом климате соя положительно откликается на полив во время цветения и формирования бобов [4]. Для вызревания сои в самых северных районах соесеяния с малым количеством дней продуктивных положительных температур, рекомендуется увеличить высев скороспелых и средне-раннеспелых сортов [10].
Селекция должна учитывать зональность климатических условий и быть ориентированной на создание сортов, приспособленных к определенной территории [35, 48]. Современная селекция сои направлена на приспособленность к факторам окружающей среды [64], содержание белка и масла в семенах [21, 73], стойкость к заболеваниям и вредителям [52, 54, 82], повышение эффективности симбиотической азотфиксации [10, 36]. Основными методами селекции являются сортолинейная и межсортовая гибридизация, экспериментальный мутагенез с последующим многоразовым индивидуальным отбором [9, 51, 72].
Сегодня научными учреждениями рекомендуются традиционная (иногда с модификациями) и Noill технология возделывания сои [74, 75, 78]. Отдельный способ – послеукосный и пожнивной посевы ультраскороспелых сортов культуры для территорий с продолжительным вегетационным периодом и достаточным количеством тепла [6, 67]. Продолжается работа научных учреждений по определению влияния орошения [152, 223], внесения удобрений [58, 65, 83], применению химических протравителей и средств защиты от фитопатогенов и фитофагов [11, 17, 22, 28, 57] на рост, развитие и продуктивность сои. Для сохранности плодородия почв, улучшения состояния экологической безопасности и ведения постоянного земледелия много внимания отводится изучению адаптивно-рациональных севооборотов с привлечением бобовых и зернобобовых растений (в частности сои), запахиванию растительных остатков и органических удобрений, использованию биопрепаратов для повышения производительности и защиты растений [60].
Размеры азотонакопления в агроценозах сои могут быть достаточными для обеспечения полноценного развития растений. Так, производительность азотфиксации в агроценозах с соей составляет 70-100 кг на гектар [33]. Часть азотистых соединений при жизни растений остается замкнутой в корневых клубеньках и становится доступной другим растениям лишь после минерализации корневых остатков [12, 76]. Таким образом, бобовые обогащают почву азотом и являются идеальными предшественниками для многих культур. Однако достичь таких показателей азотфиксации можно лишь в том случае, если будет соблюден ряд экологических требований, среди которых самым важным является наличие эффективного штамма клубеньковых бактерий, способного в условиях конкуренции со стороны спонтанной микрофлоры принимать активное участие в формировании симбиотического аппарата [13, 56].
Такие исследования сегодня проводятся в многочисленных научных учреждениях. Так, при обработке семян сои транспозоновыми мутантами установлена прямая связь между азотфиксирующей активностью корневых клубеньков и интенсивностью фотосинтеза растения-хозяина [26].
Уменьшение уровня засоренности почвенным гербицидом Харнес, обработка семян сои бактериями B. japonicum 614 А и Bacillus subtilis 2 и обработка посевов микробным препаратом Хетомик с внекорневой подкормкой стимулятором роста Эколист стандарт создавали благоприятные условия для роста и развития, питания растений, повышали устойчивость к пероноспорозу и содействовали формированию урожайности на 0,48-0,8 т/га высшей, чем в варианте с внесением гербицида [27].
Использование препаратов на основе эндомикоризных грибов и клубеньковых бактерий
Эффективность новых ассоциаций грибов АМ и влияние разных способов внесения микоризного инокулюма исследовали на ультраскороспелом сорте сои Аннушка на лугово-черноземной почве. Для обеспечения фосфорного баланса почв вносили Суперфосфат под предшественник – пшеницу озимую Triticum aestivum (L.) сорта Паляница (селекции Луганского института селекции и технологий) с расчета 30 кг/га действующего вещества под вспашку. Изучали эффективность новых ассоциаций Rhizophagus sp. Р3, Р5, S5, S9 при применении Ризобофита на основе B. japonicum 36. В следующем опыте изучали способ внесения микоризного препарата на основе ассоциаций Р3 и S5 с семенами предшественника (пшеница озимая) в октябре, с семенами пожнивной сои (в июле) и дважды – с предшественником и с исследуемой культурой.
Влияние двойной инокуляции ассоциациями грибов АМ Р3, S5 и S9 и Ризобофитом на основе штамма B. japonicum 36 на эффективность симбиоза исследовали на черноземе южном. Грибной препарат в количестве 100 кг/га вносили сеялкой вместе с бактеризованными семенами сои сортов Одесская 150А и Ятрань. Учетная площадь участков составляла 50 м2, повторность опытов – 5-кратная. Урожай собирали прямым комбайнированием при использовании Sampo 500. Полученную массу зерна пересчитывали на 100% чистоту и 14% влажность.
Анализ насыщенности корневой системы растений арбускулярной микоризой проводили по методам Vierheilig et al. [220] и Trouvelot et al. [218]. В опытах подсчитывали количество клубеньков и их сырую биомассу, как показатели формирования бобово-ризобиального симбиоза. Нитрогеназную активность клубеньков в вегетационных и полевых опытах определяли ацетиленовым методом при использовании газовой хроматографии (пламенно-ионизационный детектор, газовый хроматограф "Chrom-5") [7, 131].
Азот и фосфор в семенах определяли по методике, разработанной во ВНИИ эфиромасличных культур [53]. Содержание азота пересчитывали на содержание белка, используя коэффициент 6,25 – среднее количество азота в белках (100 % / 16 % = 6,25). Масличность определяли методом сырого остатка [66]. Агрохимические показатели почвы определяли стандартизированными методами [41].
Идентификацию новых выделенных ассоциаций проводили по морфологическим признакам спор и внутрикорневого мицелия грибов АМ микроскопированием [109, 201] и молекулярно-генетическими методами.
Выделение целевой ДНК ассоциаций осуществляли из корней растений суданской травы бинарной культуры. Для выделения ДНК использовали модифицированный CТАВ-метод [32, 200]. Для амплификации участки рибосомного оперона генома грибов АМ использованы следующие пары праймеров, специфических филе Glomeromycota: SSU-Glom1 5 -ATTACGTCCCTGCCCTTTGTACA-3 , LSU-Glom1 5 -CTTCAATCGTTTCCCTTTCA-3 (Evrogen, РФ) [194], расположенные на участке ДНК рибосомного оперона генома грибов (рис. 2.1).
Схема региона рДНК, изображающая субединицы рРНК и сайты отжига праймеров SSU-glom1 и LSU-glom1, использованных для молекулярной идентификации грибов АМ [192]. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси в термоциклере iСycler (Bio-rad, США). Состав смеси для ПЦР: 2,5 мкл буфер для полимеразы; по 0, 2 мМ каждого из нуклеотидов; 2, 8 мМ MgСb; по 5 пМ каждого праймера; 1 единица термостабильной ДНК-полимеразы DiaТaq (“Амплисенс”, Россия); 20 нг целевой ДНК; компоненты реакции доводили до необходимой концентрации деионизированою водой, полученной с помощью прибора Purelab Ultra (Elga, Англия). Условия проведения ПЦР: начальная денатурация ДНК: 94С - 5 мин.; в течение 35 циклов: денатурация при 94С - 30 сек., отжиг праймеров 55С - 30 сек., синтез ДНК при 72С - 1 мин.; окончание синтеза ДНК: 72С - 7 мин. Детекцию и определение длины продуктов реакции проводили в 1% агарозном геле в 0,5-кратном буфере ТАЕ при окраске бромистым этидием на приборе GelDoc (Bio-rad, США) с маркером молекулярной массы GeneRuler 100 Mix (Fermentas, США) по 5 мкл на дорожку.
Очищение ДНК-фрагментов от агарозного геля проведено с помощью “Silica”. Клонирование в Escherichia coli DH5 проводили с использованием вектора pTZ57R/T с применением набора InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit (Fermentas, США). Отбор трансформантов проводили методом бело-голубой селекции. Соответствие вставки начальному фрагменту проверяли путем осуществления ПЦР на колониях трансформантов с праймерами М13dir и М13rev с дальнейшим разделением продуктов в 1% агарозном геле, в 0,5% ТАЕ-буфере. ПЦР осуществляли в 25 мкл реакционной смеси, вместо добавления ДНК вносили небольшую часть колонии Е. coli. Рестрикционный анализ проводили с использованием эндонуклеазы рестрикции Rsal GTAC (Fermentas, США) по протоколу производителя. Секвенирование проводили на автоматическом приборе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США) по протоколу производителя. С помощью интернет-ресурса NCBI Blast [89] проводили сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями из базы данных ГенБанка [171]. Выравнивание последовательностей выполнено в программе CLUSTALW 1.75v. [214]. Проверка, редактирование и построение филогенетического дерева выполнено в программах «BioЕdit 7.0.5.3» [130] и Mega 3.1 [150] с алгоритмом Neighbor-Joining (NJ) [172]. Генетические расстояния между выравненными последовательностями рассчитаны по двупараметричной модели Кимуры [143].
Single adapter Аmplified Fragmen Length polymorphism (saAFLP, одноадаптерный анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов) проводили согласно рекомендациям авторов [232] для В. japonicum. Использовали эндонуклеазу рестрикции Xmaji C CTAGG (Fermentas, США), которая образует «липкие» концы при «разрезе» таргетной ДНК, с адаптером к ней Ad.CTAG2 и праймером Pr.CTAG2. Нуклеотидная последовательность адаптера и соответствующего праймера будет представлена в дальнейших работах авторов метода.
Статистическую обработку полученных данных проводили по Б.А. Доспехову [31] и Н.И. Воробьеву с соавт. [19], используя программу Microsoft Excel, а также статистические возможности самой программы [71].
Первичный скрининг эффективности накопления микоризы и продуктивности растений при использовании новых ассоциаций грибов ам
Первичный скрининг проводили на тест-культуре S. sudanense сорта Фиалета и разных сортах сои. Для инокуляции растений использовали субстратно-корневую смесь с новыми ассоциациями грибов арбускулярной микоризы [106]. При изучении мацерированных и окрашенных корней суданской травы, инокулированной референтным изолятом Rhizophagus irregularis BEG144 и новыми ассоциациями эндомикоризных грибов, выделенных из разных агроценозов и естественных фитоценозов, определено, что микориза была сформирована во всех вариантах опыта. На рисунке 3.4 представлено развитие АМ в неинокулированном растении и в растении с обработкой референтным изолятом R. irregularis BEG 144. На правом рисунке видно разветвления мицелия, место проникновения в корень, развитие гиф гриба во внутренних структурах корня и большое количество арбускул.
Неинокулированный (1) и инокулированый R. irregularis BEG 144 (2) корни Sorghum sudanense. Примечания: ОЦ – осевой цилиндр корня растения; Гф – гифы гриба; Ар – арбускулы.
В контроле (без инокуляции) в корнях растений арбускулярной микоризы не выявлено (табл. 3.2). Референтный изолят R. irregularis BEG144 наблюдали в корнях с частотой в 96,5%, интенсивность его развития находилась на уровне 69,3 %. В корнях растений выявлены арбускулы, количество которых составляло 44,9±27,9 %, и единичные везикулы. В растениях при инокуляции новыми выделенными ассоциациями S5, S9, Р5 наблюдали интенсивно развитые все структурные элементы грибов АМ: частота встречаемости АМ колонизации составляла 70,0-98,4 %, интенсивность микоризации 53,6-71,9 %, количество арбускул и везикул, соответственно, 28,2-48,0 % и 11,0-47,5 %. Установлено, что микориза интенсивно формировалась при обработке R. irregularis BEG144 и новыми выделенными ассоциациями S5, S9, Р5, и превышала другие обработки по показателям выявления АМ колонизации, интенсивности развития и количества арбускул в 1,2-6,6 раза, а по количеству везикул в 1,6-23,8 раза.
Влияние ассоциаций грибов АМ на уровень микоризации суданской травы сорта Фиалета (вегетационный опыт на стерильном песке, 2009 г.) Вариант опыта F, % M,% A, % B, % Без инокуляции, контроль 0 - - Референтный изолят BEG144 96,5+0,2 69,3+15,9 44,9+27,9 1,0+0,5 Примечания: F – частота встречаемости АМ колонизации; М – интенсивность микоризации; А – количество арбускул на 1 см корня; В – количество везикул на 1 см корня. Воздушно-сухая масса корней суданской травы, инокулированных ассоциациями S5, S9, Р5, достоверно увеличилась на 150-170% в сравнении с контролем (0,26 г/растение) и на 103-125% в сравнении с референтным изолятом BEG144 (0,32 г/растение) (табл. 3.3). Воздушно-сухая масса побегов указанных вариантов увеличилась на 150-217% и на 25-58% относительно контроля (0,06 г/растение) и изолята BEG144 (0,12 г/растение) соответственно.
Варианты опыта Масса сухойкорневой системы,г/растение Масса сухойназемной части,г/растение
Установлено положительное влияние обработки ассоциациями S5, S9, Р5 на увеличение массы корней и побегов суданской травы сорта Фиалета. Масса корней растения-хозяина и интенсивность их микоризации являются одними из определяющих показателей для создания препарата на основе грибов арбускулярной микоризы. Выявлено, что новые выделенные ассоциации S5, S9, Р5 по этим показателям эффективны и могут стать основой для создания микробного препарата.
Эффективность новых ассоциаций грибов АМ исследовали в условиях вегетационного опыта на стерильной смеси песка с вермикулитом на культуре сои сорта Аннушка, инокулированной высокоэффективным штаммом B. japonicum 36 в сравнении с референтным изолятом BEG 144 (табл. 3.4). Контрольные растения обрабатывали немикоризованными корнями суданской травы и суспензией клеток ризобий сои штамма 36. При использовании поверхностно-стерилизованных семян, растения сои в контроле не сформировали клубеньков на корнях. Применение для предпосевной бактеризации штамма B. japonicum 36 способствовало образованию азотфиксирующих клубеньков в количестве 12,4 ед./растение. Внесение грибов АМ стимулировало развитие бобово-ризобиального симбиоза: количество клубеньков возросло на 12,9 – 96,8% по сравнению с вариантом предпосевной монобактеризации. Эффект стимуляции при подобных условиях также получен и другими исследователями Украины, России и научных центров других стран [38, 46, 226]. Полученные данные свидетельствуют, что количество сформированных бобов достоверно увеличилось в 1,5-2 раза сравнительно с контролем в пяти вариантах: с ассоциациями S4, S7, S9, P2, P5. В вариантах с изолятами S1, S4, S5, S8, S9, P2, P3 P5 вес сухой надземной массы превышал на 31-36% инокулированный контроль и на 12-19% – производственный изолят.
Применение ассоциации грибов АМ Р3 совместно с Ризобофитом на основе B. japonicum 36 сопособствовало увеличению количества клубенькообразующих единиц (КОЕД) и на других современных сортах сои разной селекции. Сорта относятся к разным группам спелости: скороспелый (Устя), раннеспелый (Медея), среднераннеспелый (Иванка, Ятрань) и среднеспелый (Симфония). Анализирую полученные результаты выявлено, что корни растений образовали небольшое количество клубеньков в контроле и варианте с обработкой ассоциацией Р3 (табл. 3.5).
Влияние разных компонентов субстратно-корневой смеси с ассоциациями грибов ам на эффективность симбиоза с растениями сои
Как известно, одной из препаративных форм инокулянта на основе микоризных грибов является субстратно-корневая смесь (СКС), которая включает в себя субстрат (песок, вермикулит и т.п.) и корни растения-накопителя. При этом важным является выяснение эффективности разных вариантов смесей. В связи с этим наши исследования посвящены изучению влияние разных компонентов СКС, содержащей продуктивную ассоциацию Р3 на сроки и обилие микоризации корней сои сорта Аннушка, а также эффективность симбиоза с изучаемой культурой. Эксперимент проведен в условиях вегетационного опыта на смеси песка с вемикулитом.
Влияние разных компонентов и доз СКС с ассоциацией Р3 на эффективность симбиоза сои сорта Аннушка при применении Ризобофита (фаза первого тройчатого листа, вегетационный опыт на смеси песка с вермикулитом). Вариант опыта Дозы инокуляции F, % М, % на1смкорня А, % на1 смкорня Сухая наземнаямасса, мг/растение Примечания: F – частота встречаемости АМ колонизации; М – интенсивность развития АМ колонизации; А – количество арбускул; CКС – субстратно корневая смесь.
Во всех дозах инокулюма с отрезками корней и отрезками с субстратом частота встречаемости АМ колонизации составила 24,8-44,4% на 1 см корня. Это положительно повлияло на формирование сухой наземной массы растений в этих вариантах. При инокуляции семян сои отрезками корней + субстрат в дозе 0,1 и 0,5 г/семя масса растений увеличилась на 23% к контролю. При других способах обработки семян арбускулярная микориза развивалась лишь при высокой дозе инокулюма.
Через 28 суток в фазу трех узлов микоризованными были корни почти во всех вариантах (табл. 6.5). В вариантах с отрезками корней сформировались арбускулы в количестве от 0,02 до 4,5%. Это обеспечило формирование наземной массы на 5 – 30% больше контроля, показатель которого составил 0,17 г/растение. Примечания: F – частота встречаемости АМ колонизации; М – интенсивность развития АМ колонизации; А – количество арбускул; CКС – субстратно корневая смесь.
В других вариантах показатели симбиоза были существенно меньшими. Это объясняется недостаточным количеством спор в субстрате (1-2 единица / г), а при перемалывании корней измельчителем тканей сохранилось небольшое количество жизнеспособных колонизирующих единиц: гиф и везикул.
Через 55 суток роста растений (фаза цветения) в корнях растений во всех вариантах с обработкой выявляли структурные элементы микоризы, контрольные растения при этом не были микоризованными (табл. 6.6).
Влияние разных компонентов и доз СКС с ассоциацией Р3 на эффективность симбиоза сои сорта Аннушка при применении Ризобофита (фаза цветение, вегетационный опыт на смеси песка с вермикулитом). Вариант опыта Дозы инокуляции F, % М, % на 1см корня А, % на 1 см корня Сухая наземнаямасса, мг/растение
Примечания: F – частота встречаемости АМ колонизации; М – интенсивность развития АМ колонизации; А – количество арбускул; CКС – субстратно корневая смесь. Частота встречаемости АМ колонизации в вариантах с отрезками корней достигала 42,3-100%, а интенсивность находилась на уровне 4,3-13,3% на 1 см корня. Сухая зеленая масса при обработке отрезками корней + субстрат в дозе 0,1 и 0,5 г/семя составляла 310-370 мг / растение, что на 100-160 мг или 20,0 76,2% больше, чем в контроле. Но варианты с размолотыми корнями + субстрат в дозе 0,1 и 0,5 г/семя микоризованными не были. Прирост наземной массы в этих вариантах, а также в варианте с чистым субстратом в дозах 1 и 2 г / семя, возможно, объясняется активностью свободноживущх полезных микроорганизмов, внесенных с препаратом.
В результате проведенных исследований в контроле без инокуляции микоризных структур в корнях сои не выявлено. В варианте с обработкой «отрезками корней + субстрат» установлено, что инфицирование корней сои эндомикоризными грибами происходило уже с фазы первого тройчатого листа, а воздушно-сухая зеленая масса растений в фазу цветения увеличилась на 20,0-76,2 % в сравнении с контролем в дозе 0,1 и 0,5 г/семя. В остальных вариантах применение препаративных форм СКС было малоэффективным. Вероятно, это объясняется недостаточным количеством сформированных спор в субстрате (1-2 шт./г), а при механизированном измельчении корней сохранением малого количества жизнеспособых инфицирующих единиц: гиф и везикул.
Таким образом, для создания биопрепарата на основе АМ грибов, можно рекомендовать препаративную форму в виде отрезков корней смешанных с субстратом в дозе 0,1-0,5 г/семя, как наиболее эффективную.
Из естественных фитоценозов и агроценозов нами выделено 15 ассоциаций грибов АМ. Среди них 8 отмечались большим количеством структурных единиц на растениях-накопителях. Ассоциации Р3, Р5, S3, S5, S8, S9 имеют в своем составе грибы рода Rhizophagus sp., a S1 – Funneliformis sp. и Rhizophagus sp. [1].
Дальнейшее изучение выделенных ассоциаций было проведено в условиях полевых опытов на лугово-черноземной почве. Нами исследовано формирование симбиоза сои сорта Аннушка с микроорганизмами при условии инокуляции семян Ризобофитом и созданной субстратно-корневой смесью (СКС) на основе эффективных ассоциаций АМ грибов исследовали в полевом опыте на лугово-черноземной почве на фоне почвенной популяции B. japonicum плотностью 103 КОЕД на грамм почвы и аборигенной расы эндомикоризных грибов. В годы исследований погодные условия были различными и оказывали влияние на развитие растений и микросимбионтов на их корнях.