Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 23
1.1. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации 23
1.2. Основные эпидемиологические показатели по туберкулезу на территории Владимирской области 28
1.3. Противотуберкулезные препараты 33
1.3.1. Противотуберкулезные препараты первого ряда 33
1.3.2. Противотуберкулезные препараты второго ряда 36
1.4. Методы определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis 38
1.5. Методология определения критических концентраций
противотуберкулезных препаратов 44
Результаты собственных исследований 51
ГЛАВА 2. Характеристика лекарственной чувствительности штаммов M.tuberculosis, выделенных от больных на территории владимирской области в 2010-2015 гг 51
ГЛАВА 3. Определение Минимальных ингибирующих концентраций
циклосерина и ПАСК в жидкой среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTEC
MGIT 960 64
3.1. Определение минимальных ингибирующих концентраций циклосерина в жидкой среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTEC MGIT960 штаммов M.tuberculosis, чувствительных к циклосерину по ТЛЧ на плотной среде 65
3.2. Определение минимальных ингибирующих концентраций циклосерина в жидкой среде на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, устойчивых к циклосерину по ТЛЧ на плотной среде
3.3. Определение минимальных ингибирующих концентраций ПАСК в жидкой среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, чувствительных к ПАСК по ТЛЧ на плотной среде 74
3.4. Определение минимальных ингибирующих концентраций ПАСК в жидкой среде на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis,
устойчивых к ПАСК по ТЛЧ на плотной среде 79
ГЛАВА 4. Определение критических концентраций циклосерина и ПАСК для тестирования лекарственной чувствительности M.tuberculosis методом пропорций при культивировании в жидкой среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTEC MGIT 960 83
4.1. Определение критической концентрации циклосерина 83
4.2. Определение критической концентрации ПАСК 85
Заключение 87
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Перспективы дальнейшей разработки темы 99
Список сокращений 100
Список литературы 101
- Противотуберкулезные препараты
- Противотуберкулезные препараты второго ряда
- Определение минимальных ингибирующих концентраций циклосерина в жидкой среде на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, устойчивых к циклосерину по ТЛЧ на плотной среде
- Определение критической концентрации ПАСК
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Туберкулез многие годы остается одной из глобальных проблем здравоохранения мирового сообщества и занимает второе место среди причин смерти от инфекционных заболеваний в мире после вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).Необходимо отметить, что туберкулез, вызванный чувствительными к противотуберкулезным препаратам микобактериями, излечивается в большинстве случаев, тогда как вызванный лекарственно-устойчивыми микобактериями требует особого отношения как в плане диагностики, так и по интенсивности, срокам и стоимости лечения. Подсчитано, что в среднем в 15 странах Евросоюза плюс Кипр, Мальта и Словения стоимость лечения лекарственно-чувствительных форм туберкулеза составляет 10282, тогда как затраты на лечение форм туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью составляют 57213 и 170744, соответственно (R.Dieletal., 2014).
В последние два десятилетия в Российской Федерации сохраняется напряженная эпидемиологическая ситуация по туберкулезу, а также продолжается рост лекарственно-устойчивого туберкулеза среди впервые выявленных и ранее леченных больных (O.S.Toungoussovaetal., 2005;Y. Balabanovaetal., 2005; О.Б. Нечаева, 2016).
Адекватный результат лечения лекарственно-устойчивых форм туберкулеза может быть достигнут за счет введения в стандартные режимы химиотерапии антибактериальных препаратов из числа резервных лекарственных средств – циклосерина и пара-аминосалициловой кислоты (ПАСК). При этом исход лечения во многом зависит от времени начала лечения: эффективность химиотерапии существенно повышается при назначении препаратов, определенных по результатам исследования чувствительности культур M.tuberculosis, в активную фазу химиотерапии (В.Ю. Мишин, 2003;WHO, 2008; И.А. Васильева и др., 2011;IUTLD, 2013; C.Langeetal., 2014).
В настоящее время ВОЗ рекомендованы критические концентрации почти для
всех противотуберкулезных препаратов при определении лекарственной
чувствительности на плотных и жидких питательных средах. Однако, чувствительность к циклосерину и ПАСК определяется только традиционным методом абсолютных концентраций на плотных питательных средах, что значительно удлиняет сроки получения клиницистами результатов анализа и коррекции схемы лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью препаратами второго ряда (WHO, 2012).
Необходимость совершенствования метода детекции лекарственной
чувствительности к резервным противотуберкулезным препаратам определяет
актуальность проведенного исследования. Установление критических концентраций для циклосерина и ПАСК позволит проводить ускоренное определение лекарственной чувствительности методом пропорций в жидкой среде на автоматизированном анализаторе учета роста микобактерий BACTEC MGIT 960.
Степень разработанности темы исследования
Определение чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным на
плотных питательных средах широко применяется в РФ в клинико-диагностических
лабораториях фтизиатрического профиля с момента появления первых
противотуберкулезных препаратов, а критические концентрации для метода абсолютных концентраций на плотных питательных средах регламентированы в Приказе МЗ РФ №109 от 21 марта 2003 г. Внедрение в лабораторную практику системы BACTECMGIT 960, позволяющей существенно сократить сроки культуральной диагностики, потребовало разработки адекватных для данной системы критических
концентраций для противотуберкулезных препаратов. В результате мультицентровых
исследований, проведенных по 3-этапному протоколу, рекомендованному Институтом
по клиническим и лабораторным стандартам, США
(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute, CLSI) при установлении критических
концентраций (G.E.Pfyfferetal., 2011), были отработаны критические концентрации для 5-ти препаратов 1 ряда и 9-ти препаратов 2 ряда (G. E. Pfyfferetal., 1999; S. Rusch-Gerdesetal., 2006; C. Rodriguesetal., 2008; K.M. Kametal., 2010; M. Sharmaetal., 2011; H. Kimetal., 2013; WHO, 2012). Однако, для циклосерина и ПАСК критические концентрации для проведения теста лекарственной чувствительности методом пропорций в системе BACTECMGIT 960 до сих пор не отработаны, несмотря на предпринятые рядом исследователей попытки (C. Rodriguesetal., 2008; M. Sharmaetal., 2011; H. Kimetal., 2013).
Цель работы:Совершенствование ускоренного определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам второго ряда -циклосерину и ПАСК.
Задачи исследования:
1. Изучить чувствительность к противотуберкулезным препаратам методом
абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена или методом
пропорций в жидкой среде использованных в работе штаммов M.tuberculosis,
выделенных от пациентов из Владимирской области в 2010 - 2015 гг.
2. Создать рабочую коллекцию клинических изолятов M.tuberculosis с
лекарственной устойчивостью/чувствительностью к циклосерину и ПАСК по
результатам тестирования лекарственной чувствительности на плотной среде
Левенштейна-Йенсена.
-
Определить минимальные ингибирующие концентрации циклосерина и ПАСК в жидкой среде Middlebrook 7Н9 на анализаторе BACTECMGIT 960 у штаммов M.tuberculosis с лекарственной устойчивостью/чувствительностью к циклосерину и ПАСК, установленной по результатам теста лекарственной чувствительности на плотной среде Левенштейна-Йенсена.
-
Установить критические концентрации циклосерина и ПАСК для ускоренного тестирования устойчивости/чувствительности штаммов M.tuberculosis методом пропорций в жидкой среде Middlebrook 7Н9 на анализаторе BACTECMGIT 960.
Научная новизна исследования
На основании проведенного исследования охарактеризован спектр лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам популяции современных штаммов M.tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза и рецидивами во Владимирской области в 2010-2015 гг., который представлен 43 вариантами профилей резистентности. Шесть профилей (HRE, HRECap, HRECapKan, HRECapOfl, HRECapKanOfl и HRECapKanOflCsPas) были наиболее распространены и относились к категории множественной или широкой лекарственной устойчивости. При этом циклосерин и ПАСК входили в структуру только одного из этих профилей, представленного 8-ю препаратами, который встречался у 5,22% исследованных штаммов.
Получены данные о степени чувствительности к циклосерину и ПАСК (по определению минимальных ингибирующих концентраций в жидкой среде Middlebrook 7H9) современных штаммов M.tuberculosis, циркулирующих во Владимирской области. Показано, что диапазон минимальных ингибирующих концентраций для штаммов
M.tuberculosis, чувствительных к циклосерину, составлял 4-15 мкг/мл, устойчивых к циклосерину - 20-40 мкг/мл, чувствительных к ПАСК - 0,5-2 мкг/мл, устойчивых к ПАСК - от 4 и до более 40 мкг/мл.
Впервые на коллекции региональных штаммов M.tuberculosis с множественной
или широкой лекарственной устойчивостью проанализировано сочетание
чувствительности/устойчивости к препаратам резервного ряда и показано, что 84,48% штаммов были чувствительны к циклосерину и 84,08% штаммов чувствительны к ПАСК, что обосновывает перспективы применения этих антибиотиков для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза.
Для проведения ускоренного теста лекарственной чувствительности
M.tuberculosis к различным противотуберкулезным препаратам методом пропорций в жидкой среде Middlebrook 7H9 на BACTEC MGIT 960 впервые разработаны критические концентрации циклосерина (15,0 мкг/мл) и ПАСК (2,0 мкг/мл), что будет способствовать ускорению получения результатов теста, по сравнению с традиционным методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена.
Показано, что критические концентрации циклосерина и ПАСК, используемые при определении лекарственной чувствительности на плотных и жидких питательных средах, отличаются. Установленные для жидкой среды Middlebrook 7H9 критическая концентрация циклосерина (15 мкг/мл) была в 2 раза ниже и ПАСК (2 мкг/мл) в 2 раза выше, чем концентрации этих препаратов, применяемые при постановке тестов лекарственной чувствительности методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена (30 мкг/мл и 1,0 мкг/мл, соответственно). Учитывая, что метод пропорций является более точным для детекции устойчивости, полученные данные свидетельствуют о перспективности и целесообразности применения культивирования M.tuberculosis в жидкой питательной среде в системе BACTECMGIT 960 в практическом здравоохранении.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные о характере резистентности M.tuberculosis формируют подходы к пониманию эволюции возбудителя в развитии резистентности к противотуберкулезным препаратам второго ряда.
Результаты по спектру и уровню резистентности к циклосерину и ПАСК штаммов M.tuberculosis могут быть использованы в рамках эпидемиологического надзора для изучения нарастания резистентности штаммов M.tuberculosis, циркулирующих в регионе, и прогнозирования временных тенденций ее дальнейшего распространения.
Полученные в исследовании данные указывают на накопление в регионе бациллярного ядра хронических форм туберкулеза с широким спектром резистентности, что, в перспективе, может негативно отразиться на эпидемиологической ситуации по туберкулезу.
Разработанные методологические подходы для определения критических концентраций циклосерина и ПАСК для проведения тестов лекарственной чувствительности штаммов M.tuberculosis в системе BACTECMGIT 960 могут быть применены для определения критических концентраций других противотуберкулезных препаратов.
Разработка критических концентраций циклосерина и ПАСК расширила возможности ускоренного тестирования лекарственной чувствительности одновременно ко всему спектру противотуберкулезных препаратов второго ряда методом пропорций в
жидкой среде на анализаторе BACTECMGIT 960, что значительно повышает эффективность лечения туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью за счет сокращения сроков тестирования чувствительности и начала адекватной химиотерапии.
Назначение схемы лечения согласно результатам тестов лекарственной чувствительности предотвращает развитие резистентности и распространение штаммов M.tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, что особенно актуально в настоящее время.
Собрана рабочая коллекция клинических изолятовM.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам 1 и 2 ряда, в том числе к препаратам резервного ряда – циклосерину и ПАСК, которая может быть использована для изучения механизмов развития резистентности к этим препаратам, создания молекулярно-генетических тест-систем для диагностики устойчивого туберкулеза, а также тестирования противотуберкулезной активности вновь синтезированных лекарственных препаратов.
Данные, полученные в диссертационной работе, используются в курсе лекций по
современным методам микробиологической диагностики в Учебном центре ФГБНУ
"Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" (акт о внедрении от
21.12.2016 г.), на кафедре фтизиатрии лечебного факультета ФГБОУ ВО"Российский
национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова"
Минздрава России (акт о внедрении от 13.03.2017 г.), на межфакультетской кафедре
фтизиопульмонологии ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-
стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Минздрава России (акт о внедрении от 09.03.2017 г.). В отделе фтизиатрии и детско-подростковом отделе ФГБНУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" для повышения эффективности лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью за счет ускоренного тестирования лекарственной чувствительности к резервным препаратам.
Методология и методы исследования
Методология настоящего исследования спланирована исходя из современных методов научного познания и организована согласно поставленной цели, для достижения которой были сформированы подходы и назначены ориентиры в проведении исследования, выбраны средства и методы, поставлены задачи, определяющие наилучший результат. Анализ научной литературы, посвященный проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. В работе использованы классические и современные микробиологические методы исследования.
ШтаммыM.tuberculosis
Предметом данного исследования стали 230 культур M.tuberculosis, полученные в результате первичного посева патологического материала на плотные и жидкие питательные среды. Культуры были получены от 230 больных туберкулезом, преимущественно с подозрением на рецидив или с хроническим течением туберкулеза, ранее леченых пациентов, в том числе исследуемыми препаратами, находящихся в 2010-2015 годах на лечении вГБУЗ Владимирской области "Областной противотуберкулезный диспансер" (г. Владимир) и в двух районных противотуберкулезных стационарах:ГБУЗ Владимирской области "Ковровский противотуберкулезный диспансер" (г. Ковров,) и ГБУЗ Владимирской области "Муромский противотуберкулезный диспансер" (г. Муром) - на данный момент единое учреждение ГБУЗ Владимирской области "Центр
специализированной фтизиопульмонологической помощи". Также материал для исследования поступал из противотуберкулезного отделения ГКУЗ Владимирской области "Областная психиатрическая больница №2" (п. Содышка), ГБУЗ Владимирской области "Патакинская областная противотуберкулезная больница" (с. Патакино) и детского отделенияна базе ГБУЗ Владимирской области "Городская больница №2 г. Владимира" (г. Владимир).
Микробиологические методы
Для получения чистой культуры из диагностического материала использовали два метода – посев на плотные яичные питательные среды Левенштейна-Йенсена(Л-Й) и Финна-II и посев в жидкую среду Middlebrook 7H9 c последующей инкубацией в системе для автоматизированного учета роста микобактерий BACTEC MGIT 960. Все работы осуществляли согласно Приказа МЗ РФ №109 от 21 марта 2003 г. и Руководства по работе с системой BACTECMGIT 960.
Определение лекарственной чувствительности исследованных штаммов
M.tuberculosisк изониазиду, рифампицину, этамбутолу, офлоксацину, капреомицину, канамицину проводили или методом абсолютных концентраций на среде Л-Й (критические концентрации: изониазид - 1.0 мкг/мл, рифампицин - 40.0 мкг/мл, этамбутол - 2.0 мкг/мл, офлоксацин - 2.0 мкг/мл, капреомицин - 50.0 мкг/мл, канамицин - 30.0 мкг/мл) или модифицированным методом пропорций в системе BACTEC MGIT 960 (критические концентрации: изониазид - 0.1, рифампицин - 1.0, этамбутол - 5.0, канамицин - 2.5, капреомицин - 2.5, офлоксацин -2.0).Чувствительность к циклосерину и ПАСК для всех культур была определена методом абсолютных концентраций на среде Л-Й (критические концентрации: циклосерин - 30.0 мкг/мл и ПАСК - 1.0 мкг/мл).
Для проведения исследований invitro использовали фармакопейные субстанции циклосерина(Sigma-Aldrich, Китай) и p-аминосалициловой кислоты (Sigma-Aldrich, Китай).
Статистические методы
При обработке данных применяли методы описательной статистики. Все расчеты проведены с использованием программного пакета MS Office Excell.
Личный вклад автора в получение результатов
Сбор и анализ материалов специальной литературы, составление плана исследования, культуральные исследования, статистическая обработка и систематизация результатов работы были проведены лично автором. На основе анализа полученных лично данных автор сформулировала выводы и практические рекомендации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Рабочая коллекция штаммов M.tuberculosis(n=230) включала штаммы с
профилями лекарственной чувствительности с разным числом и сочетанием
противотуберкулезных препаратов (7,39% чувствительных, 92,61% устойчивых к
противотуберкулезным препаратам со спектром устойчивости от 1 до 8
противотуберкулезных препаратов); исследуемые четыре группы штаммов
сформированы на основании анализа результатов тестов лекарственной
чувствительности циклосерина и ПАСК на плотной среде Левенштейна-Йенсена:
чувствительных к циклосерину (n=170), устойчивых к циклосерину (n=56);
чувствительных к ПАСК (n=151) и устойчивых к ПАСК (n=73).
2. Минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост 100% штаммов
M.tuberculosis на жидкой среде Middlebrook 7H9,для штаммов, устойчивых по тестам
лекарственной чувствительности на плотной среде к циклосерину, составила 40 мкг/мл;
чувствительных к циклосерину - 15 мкг/мл; устойчивых к ПАСК - более 40 мкг/мл; чувствительных к ПАСК - 2 мкг/мл.
3. Установлены критические концентрации циклосерина - 15.0 мкг/мл, ПАСК -2.0 мкг/мл для ускоренного тестирования лекарственной чувствительностиM.tuberculosis методом пропорций в жидкой среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTECMGIT 960.
Степень достоверности и апробация результатов
О достоверности результатов работы свидетельствует использование
сертифицированных микробиологических методов исследования, характеризующихся высокой чувствительностью и специфичностью. Проведен достаточный объем исследований: работа выполнена с использованием 230 культурM.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких и внелегочной локализации. Для выполнения задачи исследования - поиска критических концентраций циклосерина и ПАСК при культивировании в жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTEC MGIT 960, был использован подход, утвержденный Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (США).
Результаты исследований были представлены и обсуждены наРоссийской
научно-практической конференции молодых ученых с международным участием
«Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2012, 2013 и 2015); на XIX Форуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2015); на секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно- практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (21 декабря 2015 г.), на еженедельной конференции научных сотрудников и врачей ЦНИИТ (20 июня 2016 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьиопубликованы в рецензируемых научных изданиях, 4 - в материалах конференций.
Структура и объем диссертации
Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного текста и
состоит из введения, обзора литературы, 3 глав описания результатов собственных
исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспективы
дальнейшей разработки темы, списка сокращений и списка литературы.
Библиографический указатель включает 136 источников литературы, из них 39 работ отечественных и 97 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и 18 таблицами.
Противотуберкулезные препараты
Социально-обусловленные инфекции (туберкулез, ВИЧ, инфекции передаваемые половым путем) в структуре инфекционных болезней (без учёта ОРВИ) во Владимирской области в 2015 году составили 4,8% [17].
В 2015 г. по пораженности постоянного населения туберкулезом субъект занимал 15 место среди 85 субъектов Российской Федерации (2014 г. – 8 место) и 10 место среди 18 субъектов Центрального Федерального округа [23]. Основные эпидемиологические показатели по туберкулезу в области сохраняют положительную динамику. Заболеваемость туберкулезом населения гражданского сектора в 2015 году составила 36,3 на 100 тысяч, в 2014 г. - 36,6 на 100 тысяч, в 2013 г. - 35,2 на 100 тысяч, последние 2 года отмечается стабилизация показателей заболеваемости туберкулезом среди населения, проживающего на территории Владимирской области, что ниже, чем в среднем по России (47,0 на 100 000 населения), но выше, чем в Центральном ФО (26,7 на 100 000 населения). Показатель регистрируемой заболеваемости туберкулезом в 2015 г. (включая пенитенциарный сектор) составил 46,2 на 100 000 населения (2014 г. – 50,9).
Заболеваемость детей до 17 лет включительно снизилась на 5,9% и составила 13,69 на 100 000 детей данного возраста, в 2015г. зарегистрировано 34 случая, в 2014г. - 36 случаев, в 2013г. – 35 случаев. Бациллярные формы туберкулеза выявлены у 3-х детей из 34 (2014г. – не регистрировались).
Рецидивы ТБ в 2015 г. регистрировались в 7,5 случаев на 100 000 населения (2014 г. – 8,9). Этот показатель во Владимирской области на 23,5% ниже, чем в среднем по России (9,8 на 100 000 населения) и на 41,5% выше, чем в среднем по Центральному федеральному округу (5,3 на 100 000 населения).
Распространенность туберкулеза во Владимирской области на окончание 2015 года составил 67,4 на 100 000 населения (2014 г. – 73,5). Распространенность туберкулеза в области на 47,8% ниже, чем в целом по России (129,1 на 100 000 населения) и на 1,6% ниже, чем в среднем по Центральному федеральному округу (69,0 на 100 000 населения).
Распространенность МЛУ ТБ в 2015 году составила 17,3 на 100 000 населения (РФ – 25,5; ФО – 11,5). Среди впервые выявленных больных МЛУ ТБ был зарегистрирован в 4,9 случаев на 100 000 населения (РФ – 5,2; ФО – 2,5). Доля больных с МЛУ ТБ среди бактериовыделителей, состоящих на учете на конец 2015 года, составила 49,9% (РФ – 47,5%; ФО – 42,3%), среди впервые выявленных больных – 22,3% (РФ – 23,0%; ФО – 18,3%).
Смертности от туберкулеза во Владимирской области в 2015 г. была зарегистрирована в 5,2 случаях на 100 000 населения (2014 г. – 5,9). Этот показатель в субъекте на 43,5% ниже, чем в целом по России (9,2 на 100 000 населения) и на 15,6% выше, чем в Центральном федеральном округе (4,5 на 100 000 населения).
Эффективность лечения больных туберкулезом органов дыхания у впервые выявленных больных, характеризовалась закрытием полостей распада у 68,1% больных (РФ – 61,8%; ФО – 64,9%), прекращением бактериовыделения у 77,0% больных (РФ – 69,7%; ФО – 75,0%). Среди больных с рецидивами эффективность терапии была несколько ниже: закрытие полостей распада - у 50,0% пациентов (РФ – 41,0%; ФО – 41,3%), прекращение бактериовыделения - у 51,7% пациентов (РФ – 47,4%; ФО – 52,6%). При диспансерном наблюдении клиническое излечение пациентов с туберкулезом регистрировалось в 49,0% случаев (РФ – 35,7%; ФО – 40,1%), абациллирование – в 64,1% случаев (РФ – 46,6%; ФО – 53,9%) [17, 20].
Противотуберкулезные препараты второго ряда
Определение спектра чувствительности МБТ к ПТП крайне важно как для разработки индивидуализированного курса химиотерапии и контроля его эффективности с коррекцией по необходимости, так и для проведения эпидемиологических исследований, заключающихся в мониторинге лекарственной чувствительности МБТ, циркулирующих в пределах исследуемой территории. В настоящее время в практике противотуберкулезных бактериологических лабораторий применяется большое число методов определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБТ, которые, как правило, разделяются на фенотипические (исследование роста МБТ in vitro в присутствии конкретного препарата) и генотипические (поиск генетических детерминант устойчивости) [25, 26, 32, 33, 52, 89, 133].
При определении фенотипической ЛЧ МБТ применяются плотные яичные и агаровые среды, такие как среда Левенштейна-Йенсена, Финн-II, Middlebrook агар и жидкие питательные среды, например, Middlebrook 7H9 [25, 26, 32, 67, 72].
Тест для определения лекарственной чувствительности МБТ бывает двух видов – прямой и непрямой. При проведении прямого теста на среды, содержащие ПТП, засевается непосредственно патологический материал. Преимуществом данного подхода является выигрыш во времени получения результата, однако применение этого теста возможно только в том случае, если в исследуемом материале содержится массивный пул МБТ, который можно выявить на мазке. К тому же при посеве диагностического материала, даже прошедшего деконтаминацию, всегда существует риск роста неспецифической флоры.
Учитывая вышеперечисленные недостатки прямых тестов лекарственной чувствительности (ТЛЧ), в настоящее время преимущественно используется непрямой метод, когда для исследования используются предварительно выделенные из диагностического материала культуры МБТ. В международной практике используются следующие разновидности метода: – метод абсолютных концентраций на яичной плотной питательной среде (ППС) Левенштейна-Йенсена и Финн-II [1, 25, 26]; – метод пропорций на ППС [25, 32], – модифицированный метод пропорций на жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов [1, 26, 67]; – метод коэффициента резистентности [53, 72].
В РФ исторически в лабораторной практике ЛЧ МБТ преимущественно определяют методом абсолютных концентраций на ППС. Метод абсолютных (или предельных) концентраций заключается в выращивании микобактерий на питательных средах, которые содержат противотуберкулезные препараты в рекомендуемых концентрациях. ВОЗ в качестве международного стандарта для постановки данной разновидности ТЛЧ рекомендована ППС Левенштейна-Йенсена без крахмала. Учет результатов определения ЛЧ этим методом возможен через 3 недели по наличию/отсутствию видимого роста культуры МБТ в тестовых пробирках при наличии обильного роста в контроле без препарата. Основным недостатком метода является длительность получения результатов, а также то, что его невозможно применять для термолабильных препаратов из-за этапа свертывания среды при высоких температурах в процессе приготовления.
В ряде случаев для определения лекарственной чувствительности МБТ применяются жидкие питательные среды [1, 23, 36]. В качестве жидкой питательной среды для культивирования МБТ используется среда Middlebrook 7Н9 [13, 25, 54, 72, 85, 104, 124]. Оценка роста культуры МБТ проводится по изменению оптической плотности образцов, что позволяет определить не только степень ингибирования роста культуры, но и оценить динамику роста.
В 1969 г. F.H. Deland и R.N. Wagner была разработана методика, позволяющая оценивать метаболизм бактерий за счет измерения количества СО2, выделенного в процессе роста культуры, и декарбоксилирования входящего в состав питательной среды субстрата класса C [57]. Широко применяемый исходно для гемокультур, этот радиометрический способ регистрации роста с использованием анализатора ВАСТЕС 460 ТВ, в 1980 г. был внедрен для выявления МБТ в клинических образцах, а также для постановки ТЛЧ. Клинические испытания по сравнению результатов, полученных с использованием радиометрического анализатора ВАСТЕС 460 ТВ, и ППС, как для первичного посева, так и для тестов на лекарственную чувствительность, продемонстрировали, что применение ВАСТЕС 460 ТВ приводит к значительному сокращению сроков получения результатов анализа (8-14 дней по сравнению с 3-5 неделями для ППС) и повышает выявляемость ТБ на 15-20% по сравнению с ППС, что особенно четко прослеживается для негативных по мазку образцов [69, 84, 90, 91, 96].
Следовательно, внедрение анализатора ВАСТЕС 460 ТВ стало прорывом в лабораторной диагностике туберкулеза, продемонстрировав, что жидкая питательная среда существенно превосходит ППС по срокам и по чувствительности как при выявлении микобактерий, так и при постановке тестов на ЛЧ. Кроме того, был описан ряд случаев, когда рост микобактерий фиксировался только на жидкой среде [110]. Это позволило Центру контроля и профилактики заболеваний (CDC) в 1993 г. рекомендовать для выявления микобактерий в диагностическом материале параллельное использование жидкой и плотной среды [117].
Несмотря на то, что постановка ТЛЧ МБТ к ПТП 1 и 2 ряда с использованием радиометрической системы BACTEC 460, хорошо зарекомендовала себя и долгое время считалась «золотым стандартом», возрастала обеспокоенность по поводу использования и захоронения радиоактивных материалов, применяемых при использовании данной технологии. Это послужило предпосылкой для разработки нерадиометрической методики, которая была предложена компанией Becton & Dickinson (BD). В ее основу легла индикаторная пробирка для выращивания микобактерий - Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT). Данный подход позволил не использовать радиометрию и, при этом, обеспечивать столь же точные, быстрые и надежные результаты тестирования, как и ВАСТЕС 460 ТВ [68, 106].
Культивирование МБТ в пробирках MGIT осуществляется в жидкой питательной среде, представляющей собой модифицированную среду Middlebrook 7Н9. На дне пробирки находится индикатор, реагирующий на содержание в пробирке кислорода. При потреблении кислорода и выделении углекислого газа в процессе роста микобактерий возникает флюоресценция, которая автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС MGIT 960.
Таким образом, анализатор ВАСТЕС MGIT 960 является полностью автоматизированной системой, предназначенной для роста и детекции МБТ, а также для проведения ТЛЧ. В настоящее время система ВАСТЕС MGIT 960 является «золотым стандартом» для осуществления посевов и тестов на лекарственную чувствительность и применяется в трех четвертях (74%) всех стран мира [46, 63, 71, 87, 92, 101, 111, 118, 133].
Определение минимальных ингибирующих концентраций циклосерина в жидкой среде на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, устойчивых к циклосерину по ТЛЧ на плотной среде
Как видно из таблицы 11, минимальной ингибирующей концентрацией циклосерина в системе BACTEC MGIT 960 для 7-ми из 170 штаммов (4,12%), чувствительных к циклосерину по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена, была 4 мкг/мл, для 37 (21,76%) штаммов - 8 мкг/мл, для 70 41,18%) штаммов - 10 мкг/мл, для оставшихся 56 (32,94%) штаммов МИК составила 15 мкг/мл. Протестированные концентрации циклосерина в диапазоне от 20 до 50 мкг/мл ни для одного из 170-ти штаммов МБТ, чувствительных к циклосерину по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена, не были минимальными ингибирующими.
В целом, было показано, что из 170 чувствительных к циклосерину по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена штаммов МБТ к 4 мкг/мл было чувствительно 7 (4,12%) штаммов, к 8 мкг/мл - 44 штамма (25,88%), к 10 мкг/мл - 114 (67,06%) штаммов, к 15 мкг/мл и выше - 170 (100%) штаммов (рисунок 7).
Лекарственная чувствительность к тестируемым концентрациям циклосерина и МИК циклосерина для штаммов МБТ, чувствительных к циклосерину по данным референс-метода Таким образом, минимальной концентрацией, подавляющей рост не менее 50% чувствительных штаммов (МИК(50)) была 10 мкг/мл, для 100% штаммов -МИК(100) - 15 мкг/мл. Следовательно, все штаммы, чувствительные к циклосерину по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена, в системе BACTEC MGIT 960 были чувствительны к циклосерину в диапазоне концентраций от 15 до 50 мкг/мл.
Определение минимальных ингибирующих концентраций циклосерина в жидкой среде на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, устойчивых к циклосерину по ТЛЧ на плотной среде
Результаты определения чувствительности к 8-ми концентрациям циклосерина (4.0; 8.0; 10.0; 15.0; 20.0; 30.0; 40.0; 50.0 мкг/мл) штаммов МБТ, устойчивых к циклосерину по результатам ТЛЧ на ППС Левенштейна-Йенсена, представлены в таблице 12.
В целом, было показано, что из 56 устойчивых к циклосерину по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена штаммов МБТ к 20 мкг/мл было чувствительно 14 (25,00%) штаммов, к 30 мкг/мл - 45 штаммов (80,36%), к 40 мкг/мл и 50 мкг/мл - 56 (100%) штаммов (рисунок 8).
Лекарственная чувствительность к тестируемым концентрациям циклосерина и МИК циклосерина для исследуемых штаммов МБТ, устойчивых к циклосерину по данным референс-метода Таким образом, МИК(50) для штаммов, устойчивых к циклосерину по результатам ТЛЧ на ППС была 30 мкг/мл, МИК(100) - 40 мкг/мл. Определение минимальных ингибирующих концентраций ПАСК в жидкой среде Middlebrook 7H9 на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, чувствительных к ПАСК по ТЛЧ на плотной среде
Результаты определения чувствительности к 7-ми концентрациям ПАСК (0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0; 20.0; 40.0 мкг/мл) штаммов МБТ, чувствительных к ПАСК по результатам ТЛЧ на ППС Левенштейна-Йенсена, представлены в таблице 13.
Как видно из таблицы 13, минимальной ингибирующей концентрацией ПАСК в системе BACTEC MGIT 960 для 80-ти из 151 штамма (52,98%), чувствительных к ПАСК по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна 78
Йенсена, была 0,5 мкг/мл, для 49 (32,45%) штаммов - 1 мкг/мл, для оставшихся 22 (14,57%) штаммов МИК составила 2 мкг/мл. Протестированные концентрации ПАСК в диапазоне от 4 до 40 мкг/мл ни для одного из 151-го штамма МБТ, чувствительных к ПАСК по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена, не были минимальными ингибирующими.
В целом, было показано, что из 151 чувствительного к ПАСК по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена штамма МБТ к 0,5 мкг/мл было чувствительно 80 (52,98%) штаммов, к 1 мкг/мл - 129 штамма (85,43%), к 2 мкг/мл и выше - 151 (100%) штаммов (рисунок 9). Таким образом, МИК(50) для штаммов, чувствительных к ПАСК по результатам ТЛЧ на ППС была 0,5 мкг/мл, МИК(100) - 2 мкг/мл. Следовательно, все штаммы, чувствительные к ПАСК по результатам определения ЛЧ на среде Левенштейна-Йенсена, в системе BACTEC MGIT 960 были чувствительны к ПАСК в диапазоне концентраций от 2 до 40 мкг/мл.
Определение минимальных ингибирующих концентраций ПАСК в жидкой среде на анализаторе BACTEC MGIT 960 штаммов M.tuberculosis, устойчивых к ПАСК по ТЛЧ на плотной среде Результаты определения чувствительности к 7-ми концентрациям ПАСК (0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0; 20.0; 40.0 мкг/мл) штаммов МБТ, устойчивых к ПАСК по результатам ТЛЧ на ППС Левенштейна-Йенсена, представлены в таблице 14.
Определение критической концентрации ПАСК
Сбор такой полной рабочей коллекции штаммов МБТ стал возможен благодаря развитой противотуберкулезной службе Владимирской области. В настоящее время противотуберкулезная служба Владимирской области представлена: 1 специализированный Центр, в котором расположены 182 туберкулезные стационарные койки, 1 туберкулезная больница на 80 коек, 16 туберкулезных кабинетов. Кроме того, 41 туберкулезная койка расположена в туберкулезных отделениях общих больниц.
Имеется 363 туберкулезных коек, в том числе 333 для взрослых и 30 для детей. Обеспеченность туберкулезными стационарными койками в 2015 году составила 2,6 на 10 000 населения (РФ – 4,3; ФО – 3,1). На 1 койку приходится в среднем 2,6 пациентов с туберкулезом (РФ – 3,0; ФО – 2,3). Работа койки составила: для взрослых – 285,9 дней (РФ – 320,1; ФО – 289,6 дней), для детей – 343,7 дней (РФ – 323,1; ФО – 306,6 дней). Средняя длительность пребывания на койке составила: для взрослых – 96,4 дней (РФ – 86,0; ФО – 79,3 дней), для детей – 150,5 дней (РФ – 91,5; ФО – 81,7 дней).
За период проведения исследования с 2010 по 2015 годы в лаборатории выполнено 107680 посевов патологического материала (94636 порций на плотные среды), в том числе 6522 посева на жидкие питательные среды и 6522 параллельных посева на плотную среду Финн II. Обследовано 54889 лиц, с подозрением и больных ТБ, из них 19017 с диагностической целью, 23502 для контроля химиотерапии и 12370 посевов преследовали прочие цели (хронические больные, поставленные на учет в прошлые годы), кратность обследования составила 1.92. За этот период выделено 10368 культур M. tuberculosis, из них 8289 культуры выросло на каждой из двух плотных сред (94636 посевов на две плотные среды, 17.5% положительных), включая 1635 культур (6522 посева, 25.1% положительных), которые выросли при параллельном посеве материала на плотную среду при тестировании на анализаторе BACTEC MGIT 960. На жидкой среде с помощью анализатора BACTEC MGIT 960 выросло 2079 (из 6522 посевов патологического материала, 31.8% положительных) культур .
В качестве референс-метода нами был использован метод абсолютных концентраций на среде Л-Й. Следует отметить, что в публикациях, посвященных определению КК препаратов для системы BACTEC, нет какого-то единого метода, используемого в качестве референтного. Для сравнения использовались результаты определения ЛЧ, полученные методом пропорций на среде Л-Й [74] и агаре Middlebrook 7H10 [91] или в системе BACTEC 460, которая хорошо стандартизована и отличается высокой воспроизводимостью результатов [97, 108].
Применение нами метода абсолютных концентраций на среде Л-Й в качестве референтного основано на долговременном опыте применения его в РФ, что позволяет говорить об адекватности полученных в исследовании результатов. В ходе проведения исследования для определнеия КК циклосерина и ПАСК был разработан трехэтапный метод анализа: 1. Определение устойчивости штаммов МБТ к изучаемому ПТП референс-методом и разделение их на группы в зависимости от результатов теста. 2. Определение МИК препарата отдельно для группы чувствительных и устойчивых штаммов 3. Сопоставление МИК препарата, полученных для устойчивых и чувствительных по данным референс-метода штаммов, и заключение о величине
КК. Определение чувствительности отобранных штаммов к 8-ми концентрациям циклосерина (4.0; 8.0; 10.0; 15.0; 20.0; 30.0; 40.0; 50.0 мкг/мл) и 7-ми концентрациям ПАСК (0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0; 20.0; 40.0 мкг/мл) на жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 в системе BACTEC MGIT 960 показало, что МИК(50) циклосерина для чувствительных к нему штаммов по результатам ТЛЧ на ППС составила 10 мкг/мл, а для устойчивых штаммов - 30 мкг/мл, МИК(100) -15 мкг/мл и 40 мкг/мл, соответственно.
МИК(50) ПАСК для штаммов, чувствительных по результатам ТЛЧ на ППС, составила 0,5 мкг/мл, для устойчивых штаммов - 40 мкг/мл, МИК(100) - 2 мкг/мл и более 40 мкг/мл, соответственно.
Критические концентрации циклосерина и ПАСК были установлены путем сопоставления результатов определения МИК препаратов на жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9 в системе BACTEC MGIT 960 для чувствительных и устойчивых МБТ (по результатам ТЛЧ на ППС), руководствуясь критериями, установленными CLSI [93]. В результате, критической концентрацией циклосерина при определении лекарственной чувствительности на жидкой питательной среде Middlebrook в системе BACTEC MGIT 960 была признана 15 мкг/мл, ПАСК - 2 мкг/мл.
Разработанная трехэтапная схема определения КК противотуберкулезных препаратов, на примере циклосерина и ПАСК, может быть применена для определения КК других препаратов, используемых для терапии туберкулеза.
При определении КК препаратов для новых питательных сред, которые будут положены в основу определения фенотипической ЛЧ МБТ, принято учитывать чувствительность и специфичность разработанного метода, а также общее число совпадения результатов, полученных на референтной и тестируемой среде [74, 91, 97, 108]. Под чувствительностью метода с использованием установленных КК препарата, подразумевается процент резистентных штаммов, определенных с использованием разработанных КК в системе BACTEC MGIT 960, от числа резистентных штаммов, установленных рефератным методом. Под специфичностью - процент чувствительных штаммов, определенных с использованием разработанных КК в системе BACTEC MGIT 960, от числа чувствительных штаммов, установленных референтным методом. Процент совпадения рассчитывается от общего числа результатов, совпавших с референс-методом.