Введение к работе
Актуальность проблемы. Биохимический круговорот азота является важнейшим этапом в общем каскаде процессов, регулирующих экологическое равновесие и восстанавливающих плодородие почв. подвергающихся длительному техногенному воздействию. Механизмы этих процессов в почвах, загрязненных нефтепродуктами, далеко не ясны. Одним из важнейших звеньев в круговороте азота является нитрификация - процесс окисления восстановленных форм азога в NOj"" и NO3 ' В этом окислении принимают участие группа специфических лнтоавтотрофных нитрифицирующих бактерий. В ненарушенных почвенных экосистемах численность их вполне достаточна для обогащений почв окисленными соединениями азота и обеспечения жизнедеятельности остальных звеньев цикла. Однако в ряде работ последшіх лет показано, что в условиях, атипичных для автотрофних тарификаторов, главенствующее значение в процессе могут приобретать гетеротрофные микроорганизмы (Р.Тейт III, 1991).
Нефтяное загрязнение, как известно, обусловливает, долговременный отрицательный экологический эффект, и до сих пор остается нерешенным вопрос влияния его на процессы цикла азота, в частности, на автотрофную нитрификацию. Атипичностъ же нарушенных почв Аишсрона позволила предположить наличие в них гетеротрофных микроорганизмов - окислителей востановленных форм азота.В этом случае огромный интерес представляли относительные размеры гетеротрофной нитрификации, се роль в общем балансе нитрифика-щюшшх процессов и экологическое значение.
Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследовать особенности биогсохимнческого круговорота азота з почвах Апшсрона с различной степенью нсфтсзагрязнския, опрсдсліггь относительные размеры автотрофной и гетеротрофной нитрификации в них, изучить воздействие ряда зтлевопородных составляющих нефти на эти процессы в природных условиях и в культуре с целью поиска среди них соединений, избіфатсльно подавляющих автотрофную нитрификацию.
Исходя из этого, на разрешение были поставлены следующие задачи:
.-4-
-
Изучить процессы микробиологического круговорота азота в различных нефтезагрязненных районах Апшсронского полуострова, дать оценку их экологического состояния и возможности рекультивации.
-
Выделить литоавтотрофньгх нитрифицирующих бактерий из нефтезагрязненных почв Апшсрона, изучить воздействие углеводородов нефти на них в природных условиях и в культуре.
-
Подобрать специфические углеводородные соединения из числа нефтепродуктов, оказывающих устойчивое ингибирующее действие на литоавтотрофную нитрификацию в минимальных концентрациях.
4.' В случае обнаружения в нефтезагрязненных почвах гетеротрофных микроорганизмов, способных к нитрификации, изучить условия и дать оценку эффективности этого процесса в почвах Апшсрона.
Научная новизна. Впервые проведены комплексные лабораторные и полевые исследования особенностей баланса микробиологического цикла азота в различных районах, нефтезагрязненных поч» Апшсрона.
Изучено воздействие нефти и нефтепродуктов на окислительную ветвь круговорота азота как в полевых условиях.так и в накопительных культурах нитрифицирующих бактерий. Из нисла нефтепродуктов подобраны ингибиторы, избирательно подавляющие I фазу автотрофной нитрификации и позволяющих разделить в почве процессы автотрофной и гетеротрофной тарификации. Среда выделенных из асф'тезагрязненных почв гетеротрофных микроорганизмов способность к окислению аммонийного азота до нитритов и нитратов выявлена у микромицетов p.p. РсаіеіІІІаха и Aspergillus и бактерий p.p. Ar&robsctcr, Eiiciilas, PseudoEsooas, причем для PsesssiOEaoxsas fisiorcscess sp. - обитателя нефтезагрязненных почв - впервые. Показано, что Pcssd&saosas Caoresceas sp. активно осуществляет нитрификацию в средах и в почве в присутствии источника N и нефтяных углеводородов.
Впервые изучены условия и размеры гетеротрофной нитрификации в серо-бурых почвах с различной стспсш.ю нефтезагрязнсния. Установлено, что эффективность этого процесса выше в почвенных образцах с высоким содержанием органического вещества и резко
_5-
возрастаст при дополнительном внесении восстановленных форм a^ota, что имеет большое значение д. л оценки poj.,i этого процесса в общем круговороте азота.
Практическая ценность. Методические подходы, примененные в диссертации, могут быть использованы в разработке биотехпологи-ческих основ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.
Культуры микроорганизмов, выделенные из нефтезагрязненнш; почв Апшсрона и хранящиеся в Коллекции Культур Институте Микробиологии АН Азербайджана, могут найти применение з качестве индикаторов способности нефтезагрязиснішх почв к самоочищению и самовосстановлению.
Работа проводилась в рамках начатых в Азербайджанской Республике масштабных исследований нарушенных почв Апшсрона, вследствие сильного загрязнения исключенных из сельскохозяйственного использования. Эти исследования включают геологические, геохимические и микробиологические анализы почв различных районов полуострова, установление степени парушеппости и экологического состояния. Результаты научных исследований и составленные карты НЗП приняты экологическим отделом концерна Азнсфть в качестве практических рекомендаций в разработке био-технологических методов рекультивирования нефтезагрязпешшх почв Апшсрона.
Апробация работы. Основные положения диссертации долозкеаы на Республиканской конференции молодых ученых "Биология клетки" (Баку, 1989), Республиканской конференции аспирантов (Баку, 1990), Республикапской научной конференции по вопросам ежоло-ппї и охраны окружающей среды (Баку, 1992), на семинарах Института микробиологии АН АзсрбаДц^сапа.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б научных трудов.
Структура я объем диссертации. Диссертация состоит пз введения, 5-ти глав, включающих обзор литературы, эхеперкментальную часть и обсуждение результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 180 наимснозшшй,в том числе 125 иностранных азторов. Полный объем 160 страниц машинописного текста. В диссертации 56 таблиц и 23 рисунка.
Объ екты ^усоозШ- H-Mglgj^HgCT^osailHU;
Исследования проводили на серо-бурых почвах б основных нефте-зягрязнсшіьіх районов Лпшсронского полуострова, различающихся по генезису, физико-химическим свойствам и степенью иарушенно-стн. Почвенные образцы отбирались из разных горизонтов (до 50 см). Опыты проводились как в полевых условиях, так и в лабораторных моделях.
Mg^CiOg га низ ШіЬ
В процессе исследования попользовали чистке и накошггелыше культуры микроорганизмов:
а) накопительные культуры автотрофних нитрифицирующих
бактерий lull фаз;
б) штаммы Niiro&omoaas eoropaea NM 203 ЛТСС 32776, ГЧ'і.'гоЬгс-
tcr Wiuogradskyi NB АТСС 25385;
в) культуры гетеротрофних микроорганизмов радов ArShroLuctcr,'
Pseudtwaonas. Bacillas, вымоленных in нефтезагрязнешшх серо-
бурых почв Апшсрона;
г) аэробные аюрообрззующие микроорганизмы :п нефтезагряз-
иенных почв,
д) сообщество денитрифицирующих микроорганизмов;
е) культуры взотфиксируїоїщгх оакіерпй родов A:il.n,'^;ic; у,
. їЛй.'тїгііІІЖії;
y.t) культуры грибов p.p. Asp-.jgiE„r;, PciJcilii;::/!.-. з) .штаммы PtrJtffiiiiiJ cotaiuir: ШСМ-227, P.cL;>->id«n ч t'.M.V!-;'*>2s ?. ckloij-OTuiiXi IJIuM-757, А.^ігг^ГкИ ulgzr ГЛ.Г.1-1І1?, A. liiivi.:: *ЖМ-25, A. Jtrrcc5-65, A.YM»i"o!or ІЯІМ-70, i-V:.;.i<-L.p,i i.;fi-;i.L'.h"yiY.u-
полученные из отдела типовых культур Лнілигуїд мнкробпо-
лопш РАН. Культуры а, с, г, д. є и лт были выделены шиш из серо-Gypiix почв Лишеро':а. Шгаммы о были предоставлены к.б.и Е.ВЛебсдааон (Пн Ми РАН) из личной коллекция.
У ело пи я купь гк р игківа і шям икроорганщ могц
Сапрофитных микроорганизмов учитывали путем высева почвенных суспензий на мяео-пелтонном агаре (МПЛ), аммонифицирующих - на мясо-пептошюм бульоне (МПБ), споровых - на МПА+СА (сусло-агнр, 1:1). Деннтрнфикатороп выращивали на жидкой среде Гильтея, аэробных аэдтфиксятороз - на среде Эгиби с почвенными комочками, анаэробных клосгрндий - на жидкой среде Випоградского. Углеаодо-родокисляющих. бактерий выделяли па среде Раймонда.
Накопительные культуры автотрофных тарификаторов получали общепринятым ?летодом посева почвенной суспензии на элективные среды Хармса {для яммопийокисляющнх бактерии) н Бока (для нитрит окисляющих). С целью очищения от сопутствующей микрофлоры' накопительные культуры автотрофных нитрифнкаторов многократно пересеивались, а на чистоту проверялись путем высева на среду следующего состава (g/l): пептон - 0,5; дрожжевой экстракт -0,5; мясной экстракт - 0,5; Nad - 0,584.
Культуры грибов родов Aspergillus и Pesiclffiaj» выращивали на сусло-агаре (СА) и картофелъно-дскстрозном агаре (КДА).
M.ej^flbn^3y^e^^.aa]mgo^jo8jii^Te^fflEg_AHQB ШУДРифиКЙЦИО ісУльтл^х_мищю^гігаи.измов.
Определение активности нитрификации в отобранных образцах проводили в колбах объемом 0,5 л со 100 мл почвенной суспензии. В ходе инкубации пробы перемешивали на качалхс в течение 1 и 2 часов в вариантах без внесения и с внесением органических веществ соответственно.
Ддл подавления лнтоавтотрофной нитрификации I фазы использовали спиртовий раствор нитрапирина в конечной концснтраціш 20 мг/л (в контроль добавляли равную аликвоту этанола). II фазу нитрификации подавлшш хлоратом калия з конечной концентрации 5-10~2 Мм. Длительность инкубации - от 50 суток и дольше. В ходе инкубации в пробах определяли содержании гидрокенламика, нитритов, нитратов.
Влияние нефти и нефтепродуктов на вес группы микроорганизмов участников трансформации азота,изучали в лабораторных, модельных и полевых опытах. Из основных кяассоо углеводородов нефти были отобраны, помимо собственно сырой нефти, гсксадскян (и-Счв). мезитилен (1,5,5-тримстилбензол), циклогексан (СбН?2)- аромитиче екая фракция с длиной боковой цери С5-С-І4. пальмитиновая и бен зонная кислоты. В модельном лабораторном опыте углеводородные добавки вносились совместно с дополнит сльным источником азота в концентрациях 0,5-3% от N/NH4CI. В нолевом спите на стационарных площадках, заливаемых резными количествами сырой нефти, it течение 2 лет изучалась динамика почвенных микробиологических процессов трансформации азотсодсржаїцих веществ.
Гетеротрофная шпрификация изучалась в культурах Pbcudoas» та ййогсксгяз sp. и Aspergfflas fiavts sp.
Известно, что при длительном культивировании на искуссіьсн пік питательных, средах грибы теряют способность окислять no»-етнноиленные соединения азота (Dexiader et a!., 1966). У'пттывая wi. культуры грибов содержали в стерильной увлажненной серо-бурой почве. їІсрсд постановкой опыта культуры пересеивали ни КДА.
Содержание аммония в пробах определяли иняофеноловым мси> дсм (SWwra/!0,1969); нитраты - салицилоьым методом, либо в форме ннтріпоБ после восстановления гидразином, нитриты - спсктрофозо-мстрически по методу Грисси {Mullin,RHey,}9b5), гндрокенламин електрофон омстричеста» с 8-оксихинолином {Magee.Biirris, 1964), связанные формы гидрохенлыыина - после кислотного гидролиза до свободного гпдрокендамнна {Vcrstraeie. Alexander, 1072).
Идентификацию активных штаммов проводили ни основе опреде лктсля Берги (Bergey's manual, 1984).
Палевые опыты проводились на участках серо-бурых іючи Кн(і-пагского района АпшеронскогоподуостропаЪ 1990 по 19'Э'2 им