Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Эволюция принципов классификации, идентификации и установления аутентичности бактерий
1.2 Современные способы консервации бактерий в коллекционных центрах
1.3 Использование коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов в научно-исследовательской деятельности и практике здравоохранения
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Штаммы бактерий I – IV групп патогенности и их культивирование 40
2.2 Используемые химические реагенты 45
2.3 Изучение культурально-морфологических, фенотипических, молекулярно-генетических и серологических свойств коллекционных тест-штаммов патогенных микроорганизмов 46
2.4 Идентификация микроорганизмов на основании биохимической активности
2.4.1 Использование дифференциально-диагностических сред Гисса 46
2.4.2 Использование систем индикаторных бумажных (СИБ) 47
2.4.3 Использование АРI систем 48
2.4.4 Использование анализатора VITEK 2 Compact
2.5 Идентификация микроорганизмов с помощью автоматической 50 системы рибопринтинга (RiboPrinter System)
2.6 Идентификация микроорганизмов с помощью MALDIOF масс- спектрометрии
2.7 Использование серологических методов для идентификации бактерий родов Shigella и Salmonella
2.8 Лиофилизация бактериальных клеток на сублимационных установках камерного и коллекторного типов
2.9 Низкотемпературная консервация бактерий I-IV групп патогенности
Глава 3 Определение аутентичности и таксономической принадлежности коллекционных тест-штаммов патогенных микроорганизмов
3.1 Культурально-морфологические и тинкториальные свойства тест - штаммов патогенных микроорганизмов
3.2 Определение биохимических показателей тест - штаммов патогенных микроорганизмов
3.3 Поиск маркеров аутентичности коллекционных тест-штаммов патогенных микроорганизмов, ассоциированных с их биохимической активностью
3.4 Идентификация тест-штаммов патогенных микроорганизмов с помощью MALDIOF масс-спектрометрии
3.5 Риботипирование на автоматической станции Dupont Qualicon RiboPrinterSystem
Глава 4 Разработка алгоритма установления аутентичности референтных штаммов патогенных микроорганизмов и создание базы данных для его выполнения
4.1 Создание базы данных результатов научных исследований тест- штаммов патогенных микроорганизмов и её использование в установлении их аутентичности
4.2 Разработка алгоритма установления аутентичности и таксономической принадлежности тест-штаммов
Глава 5 Разработка схемы процесса консервации коллекционных тест- 101 штаммов патогенных бактерий
5.1 Лиофилизация патогенных бактерий на установках камерного и 102 коллекторного типа
5.2 Оптимизация способа низкотемпературной консервации референтных штаммов при температуре минус 70 С в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»
Заключение 133
Практические рекомендации 133
Перспективы дальнейшей разработки 133
Выводы 144
Список литературы
- Современные способы консервации бактерий в коллекционных центрах
- Идентификация микроорганизмов на основании биохимической активности
- Определение биохимических показателей тест - штаммов патогенных микроорганизмов
- Разработка алгоритма установления аутентичности и таксономической принадлежности тест-штаммов
Введение к работе
Актуальность исследования и степень разработанности проблемы. Одной из
важнейших задач коллекционной деятельности в области использования патогенных
микроорганизмов, является формирование панелей тест-штаммов, использующихся в качестве
контрольных различных научно-практических исследований [Онищенко и др., 2009;
Меньшиков и др., 2013; Шепелин и др., 2015]. Их применение определяется нормативно-
методическими документами различного уровня и является обязательным при проведении
исследований, связанных с использованием микроорганизмов I-IV групп патогенности в
производственной, диагностической и образовательной деятельности [СП 1.3.3118-13; СП
1.3.2322-08; МУ 3.3.2.2124-06; МУК 4.2.2316-08]. При этом подавляющее большинство тест-
штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий (ГКПБ) ФКУЗ РосНИПЧИ
«Микроб» были выделены и описаны в середине XX века, до периода становления современной
микробиологической систематики, и могут не соответствовать ее постоянно
совершенствующимся требованиям. Кроме того, методы их идентификации, на момент выделения культуры, обладали меньшей разрешающей способностью и не позволяли, в ряде случаев, с высокой степенью точности определить видовую принадлежность микроорганизма. Также не маловажен тот факт, что до публикации в 1980 г. первого издания «Утвержденные списки названий бактерий» [Skerman et al., 1980], одни и те же микроорганизмы могли иметь различные наименования.
И, наконец, еще одной серьезной проблемой в данном аспекте является несовершенная система хранения микроорганизмов, использовавшаяся в тот период времени. Применение методов долгосрочной консервации (лиофилизации или криоконсервации) могла позволить использовать в практике лишь малая часть коллекций, а наиболее распространённым способом являлось поддержание штаммов на плотных или полужидких питательных средах с интервалом пересева культуры не менее одного раза в год. Постоянные пересевы способствовали накоплению ошибок, вызванных человеческим фактором, к которым в первую очередь относятся загрязнение образцов, а также их непреднамеренная замена, что в случае микроорганизмов, близких по целому ряду признаков, могло привести к утрате первоначальной культуры и распространению в другие коллекции неаутентичного штамма.
Все вышеизложенное свидетельствует о необходимости проведения номенклатурной ревизии коллекционных тест-штаммов с применением современного набора методов установления аутентичности, основанных на использовании автоматизированных систем биохимического и молекулярно-генетического анализа (VITEK 2 Compact, Dupont Qualicon RiboPrinterSystem, MicroFlexТМ LT MALDI-TOF), определением спектра их видоспецифичных маркеров и уточнением систематического положения на основании обновляющихся, или вновь вводимых признаков, характеризующих видовую принадлежность микроорганизма. Для эффективного использования установленных маркеров аутентичности требуется механизм, позволяющий объединить информацию из различных видов генетических и фенотипических исследований коллекционных штаммов в одну глобальную базу данных и обеспечивающий проведение окончательного анализа их свойств. В этом качестве возможно использование обширного спектра компьютерных программ, одной из которых является BioNumerics [Rodas et al., 2005].
Другой немаловажной деятельностью является совершенствование подходов к поддержанию штаммов в жизнеспособном состоянии с сохранением первоначальных свойств в течение максимально возможного времени [Guidance for the operation of biological research centers, 2004 г.]. Одним из оптимальных методов хранения является лиофилизация, обеспечивающая наибольшую стабильность признаков в течение длительного времени (30 лет и более) и позволяющая не только поддерживать штаммы коллекционного фонда, но и обеспечивать их образцами сторонние учреждения, осуществляя пересылку без сохранения холодовой цепи. Используемое ранее для этих целей оборудование к настоящему времени является морально и физически устаревшим и требует замены на современные сублимационные установки. При этом внедрение новых лиофильных аппаратов для высушивания патогенных микроорганизмов влечет за собой необходимость отработки условий этого процесса с учетом их технических характеристик и конструктивных особенностей. Более простым и удобным методом консервации часто востребованных штаммов, прежде всего в рабочих коллекциях, не требующих транспортировки на дальние расстояния, является низкотемпературное замораживание при температуре минус 70 С. Сложность такого хранения представляет подбор условий, поскольку универсальных способов консервации не существует [Онищенко и др., 2010; Савкина и др., 2015].
В связи с этим, очевидна актуальность исследований, направленных на оптимизацию существующих подходов с подбором условий и адаптации нового оборудования к консервации патогенных микроорганизмов с целью сохранения жизнеспособности и увеличению сроков хранения их коллекционных штаммов, в том числе и контрольных, а также повышения эффективности их консервации и уменьшению времени, затрачиваемого на этот процесс.
Цель исследования: совершенствование методических подходов к установлению аутентичности коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов и оптимизация способов их долгосрочного хранения.
Задачи исследования:
-
Провести расширенную идентификацию тест-штаммов патогенных бактерий на основе изучения их культурально-морфологических свойств, биохимической активности, протеомного профиля рибосомальных белков, структуры и расположения rrn-оперона в геноме патогенов.
-
Определить на основе полученных результатов комплекс маркеров аутентичности тест-штаммов по утилизации субстратов, масс-спектрам и риботипам.
-
Сформировать единую базу данных изученных свойств патогенов и разработать алгоритм установления аутентичности контрольных штаммов.
-
Адаптировать способ низкотемпературного хранения коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов в ГКПБ ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора.
-
Оптимизировать схему процесса лиофилизации штаммов патогенных микроорганизмов с применением современных сублимационных установок камерного и коллекторного типов с обеспечением режима биологической безопасности.
-
Провести сравнительный анализ лиофилизированных препаратов коллекционных тест-штаммов, полученных на различных сублимационных установках, по их жизнеспособности и длительности хранения.
Научная новизна. Впервые по биохимической активности (от 40 до 60 признаков), по молекулярно-генетическому профилю (структуре и расположению гги-оперона) и спектрам рибосомальных белков проведена расширенная идентификация 130 штаммов микроорганизмов I-IV групп патогенности из Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», использующихся в качестве контрольных в диагностической и производственной деятельности.
Получены «молекулярные портреты» контрольных штаммов, позволяющие комплексно проводить их родовую, видовую и подвидовую дифференциацию. Сведение результатов фенотипических, молекулярно-генетических и протеомных исследований в единой базе данных позволило определить комплекс маркеров аутентичности для каждого из исследуемых коллекционных тест-штаммов, характеризующийся набором: из 5 - 13 биохимических субстратов, ферментируемых клетками микроорганизма; 1 - 9 фрагментов гги-оперона с молекулярными массами в интервале 0,99 - 14,38 т.п.н и 1 - 15 рибосомальных белков с массой 3,06 - 9,78 кДа. Данное исследование позволило впервые комплексно охарактеризовать панель контрольных штаммов, поддерживаемых в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», и способствовало обеспечению их подлинности, на всех этапах воспроизводства.
По материалам проведенных исследований разработан алгоритм определения аутентичности и систематической принадлежности коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов, включающий скрининг культурально-морфологических свойств штаммов, определение их ферментативной активности к расширенному количеству дифференцирующих субстратов, установление профиля рибосомальных белков и получения риботипа, с последующей обработкой этих результатов в биоинформационном программном пакете BioNumerics.
На модели 60 штаммов бактерий, относящихся к 22 родам и 40 видам, научно обоснованы схемы долгосрочной консервации контрольных штаммов патогенных микроорганизмов методами лиофилизации на современных сублимационных установках камерного, коллекторного типов и низкотемпературного замораживания, обеспечивающие длительное поддержание образцов в жизнеспособном состоянии при обеспечении биологической безопасности всего технологического процесса.
Полученные данные о выживаемости и жизнеспособности 45 контрольных штаммов, указывают на высокую эффективность использования лиофильных установок коллекторного типа для поддержания коллекционного фонда штаммов патогенных микроорганизмов, в то время как применение камерной сушки позволяет получать препараты ограниченного срока хранения. Дана оценка использования различных лиопротекторов на качество получаемых препаратов коллекционных штаммов. Показано, что наиболее подходящими для лиофилизации контрольных штаммов являлись сухое молоко с добавлением трегалозы, сахарозо-желатиновая среда(СЖА), лактозо-желатиновая среда (ЛЖ).
Адаптированный метод низкотемпературного замораживания позволяет значительно увеличить сроки хранения контрольных штаммов в рабочих коллекциях в условиях минус 70 С с применением в качестве криопротекторов протеозопептона с 50 % глицерином, сухое молоко с добавлением трегалозы, СЖА.
Эффективность предложенных схем долгосрочной консервации теоретически обоснована путем расчёта прогнозируемых сроков хранения лиофилизированных и замороженных препаратов контрольных штаммов, находящихся в интервале от 2 до 100 лет в зависимости от видовой принадлежности патогена, типа лиофильной установки и состава крио-и лиопротекторов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Теоретическая значимость диссертационной работы состоит в получении знаний, формирующих представления о современных подходах к установлению аутентичности штаммов патогенных микроорганизмов и их долгосрочной консервации. Экспериментально доказано, что комплекс маркеров аутентичности, включающий биохимическую активность штамма к дифференциально-диагностическим субстратам, структуру и расположение rrn-оперона и профиль рибосомальных белков, обеспечивает создание «молекулярных портретов» микроорганизмов, принадлежащих к 23 родам и 57 видам, позволяющих контролировать их подлинность в процессе хранения и воспроизводства. Разработанные схемы долгосрочной консервации коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов методами лиофилизации и низкотемпературной консервации обеспечивают длительное сохранение их образцов в жизнеспособном состоянии, что подтверждается оценкой выживаемости и жизнеспособности бактериальных клеток, а также рассчитанными прогнозируемыми сроками хранения.
Полученные данные в ходе работы вошли в раздел методических рекомендаций: МР 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности» и МР 4.2.0090-14 «Использование методов полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (рибопринтинг, электрофорез в пульсирующем поле) для идентификации возбудителей I-II групп патогенности», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 24 апреля 2014 г. и 13 мая 2014 г., соответственно. Одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 4 от 9 июня 2015 г.) и утверждены директором института В. В. Кутыревым «Методические рекомендации по установлению аутентичности и систематического положения коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов».
На основе полученных результатов впервые создан каталог аналитических данных,
направленный на установление аутентичности контрольных штаммов, использующихся при
проведении диагностических исследований, для контроля качества медицинских
диагностических и профилактических препаратов, а также пищевых продуктов. Составлены «Методические рекомендации по созданию структуры и заполнению базы данных коллекционных штаммов микроорганизмов на основе программного пакета Bionumerics», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 28.04.2016 г.) и утверждены директором института В. В. Кутыревым.
Для выполнения лиофильного высушивания тест-штаммов патогенных микроорганизмов на современных сублимационных установках камерного и коллекторного типа разработаны методические рекомендации: «Лиофильное высушивание неспорообразующих возбудителей инфекционных заболеваний III-IV групп патогенности на лиофилизаторе Martin Christ»,
одобрены Ученым советом ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 8 от 23 декабря 2010 г.) и
утверждены директором института В. В. Кутыревым; «Лиофильное высушивание
коллекционных штаммов бактерий III-IV групп патогенности на коллекторных лиофилизаторах с холодовым конденсором» одобрены Ученым советом ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 8 от 26 декабря 2012 г.) и утверждены директором института В. В. Кутыревым.
С целью стандартизации процедуры низкотемпературной консервации возбудителей I-IV групп патогенности при температуре минус 70 С, составлены «Методические рекомендации по низкотемпературной консервации возбудителей I-IV групп патогенности при температуре минус 70 С», которые одобрены Ученым советом ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 20 апреля 2012 г.) и утверждены директором института В. В. Кутыревым.
Подготовлены паспорта коллекционных тест-штаммов патогенных микроорганизмов ГКПБ ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», включающие полученные данные о фенотипических и молекулярно-генетических свойствах патогенов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Установленные маркеры аутентичности коллекционных штаммов на основе фенотипических, молекулярно-генетических и протеомных исследований позволяют комплексно проводить родовую, видовую и подвидовую дифференциацию штаммов и контролировать их подлинность на всех этапах цикла воспроизводства.
-
Разработанные алгоритм и единый каталог аналитических данных расширенного спектра фенотипических (ферментативная активность) и молекулярно-биологических (профиль рибосомальных белков и риботип) маркеров обеспечивают достоверное установление аутентичности контрольных штаммов микроорганизмов I-IV групп патогенности.
-
Предложенные схемы долгосрочной консервации патогенных микроорганизмов методами лиофильного высушивания на сублимационных установках камерного, коллекторного типов и низкотемпературного замораживания, обеспечивают длительное хранение образцов в жизнеспособном состоянии и отвечают всем требованиям биологической безопасности.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность изложенных в
диссертационном исследовании положений, выводов и результатов подтверждена
значительным объемом экспериментальных данных с применением современных методических приемов, позволяющих повысить информативность идентификации коллекционных штаммов и сохранить их свойства в течение длительного времени. Интерпретация полученных результатов проведена с использованием методов обработки информации и статистического анализа. Работа проведена на сертифицированном и прошедшем метрологическую поверку оборудовании. Материалы диссертации представлены на X Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», (Москва, 12-13 апреля, 2012 г.); на XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Саратов, 16-17 октября, 2012 г.); на юбилейной научно-практической конференции Уральской противочумной станции 1914-2014 гг. (Уральск, 2014 г.); на VII ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 30
марта – 1 апреля 2015 г.); на итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2-4 мая 2012, 2014 – 2017 г.).
Связь работы с научными программами и личный вклад автора в исследования.
Работа выполнена в отделе «Государственная коллекция патогенных бактерий» ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора в рамках плановой научно-исследовательской темы «Новые диагностические технологии в мониторинге особо опасных инфекционных болезней, индикации возбудителей и расширенном изучении свойств штаммов» (шифр темы 53-2-14, регистрационный номер АААА-А16-116112810064-1). Основные разделы диссертационной работы выполнены лично соискателем на базе отдела «Государственная коллекция патогенных бактерий». Отдельные экспериментальные исследования (п.п 3.3, 3.4 главы 3 диссертационной работы) выполнены на базе отдела диагностики инфекционных болезней ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора совместно с заведующей лабораторией оперативной диагностики, канд. биол. наук С. А. Портенко и науч. сотр. лаборатории молекулярной диагностики, канд. биол. наук А. С. Абдрашитовой.
Публикации результатов исследования. Материалы исследования опубликованы в 10 работах, из них 4 – в периодических изданиях из перечня российских рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 177 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 28 рисунками. Библиографический указатель содержит 88 отечественных и 163 зарубежных источников.
Современные способы консервации бактерий в коллекционных центрах
Классификация, построенная на принципах М. Адансона, - трудоемкий процесс, поэтому свое развитие и практическое применение она получила только с внедрением и применением электронно-вычислительных машин, позволяющих быстро и точно производить большие числовые операции этого метода. Инициатива ее применения принадлежит известному американскому систематику Sneath P. H. A., который в 1957 г. впервые опубликовал данные нумерической таксономии, не позволяющей, в отличие от филогенетической, делать дополнительные выводы, касающиеся эволюции организмов, но обеспечивающей объективную и устойчивую основу для создания таксономических групп [Sneath, 1957]. Большой заслугой этой системы является разработка способа обоснованного отбора из общего комплекса используемых признаков наиболее эффективных в дифференциации и ценных для идентификации тестов, которые позволяют уменьшить ошибки, определяемые штаммовой вариабельностью [Блохина и др., 1992; Леванова и др., 2009]. На сегодняшний день известны уже сотни программ для построения таблиц коэффициента сходства и дендрограмм (кластерного анализа). Одной из таких программ является BioNumerics [Rodas et al., 2005]. Однако невозможно идентифицировать бактерии только по одному из фенотипических признаков, поскольку многие из них подвержены значительной изменчивости [Bergey s Manual, 2005; Chun et al., 2014]. Например, при культивировании микроорганизмов на искусственных средах структура и форма колоний у одной и той же культуры может меняться (Klebsiella pneumoniae); окрашивание по Граму не всегда давать четкую дифференциацию (в культуре грамположительных клеток представителей рода Bacillus могут встречаться грамотрицательные, на результат окрашивания которых влияет возраст культуры и условия её культивирования); способность к спорообразованию может быть утрачена в результате частых пересевов на свежую питательную среду и при неблагоприятных температурных воздействиях; небольшие изменения в составе среды или во внешних условиях иногда вызывают отклонения в биохимических свойствах того или другого микроба, а применяя физиологические признаки микроорганизмов, следует помнить, что они тоже меняются в зависимости от условий роста [Красильников, 1949; Голубева и др., 1985; Блохина и др., 1992; Bergey s Manual, 2005; Rossello-Mora et al., 2001; Stackebrandt, 2006]. Кроме того, для многих медленно растущих и прихотливых организмов (Legionella, Francisella), использование фенотипических признаков вызывает сложности и отнимает много времени [Tang et al., 1998]. В связи с этим, в качестве альтернативы или дополнения к установленным принципам, в середине XX в. А. Н. Белозерским и К. Ли были заложены новые подходы к классификации, основанные на сравнении геномов [Tang et al., 1998; Woese, 1987; Woese et al., 1990; Gevers et al., 2006]. Среди которых наибольшую популярность завоевали: определение нуклеотидного состава ДНК (GC-состав) и степени подобия геномов сопоставляемых штаммов по результатам ДНК-ДНК гибридизации [Wayne et al., 1987; Rossello-Mora, 2005; Moore et al., 2010; Ramasamy et al., 2014]. На основании этих данных для более четкой дифференциации микроорганизмов на уровне рода и вида R. Collwell в 1970 г. был предложен принцип полифазности, основанный на комплексном подходе и интеграции фенотипических, генетических и филогенетических методов их изучения [Colwell, 1970; Citarella, 1970; Vandamme et al., 1996; Prakash et al., 2007; Zhi et al., 2012; Donelli et al., 2013; Chun et al., 2014; Ramasamy et al., 2014]. Анализ GC-состава, проведенный R. Collwell при исследовании 86 бактериальных культур родов Vibrio, Pseudomonas, Spirillum, а также степени подобия их геномов в реакции ДНК-ДНК гибридизации показал, что штаммы, относимые к одному виду на основании фенотипических признаков, имели сходный нуклеотидный состав, и ДНК-ДНК подобие в гибридизации выше 70 % [Colwell, 1970]. Также, с помощью этого подхода в 1974 г. было продемонстрировано филогенетически отдаленное положение представителей Shigella от Escherichia [Colwell et al., 1974]. В результате, эти параметры были введены Международным комитетом по номенклатуре бактерий в 1987 г. в качестве первых молекулярных маркеров [Wayne et al., 1987]. Рекомендовано относить штаммы к одному виду, если они отличаются по составу GC не более чем на 5 %, а значение ДНК-ДНК подобия не менее 70 %, при этом специфичность гибридизации оценивать определением термостабильности гибридных дуплексов [Gevers et al., 2006]. Также, комитет пришел к выводу, что метод ДНК-ДНК гибридизации должен быть эталоном для определения филогении прокариот, так как даёт более четкое разграничение между микроорганизмами [Vandamme et al., 1996; Gevers et al., 2006]. В 2002 г. комитетом был введен новый геномный критерий - гомология генов 16S pPHK, его использование расширяет возможности медицинской диагностики и паспортизации штаммов [Medlin et al., 1988; Fox et al., 1992; Vandamme et al., 1996; Stackebrandt et al., 2002; Stackebrandt et al., 2006; Jenkins et al., 2012; Jolley et al., 2012; Chun et al., 2014; Das et al., 2014]. Согласно принципам полифазной таксономии в настоящее время, по мнению ряда исследователей, выделение новых и ревизия ранее описанных таксонов возможны по трем основным уровням [Gevers et al., 2006; Jolley et al., 2012; Chun et al., 2014; Das et al., 2014]. Все начинается со скрининга штаммов с использованием различных методов (морфологических, биохимических, серологических), позволяющих выявлять наиболее близко связанные штаммы и формировать их в кластеры. Затем, для каждого сформированного ранее кластера штаммов на основании 16S рРНК определяют его филогенетическую позицию [Gevers et al., 2006]. При значении гомологии 16S pPHK изолята и типовых штаммов известных видов, в соответствии с рекомендациями комитета, выше 97 % таксономический статус бактерий должен устанавливаться по результатам ДНК-ДНК гибридизации для определения 70 % порога [Stackebrandt et al., 2002]. Если гомология 16S pPHK менее 97 %, эксперименты по гибридизации являются не обязательными для определения таксономического статуса штамма и его относят к новому виду при наличии диагностического фенотипа [Stackebrandt et al., 2002]. Позже, в 2006 г., на основании анализа дополнительных данных этот параметр был изменен, и к разным видам было рекомендовано относить штаммы с гомологией 16S pPHK менее 99% [Stackebrandt et al., 2006; Gevers D. et al., 2006; Chun et al., 2014]. Это привело к возможности ограниченного использования данных методов для исследования большой выборки микроорганизмов, при условии использования в анализе хорошо изученных референтных штаммов [Stackebrandt et al., 2006; Emerson et al., 2008; Oren et al., 2014; Al-saari et. al., 2015].
Полифазный подход оказал большое влияние на развитие систематики прокариот [Gevers D. et al., 2006; Varghese et al., 2013]. Тем не менее, он имеет свои недостатки: занимает много дополнительного времени и усилий для описания и внесения нового микроорганизма в существующие классификации; многие исследователи склонны пропускать этапы описательной таксономии и предпочитают пользоваться методами одноступенчатой филогенетической таксономии (наиболее распространенной практикой является отнесение изолятов к новому виду исключительно на основе последовательности гена 16S pPHK), что, как следствие, приводит к плохому описанию некоторых видов и отсутствию связей вновь описанных таксонов с уже существующими видами и системами классификаций [Gevers et al., 2006].
Таким образом, из выше изложенного видно, что определение вида прокариот является достаточно сложным процессом [Bergey s Manual, 2005; Rossello-Mora R. et al., 2015]. За всю историю развития систематики, в зависимости от принципов, положенных в основу классификации, микробиологами сформулированы многочисленные его определения [Красильников, 1949; Стейниер и др., 1979; Rossello-Mora et al., 2001; Stackebrandt et al., 2002]. В настоящее время вид микроорганизма определяется как группа штаммов, характеризующая определенной степенью соответствия фенотипических признаков, имеющая между собой: сходство ДНК в ДНК-ДНК гибридизации более 70%, разницу в средней температуре плавления ДНК менее 5 %, разницу в GC- составе менее 5 % в пределах всей геномной ДНК, идентичность последовательности 16S рРНК не менее 99 % [Vandamme et al., 1996; Coenye et al., 2005; Stackebrandt et al., 2006; Gevers et al., 2006; Prakash et al., 2007; Chun et al., 2014; Sarethy et al., 2014; Rossello-Mora R. et al., 2015].
Идентификация микроорганизмов на основании биохимической активности
Для видовой дифференциации коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов проводили изучение их культурально-морфологических, фенотипических и молекулярно-генетических свойств, в соответствии с учебными пособиями по микробиологическим методам исследования и Определителем Берджи [Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, 2004; Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней, 2013; Bergey s Manual, 2005].
Культуральные свойства штаммов определяли путем изучения характера их роста на жидких и плотных питательных средах. Чашки с посевами просматривали сначала невооруженным глазом, затем под микроскопом в проходящем свете с объективом малого увеличения.
Тинкториальные свойства культур определяли путем окрашивания по Граму, щелочным метиленовым синим по Лёффлеру [Голубева и др., 1985; Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, 2004; МУК 4.2.3065-13].
Определение формы и расположения спор в клетке осуществляли с помощью окраски карболовым фуксином по Цилю-Нильсену, капсулу выявляли по способу Бури [Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, 2004].
Подвижность исследуемых штаммов определяли путем посева культуры уколом в столбик полужидкого агара (0,4 %). Подвижные штаммы растут диффузно, вызывая помутнение среды, неподвижные — растут строго по уколу [Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, 2004].
Для определения гемолиза использовали плотную питательную среду с 5 % крови барана, лецитиназной активности – желточно-солевую среду, способность расщеплять лактозу – среду Эндо, глюкозу и лактозу, а также образование сероводорода – среду Клиглера [Голубева и др., 1985; Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, 2004].
Для выявления цитохромоксидазы, культуры переносили на лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченный реактивом для выявления оксидазы (bioMerieux SA, France). Результат реакции учитывали через 2—4 мин.
Идентификацию микроорганизмов проводили путем посева 18 - часовой культуры в пробирки с жидкими средами Гисса, которые содержали 5 мл среды с определенным углеводом (глюкозой, лактозой, мальтозой, сахарозой, арабинозой, ксилозой, рамнозой, маннозой, галактозой, крахмалом), многоатомным спиртом (маннитом, сорбитом) или аминокислотой (лизиндекарбоксилазой, орнитиндекарбоксилазой, аргининдекарбоксилазой). Для изучения ферментации глюкозы, маннита в анаэробных условиях после засева микроорганизма в среду наслаивали 3 мл стерильного вазелинового масла. Учет результатов проводили через 18 - 24 часов. Определение ферментации углеводов штаммов туляремийного микроба проводили в специальной жидкой среде в соответствии с методическими указаниями [Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба, 2007].
В работе использовали 4 набора СИБ (ФГУП «НПО Микроген, Нижний Новгород): набор № 1 для идентификации вибрионов из 13 тестов (СИБ с глюкозой, лактозой, сахаразой, маннозой, арабинозой, инозитом, маннитом, уреазы, аргинином, лизином, орнитином, для определения индола, оксидазы); набор № 2 для межродовой и видовой дифференциации энтеробактерий из 13 тестов (СИБ с инозитом, лизином, малонатом натрия, орнитином, сорбитом, цитратом натрия, для определения -галактозидазы, для определения индола, оксидазы, уреазы, феналаланиндезаминазы, сероводорода, для реакции Фогеса-Проскауэра); набор № 5 для идентификации коринебактерий дифтерии из 4 тестов (СИБ с глюкозой, сахаразой, для определения амилазы, уреазы) и набор № 7 Диски с дифтерийным антитоксином для определения токсигенности коринебактерий дифтерии Работы проводили в соответствии с инструкциями к препаратам.
СИБ-диски помещали в пробирки с соответствующей тесту средой (раствор натрия хлорида (0,9 %) или фосфатно-солевой буфер) с суспендированной в ней суточной агаровой культурой. Инкубировали при температуре, соответствующей нормальному росту исследуемого микроорганизма. Регистрацию результатов производили визуально в соответствии с цветовым показателем. Идентификацию исследуемых культур проводили с использованием таблиц их биохимических свойств определителя Берджи [Bergey s Manual, 2005; Bergey s Manual, 2009].
Работу выполняли с использованием АРI систем (Bio-Mrieux, Франция): API20E (для идентификации Enterobacteriaceae и других неприхотливых грамотрицательных палочек); АРI20NE (для идентификации неприхотливых грамоотрицательных аэробных/микроаэрофильных палочек); АРIStaph (для идентификации стафилококков, микрококков и родственных микроорганизмов); АРIStrep (для идентификации Streptococcaceae и родственных микроорганизмов); АРIListeria (для идентификации бактерий рода Listeria); АРICoryne (для идентификации коринеформных бактерий); АРI50СН (для идентификации бактерий рода Bacillus). Из 18 - 24 часовых культур готовили гомогенную взвесь в суспендиальной среде API плотностью 0,5 – 6 McFarland в зависимости от используемого набора и сразу распределили ее по лункам стрипа, в соответствии с инструкцией производителя [АРI стрипы [сайт] URL: http://www.biomerieux-russia.com/].
Инкубировали при 28 – 37 С в течение 18 – 24 часов. Учет результатов проводили визуально непосредственно или после добавления соответствующих реагентов. Идентификацию осуществляли по числовому профилю при помощи программного обеспечения apiwebTM. Для этого всю последовательность тестов в тест-системе разбивали на триады, в каждой из которых положительно сработавшим тестам присваивали числовые значения: первый тест в триаде – 1, второй тест – 2, третий тест в триаде – 4. Всем отрицательным результатам присваивали 0. Затем суммировали числовые значения в триадах [Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, 2004]. Полученный числовой код соответствует профилю исследуемого микроорганизма (Рисунок 1).
Определение биохимических показателей тест - штаммов патогенных микроорганизмов
При проведении идентификации исследуемых штаммов выявлено, что видовая принадлежность S. marcescens 1, C. freundii 101/57 и P. vulgaris 261 не соответствует паспортным данным. Около 13 % изучаемых штаммов идентифицированы до рода Salmonella и Shigella, в отличие от S. flexneri 17, который при анализе биохимических признаков дает сомнительный профиль видовой принадлежности к E. coli. Окончательную их идентификацию этих штаммов проводили с помощью серологических реакций агглютинации (РА) на стекле с применением коммерческих поливалентных и моновалентных агглютинирующих сывороток, указанных в п.
В результате анализа видовая принадлежность штаммов рода Shigella соответствовала паспортным данным, за исключением штамма S. flexneri 17, который ни с одной шигеллёзной сывороткой не дал положительной реакции и S. dysenteriae 16, определяемый как S. flexneri 3b. Кроме того, при сопоставлении номенклатурных единиц отечественной схемы классификации бактерий рода Shigella (1962 г.), используемой в нашей стране до 1974 г. и на основании которой были идентифицированы изучаемые штаммы, с международной, применяемой в настоящее время, виды S. dysenteriae Shiga и Stutzer-Schmitz – это S. dysenteriae серовар 1 и серовар 2, соответственно, а S. newcastle - S. flexneri VI (Таблица 4).
Для дифференциации бактерий рода Salmonella в соответствии с их антигенной структурой применяли схему Кауфмана – Уайта. По результатам исследования видовая принадлежность изучаемых штаммов этого рода соответствовала паспортным данным (Таблица 5).
В ходе анализа спорообразующих микроорганизмов выявлено, что на основе ферментации 14 субстратов из 49, использующихся в идентификационных API системах бактерий рода Bacillus (API 50 СHB) и дополнительного к нему набора, состоящего из 12 тестов API 20 E: глицерол (GLYC), ксилоза (DXYL), инозитол (INO), маннитол (MAN), лактоза (LAC), мелибиоза (MEL), мелицитоза (MLZ), раффиноза (RAF), тураноза (TUR), тагатоза (TAG), глюконат (GNT), аргинин (ADH), натрия цитрат трехзамещенный (CIT), редукция нитратов (NIT), все тестируемые штаммы рода Bacillus были отнесены к 5 видам: B. cereus, B. subtilis, B. anthracis, B. licheniformis, и B. megaterium (Рисунок 3). Вид по паспорту – видовая принадлежность микроорганизма по паспортным данным, Номер штамма – номер штамма по паспортным данным, Вид в соответствии с apiweb – видовая принадлежность микроорганизма при идентификации его системой API (Bio-Mrieux, Франция), % ИД – относительная вероятность соответствия полученных результатов типичным реакциями каждого организма базы данных apiwebTM
Результаты фенотипического анализа рода Bacillus c применением API системы (Bio-Mrieux, Франция), проведенные в программе BioNumerics v. 7.5 Установлено, что штаммы B. mesentericus 6, B. subtilis 3, 35 и B. subtilis ATCC6633, не являются таковыми и представляют собой бациллы вида B. cereus, а B. mycoides 2 и 10 идентифицированы как B. licheniformis. Штаммы B. megaterium 5, 6, 654 и B. cereus 1 - определены как B. subtilis. Особый интерес вызвал тот факт, что штаммы B. pseudoanthracis 4, 103, 104, B. antracoides 9, 1312 были определены как B. cereus, а B. mesentericus 5, 66, 1227 - B. subtilis, что соответствует современному названию этих видов в систематике рода Bacillus, представленного в последнем издании Bergey s Manual of Systematic Bacteriology.
Полученные ранее результаты по идентификации взятых в исследование референтных штаммов с помощью API-систем указывают на перспективность использования данных об биохимических свойствах патогенов в качестве маркеров их аутентичности, специфичных для вида и обладающих высокой стабильностью при сохранении условий культивирования.
Для подтверждения данного предположения нами была проведена расширенная идентификация коллекционных тест-штаммов патогенных микроорганизмов с применением микробиологического анализатора VITEK 2 Compact (Bio-Mrieux, Франция), где предусмотрено определение ферментативной активности в отношении 40 – 60 субстратов в зависимости от применяемых идентификационных карт.
На основании проведенного анализа и включения полученных сведений в базу данных программного биоинформационного пакета BioNumerics v. 7.5 были подобраны маркеры аутентичности, которые позволяли дифференцировать возбудителя внутри родов Yersinia, Shigella, Salmonella, Plesiomonas, Escherichia, Citrobacter, Serratia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Francisella, Alcaligenes, Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Brucella, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium и Bacillus (Таблица 6).
Разработка алгоритма установления аутентичности и таксономической принадлежности тест-штаммов
При идентификации исследуемых микроорганизмов рода Brucella методом MALDIOF масс-спектрометрии установлены родоспецифичные масс-пики с молекулярными массами 3141,54; 3336,43; 3829,16; 4501,55; 4851,56; 5040,83; 5168,9; 5970,49; 6282,77; 7049,12; 7511,3; 8818,04; 9072,91; 9786,96; 10076,1 Da. Полученные данные белкового профилирования штаммов возбудителя бруцеллеза практически согласуются с результатами работ ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» [Ульшина и др., 2015]. Обнаружены специфичные спектральные паттерны для представителей двух видов: B. melitensis и B. suis (3178,18; 3694,31; 4067,47; 4410,2; 4741,1; 4830,65; 5831,22; 6167,75; 7017,7; 7534,7 Da); для B. melitensis и B. abortus (4538,72; 4896,44; 5133,53; 5187,9; 6567,01; 8990,7; 9815,1; 11206,4 Da), а молекулярная масса пиков B. suis и B. abortus находилась в диапазоне значений 3845,29; 5867,82; 9099,94 Da. Выявлены видоспецифичные масс-пики с коэффициентом интенсивности (количество белков с определенными молекулярными массами) от 50 до 100 %, анализ которых позволил бы при наличии родоспецифичных маркеров провести идентификацию патогенов до уровня вида (Таблица 7). Несмотря на это, штаммы B. suis 1330 и B. abortus 19 BA с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Германия) идентифицированы как B. melitensis, в виду отсутствия их в базе данных анализатора, поставляемых производителем вместе с оборудованием для MALDIOF MS.
При сравнительном анализе белковых паттернов представителей рода Vibrio нами были обнаружены специфичные для V. cholerae спектры, определяющие дополнительные свойства микроорганизмов, в частности определение O1, О139 и non O1/non O139 серогрупп (Таблица 7). В виду отсутствия их в базе данных анализатора, штаммы V. cholerae определены только до вида без учета серогруппы. MALDIOF спектр V. parahaemolyticus содержал около 100 пиков между 2000 и 20 000 Da разной степени интенсивности, но пики, указанные в таблице 7, позволили провести дифференциацию V. parahaemolyticus со штаммами V. cholerae.
При исследовании спектральных паттернов спорообразующих бактерий рода Bacillus нами были отмечены более 50 пиков в диапазоне от 3000 до 11000 Da, с наибольшей их интенсивностью в области масс 3200 - 7800 Da (Таблица 7). При их анализе с помощью модуля «Spectrum type» в программе BioNumerics видно, что спектральные пики с массами 4332,1; 5169,7 Da плохо отделяют штамм B. anthracis от B. cereus. В результате этого, и в виду отсутствия B. anthracis в базе данных масс-спектрометра, штамм сибирской язвы идентифицирован до рода, но отмеченное нами наличие паттерна с молекулярной массой 6260,8 Da позволяет дифференцировать B. anthracis от B. cereus. Интерпретация результатов идентификации исследуемых бактерий рода Bacillus с применением MALDIOF масс-спектрометрии показала, что установленная их видовая принадлежность соответствует данным бактериологического анализа, проведенного с помощью VITEK 2 Compact, за исключением того, что штамм B. megaterium 5 был определен как B. cereus (Таблица 7).
Установленный белковый профиль штамма P. multocida 556 подтверждает его видовую принадлежность в соответствии с паспортными данными на момент поступления культуры в коллекцию. Следует отметить, что данный штамм был идентифицирован микробиологическим анализатором VITEK 2 Compact (Bio-Mrieux, Франция) как P. canis.
При исследовании группы штаммов, входящей в состав семейства Enterobacteriaceae (Yersinia, Shigella, Salmonella, Plesiomonas, Escherichia, Citrobacter, Serratia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus) были определены маркеры спектральных пиков (4185,61 и 8368,23 Da), соответствующих семейству, а также определенным родам и видам. Таким образом, выявлены маркеры, соответствующие роду Yersinia (4831,8; 5428,4; 6238,4 Da) и его видам: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica (Таблица 7). Кроме того, были отмечены общие пики для Y. pestis и Y. pseudotuberculosis со значениями 4831,8; 9659,9 Da.
Анализируемые микроорганизмы рода Shigella были определены как E. coli с коэффициентом соответствия более 2,2 (Таблица 7). Полученный результат можно объяснить наличием общих культурально-морфологических и биохимических свойств, присутствием родоспецифичных и перекрестно реагирующих антигенов, а также сходного белкового профиля [Cherkaoi et al., 2010; Silipo et al., 2002; Mellmann et al., 2008; van Venn et al., 2010; Seibold et al., 2010; Lasch et al., 2009; Ferreira et al., 2010; Hazen et al., 2009].
Представители Salmonella ser. typi, ser. enteritidis и ser. paratyphi были достоверно идентифицированы анализатором MicroFlexТМ LT MALDIOF (Bruker Daltonics, Германия) до рода на основании родоспецифичных спектральных пиков (4764,6; 5379,1; 6255,5; 6315,3 Da). Тем не менее, нами отмечены масс - пики, позволяющие определить серотип исследуемых микроорганизмов (Таблица 7) и кроме того, следует отметить, что S. ser. typhimurim и S. ser. dublin были идентифицированы анализатором до серотипа с индексом достоверности 2,3.
Что касается других представителей семейства Enterobacteriaceae (Citrobacter, Enterobacter, Proteus, Serratia), то при изучении их масс-спектров, у трех штаммов (C. freundii 101/57, P. vulgaris 261, S. marcescens 1) видовая принадлежность по паспортным данным не была подтверждена. Так, штамм C. freundii 101/57 принадлежал к C. braakii, P. vulgaris 261– P. mirabilis, а S. marcescens 1 - к S. plymutica (Таблица 7). Такая же идентификация этих культур была и при использовании бактериологического метода.
Результаты исследования бактерии родов Listeria методом MALDIOF масс-спектрометрии были идентичны данным, полученных при использовании бактериологического анализатора. (Таблица 7). На основании полученного белкового профиля штамм L. murrayi был отнесен к виду L. grayi, что согласуется с систематикой рода Listeria, представленной в последнем издании Bergey s Manual of Systematic Bacteriology (Таблица 7).