Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 26
1.1 Нормальная микрофлора ротовой полости детей 26
1.2 Биоплёнки 28
1.2.1 Организация биоплёнок 28
1.2.2 Жизненный цикл биоплёнки 33
1.2.3 Роль внеклеточной ДНК в формировании биоплёнки 34
1.2.4 Роль некодирующих РНК в формировании биоплёнки 35
1.2.5 Механизмы коммуникации микроорганизмов в биоплёнках. Кворум сенсинг 36
1.2.5.1 Основные бактериальные молекулы, участвующие в межклеточной коммуникации 38
1.3 Некультивируемые бактерии в составе микрофлоры ротовой полости 41
1.3.1 Основные причины «некультивированное» 45
1.3.2 Основные подходы к изолированию пока некультивированных микроорганизмов 46
1.4 Влияние полихимиотерапии, на микробиоту детей с онкогематологическими заболеваниями 47
1.5 Систематизация информации в биологии. Базы данных 49
ГЛАВА 2. Оценка состава микрофлоры полости рта здоровых детей и детей с онкогематологичекими заболеваниями в стадии ремиссии 52
2.1 Микроскопия 53
2.2 Культивирование 55
2.3 Общий спектр микроорганизмов, идентифицированных в слюне здоровых детей и детей с онкогематологическими заболеваниями в стадии ремиссии 58
2.4 Определение чувствительности идентифицированных микроорганизмов к антибиотикам и антисептикам 64
ГЛАВА 3. Выявление и генетическая идентификация ранее неизвестной бактерии 69
3.1 Результаты предварительной генетической идентификации 69
3.2 Выделение чистой культуры и изучение свойств неизвестной ранее бактерии 76
3.3 Идентификация штамма VT 162 с использованием систем Vitek 2 и Braker Biotyper 80
3.4 Определение чувствительности бактерий штамма VT 162 к антибиотикам.. 86
3.5 Секвенирование и аннотация генома Streptococcus sp. VT 162 87
3.6 Характеристика генома VT 162 90
3.7 Виртуальная ДНК-ДНК гибридизация и усреднённая идентичность нуклеоти дов 94
ГЛАВА 4. Создание базы данных результатов исследований 101
Заключение 106
Выводы 107
Практические рекомендации 109
Перспективы направления дальнейшей разработки темы 109
Список сокращений по
Список литературы
- Жизненный цикл биоплёнки
- Культивирование
- Выделение чистой культуры и изучение свойств неизвестной ранее бактерии
- Секвенирование и аннотация генома Streptococcus sp. VT 162
Жизненный цикл биоплёнки
Тело человека населено огромным количеством микроорганизмов (бактерии, археи, вирусы, эукариоты). Сумму этих микроорганизмов, принято обозначать как микробиота, микрофлора или нормальная флора [89,90]. По современным представлениям, количество клеток микроорганизмов, населяющих тело человека, в десять раз превышает количество клеток, составляющих его организм [91]. Общий геном микробиоты каждого человека содержит более 5-ти миллионов генов, что в двадцать раз превышает геном хозяина [92,93].
Установлено, что микрофлора человека имеет множество функций, от эффективности выполнения которых зависит его жизнь. В последние годы появляются новые данные о том, какие представители микробиоты оказывают наиболее выраженное влияние на определённый процесс. Так известно, что микрофлора играет важную роль в формировании иммунитета [94]. В частности, ключевую роль в становлении иммунитета слизистых оболочек играют сегментированные нитчатые бактерии {Candidatus arthromitus), от которых зависит наличие Т хел-перов 17 типа [95,96]. Помимо этого, нормальная микрофлора является барьером против многих патогенных микроорганизмов, соревнуясь за сайты адгезии, питательные вещества, продуцируя бактерицидные и бактериостатические молекулы [97,98], и стимулируя продукцию противомикробных веществ организмом [99-101]. Признана роль микробиоты в процессах метаболизма (ферментация полисахаридов, продукция незаменимых витаминов [102,103]). Современные данные указывают на роль микрофлоры в качестве важнейшего «органа» гомеостаза, влияющего на развитие хозяина, его физиологию и морфогенез [1]. Микрофлора человека имеет метаболический потенциал печени [104]. Под воздействием микробиоты происходит васкуляризация кишечника человека, формируются реснички эпителия кишки [100,105], развивается опорно-двигательный аппарат [106]. Микрофлора влияет на проводимость сигналов в синапсах, воздействуя на нервную систему, изменяет восприятие боли [107] и оказывает влияние на поведение [108-111]. С нарушениями состава и функционирования микрофлоры, связывают развитие различных соматических заболеваний [7]. Среди них, такие патологические состояния как сахарный диабет тип 2 [8,9]; ожирение [10,11]; атопический дерматит [12,13]; экзема [14,15]; псориаз [16]; аллергические реакции [17,18]; бронхиальная астма [19,20]; СРК [21,22]; нефролитиаз [23]; атеросклероз [24,25,112]; тромбозы [26]; инфаркт миокарда [27].
Полость рта представляет собой обширную экосистему [28,113]. По данным культуральных и некультуральных (молекулярно-биологических) методов исследования микробное сообщество ротовой полости представлено более чем 750 видами. [40,114-117]. По другим расчётам их число достигает нескольких тысяч [118].
Колонизация полости рта микроорганизмами начинается в момент прохождения плода через родовые пути и продолжается в первые недели и месяцы жизни при контакте с кожей и микроорганизмами, находящимися в молоке [119,120]. Большинство представителей микрофлоры отдельно взятого человека получены им от окружавших его в первые годы жизни людей и останутся с ним на всю жизнь.
Микробиота ротовой полости значительно изменяется с возрастом. Изначально относительно простая и немногочисленная, она динамично развивается и «взрослеет» вместе со своим хозяином. [121-123]. Ключевыми точками в процессе формирования микрофлоры полости рта детей, являются: появление и смена зубов, изменение гормонального фона в период полового созревания [40,124]. На процесс формирования микробиоты детей оказывают влияние способ рождения (через естественные родовые пути, путём кесарева сечения) [119], образ жизни родителей [125].
С пониманием важности микрофлоры в развитии организма и формировании предрасположенности к широко распространённым патологическим состояниям, возник большой интерес к изучению микрофлоры детей [126]. Тем не менее, большая часть исследований носит «точечный» характер, охватывая такие хорошо известные проблемы как детский и подростковый кариес [30-32], аллер гические реакции [33,34], атопический дерматит [35,36], детское и подростковое ожирение [37-39]. В то же время, лишь единичные работы, посвящены изучению нормальной микробиоты ротовой полости детей.
Культивирование
Идентифицированные нами морфотипы принадлежат культивируемым и «пока не культивируемым» бактериям. При этом были выявлены грамположи-тельные и грам отрицательные кокки (микро-, стрепто- и диплококки различных размеров, тетрады), палочки (одиночные и диплобактерии, различной величины и формой концов, коринеформные); ветвистые, изогнутые и извитые бактерии, плеоморфные микроорганизмы и клетки дрожжеподобных грибов. В исследуемом материале грамположительные кокки преобладали над остальными формами в обеих группах. Клетки дрожжеподобных грибов, встречались в половине мазков из слюны детей с онкогематологическими заболеваниями в стадии ремиссии и не встречались у здоровых детей. В слюне здоровых детей, было выявлено большее разнообразие морфотипов бактерий, также у них чаще встречались ветвистые и извитые формы, коккобациллы и грамотрицательные кокки. По результатам идентификации бактерий, выделенных из слюны здоровых и больных детей, можно сделать вывод, что удалось культивировать в виде чистых культур не более 10% от бактерий, выявленных при микроскопии. Ещё около 20% были обнаружены в мазках, приготовленных из смешанных биоплёнок. Получить эти бактерии в виде чистых культур и провести их идентификацию не удалось. Таким образом, около 70% микроорганизмов, выявленных при микроскопии, можно отнести к "пока не культивируемым", что соответствует современным результатам, получаемым при аналогичных исследованиях в мире [355].
Культивирование проводили в аэробных и анаэробных условиях. При высевах исследуемого материала на питательные среды, были получены многочисленные смешанные сообщества. По морфологии, данные сообщества были похожи на обычные изолированные колонии, образованные бактериями одного вида (рис 5).
Рисунок 5. Примеры смешанных микробных сообществ, полученных при культивировании Микроскопия мазков, приготовленных из этих колоний, показала, что каждая из них содержит от 2 до 8 различных бактерий (рис. 6). В результате последовательных рассевов, часть смешанных сообществ удалось разделить и получить из них чистые культуры бактерий пригодные для идентификации. В тоже время, большинство смешанных сообществ, в использованных условиях, разделить не удалось. При выращивании на разных средах в сообществах часто наблюдалось изменение соотношения количества бактерий с разными морфотипами. Некоторые бактерии переставали выявляться при микроскопии. Следует отметить, что мазок делали на всю поверхность предметного стекла, чтобы получить возможность просмотреть большое количество полей зрения и убедиться в морфологической однородности полученной культуры. В таких условиях было выявлено, что часто культура, которую можно было бы считать чистой, содержала несколько морфотипов бактерий. Не редко, попытка разделить смешанные сообщества, приводила к полному прекращению роста. В тоже время, некоторые сообщества не меняли своего состава при многократных (более десяти) пересевах.
Были получены стойкие микробные сообщества, в которых бактерии росли только вместе друг с другом. Бактерии, входящие в состав таких сообществ, не удалось получить в виде чистых культур. Это можно объяснить выраженной взаимозависимостью микробов, при которой внутри сообществ происходит обмен жизненно важными факторами, которые тот или иной микроорганизм не в состоянии продуцировать сам и они отсутствуют в использованных питательных средах. Очевидно, что такие бактерии относятся к "пока не культивируемым", поскольку, имеющиеся методы не позволяют воспроизвести все условия, требующиеся данным микроорганизмам для роста в виде чистых культур.
Некоторые бактерии росли только в присутствии грибов. Такой симбиоз хорошо известен. Взаимодействие между грибами и патогенными бактериями привлекает большое внимание учёных, поскольку такие сообщества особенно устойчивы к воздействию противомикробных препаратов [240].
Образование на питательных средах большого числа разнообразных смешанных микробных сообществ является ярким свидетельством существования в микрофлоре ротовой полости здоровых и больных детей тесного взаимодействия между различными неродственными микроорганизмами.
Таким образом, полученные результаты подтверждают феномен существования "видимых, но пока не культивируемых" бактерий. Природа феномена заключается в том, что не все бактерии, которые можно выявить в исследуемом материале при микроскопии, дадут рост при посеве. Изучение разнообразия морфотипов бактерий в исследуемом материале позволяет сформировать представление о соотношении выявленных при микроскопии форм микроорганизмов с разнообразием видов, полученных в дальнейшем в результате культивирования.
По результатам сравнения числа видимых и культивируемых бактерий, слюны здоровых и больных детей, можно сделать вывод, что удалось изолировать в виде чистых культур не более 10% от бактерий, выявленных при микроскопии. Ещё около 20% были обнаружены в мазках, приготовленных из смешанных со обществ. Получить эти бактерии в виде чистых культур и провести их идентификацию не удалось. Таким образом, около 70% микроорганизмов, выявленных при микроскопии, можно отнести к "пока не культивируемым", что соответствует современным результатам, получаемым при аналогичных исследованиях [355].
Общий спектр микроорганизмов, идентифицированных в слюне здоровых детей и детей с онкогематологическими заболеваниями в стадии ремиссии
Путём рассева смешанных микробных сообществ, полученных из слюны здоровых и больных детей, удалось выделить в виде чистых культур и идентифицировать по биохимической активности и с помощью диагностических тест-систем STAPHYtest-24 (ErbaLaChema, Чехия), API-Staph (BioMerieux, Франция), тест-систем АНАЭРОтест (Lachema, Чехия), системы Vitek 2 (bioMerieux, Франция) - с применением различных идентификационных карт, представителей 22 родов микроорганизмов. Среди них: 8 родов аэробных, 13 родов анаэробных бактерий, и представители дрожжеподобных грибов рода Candida.
Выделение чистой культуры и изучение свойств неизвестной ранее бактерии
Современная микробиология при изучении свойств микробных сообществ и отдельных микроорганизмов, использует как традиционные, так и большое количество новых, особенно генетических методов исследования. Культивирование на разнообразных питательных средах, в различных условиях, одновременно большого числа смешанных сообществ микроорганизмов, подбор условий для культивирования микроорганизмов в биоплёнках и кропотливый труд по разделению бактерий, входящих в их состав. Полуавтоматические методы идентификации, фотоматериалы, полученные методами световой, электронной и люминесцентной микроскопии, секвенирование и анализ отдельных генов и полных геномов бактерий. Все эти методы, продуцируют огромное количество информации в разнообразных форматах (текстовые документы, таблицы, рисунки, фотографии, файлы с нуклеотидными последовательностями, отчёты систем идентификации и др.). Также в результате опытов накапливаются штаммы бактерий, хранящиеся в разных условиях, пробирки с ДНК микроорганизмов, микропрепараты мазков, пригодных для длительного хранения. Всё это требует очень быстрой и чёткой систематизации, с возможностью доступа одновременно к результатам различных этапов нескольких опытов. В связи с этим, перед началом работы нами была создана база данных Microbes.
База данных Microbes является уникальной, она разработана и создана нами специально для использования в научных исследованиях, выполняемых на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ПСПбГМУ им. ак. И.П. Павлова. База зарегистрирован в ФИПС под № 2013620895 8 августа 2013 года.
Структура базы представлена таблицами предназначенными для хранения атрибутивной и графической информации, а так же таблицами, для графического представления информации пользователю. Структура базы "Microbes" представлена на рисунке 29.
В базе используются одновременно две различные модели систематизации материала. Основной является иерархическая модель, в которой каждый этап опыта связан с предыдущим. Таким образом, легко отслеживать динамику ре 101 зультатов этапов, относящихся к разным уровням (этапы выделения бактерий, входящих в микробные биоплёнки), и собирать в одной вкладке результаты, относящиеся к одному уровню, в том числе - получаемые в разные дни (биохимическая идентификация, анализ гена 16S рРНК и др.). Вторая модель используется для учёта хранящихся штаммов, праймеров и публикаций.
Хранение информации происходит на созданном нами удалённом сервере. Каждый сотрудник, работающий с базой имеет индивидуальные имя пользователя и пароль. Подключение к базе может производиться с любого авторизованного администратором компьютера, через защищенный интернет-канал. Таким образом, достигается возможность работы с базой одновременно нескольких сотрудников, при этом информация автоматически обновляется.
Открывая базу, пользователь попадает на основную страницу, на которой, в виде раскрывающегося списка, представлены все опыты. Для каждого, указана основная информация. На этой странице можно создать, удалить опыт целиком, или отдельные его этапы, внести изменения в основные параметры, а так же проводить поиск по нескольким критериям. С этой страницы можно перейти к поиску и просмотру имеющихся штаммов и праймеров. Отсюда же, происходит переход к вкладкам, содержащим полную информацию о любом этапе опыта.
При создании нового опыта, на его вкладке, можно внести разнообразную информацию об источнике исследуемого материала, исходных условиях культивирования и о помещении части исследуемого материала на длительное хранение.
В течение эксперимента каждый этап, имеет свой "уровень". В зависимости от структуры опыта, таких уровней может быть любое количество. При этом с использованием базы легко проследить их связь между собой. Так, например, при рассеве смешанного микробного сообщества, можно получить несколько различающихся колоний. Каждая из этих колоний будет иметь индивидуальную вкладку, при этом все они, будут на одном уровне, поскольку имеют один источник. Каждая такая вкладка будет содержать несколько дополнительных сведений: описание, фотографии, биохимическая идентификация и чувствительность к антибиотикам, результаты молекулярно-биологических методов исследования и ана 102 лиза генов, а также итог, предназначенных для внесения результатов, получаемых при использовании различных методов для изучения данной колонии.
В описании указываются: номер культуры, дата, среда, на которой получены данная колония, маркировка пробирок для длительного хранения, вносится описание колонии и её фотография.
Фотографии вносятся в каждый день культивирования. Макрофотографии колоний и микрофотографии мазков сопровождаются подробным описанием.
На вкладке "биохимическая идентификация" указываются результаты определения вида (или рода), с помощью обычных, полуавтоматических систем и автоматических систем, в том числе Vitek 2 (bioMerieux) и Braker BioTyper (Bruker Corporation, США), а так же системы Anaerotest (Lachema, Чехия). К результатам прикладывается файл с отчётом об анализе, создаваемый системами, или отсканированный бланк (для системы Anaerotest).
При описании, чувствительность исследуемого микроорганизма к антибиотикам, результаты можно внести, как с помощью выпадающего меню, так и прикрепив файл с таблицей или отчётом полуавтоматической системы определения.
На вкладке молекулярно-биологических методов исследования прикрепляются файлы, содержащие последовательность секвенированного гена или генома, указываются результаты сравнения этих последовательностей с различными наиболее признанными научным сообществом базами, приводятся результаты филогенетического анализа. Здесь же хранится аннотация генома.
На итоговой вкладке содержится резюме в свободной форме, отражающее наиболее важные, по мнению исследователя, результаты этапа. Схема иерархической структуры учёта результатов опытов представлена на рисунке 30.
Разработана и запущена база данных, предназначенная в первую очередь для исследований, направленных на многопрофильное научное изучения большого числа микроорганизмов. База позволяет не только контролировать и анализировать большие объёмы разнородной информации, но и оперативно сравнивать данные, полученные разными специалистами, работающими в этом проекте.
Секвенирование и аннотация генома Streptococcus sp. VT 162
Бактерии для получения ДНК, пригодной для полного сиквенса генома, были выращены на плотной среде (колумбийский агар с добавлением лошадиной сыворотки и эритроцитов барана). Культура была проверена по характеру роста, чистоте и морфологии клеток методами световой микроскопии колонии и мазков. После проверки роста и свойств бактерии собирали с поверхности агара платиновой петлёй и затем выделяли ДНК фенол-хлороформным методом. Полученную ДНК хранили до исследования при температуре -20 С.
Секвенирование проводили на сиквенаторе Illumina HiSeq 2500 согласно рекомендациям производителя. В результате было получено 16,79 миллиона однонаправленных последовательностей, длиной в 51 нуклеотид. Перекрытие каждого прочтения, в среднем, составляло 345 X (означает, что каждый из участков был секвенирован 345 раз).
Сборку контигов проводили с помощью программы Velvet v 1.2.10. В результате получено 340 контигов. Контиг N50 равен 41,108 п.о., контиг с максимальной длинной равен 115,694 п.о.
Сборку контигов в скаффолды и их ориентацию, проводили с использованием программы Mauve aligner v 2.3.1 [77], относительно генома Streptococcus oralis Uo5 [78] (рис. 21). В результате был получен геном размером 2,045,418 п.о. с содержанием G+C - равным 41.1% (рис. 22).
Предварительная аннотация генома была проведена с использованием сервера RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology) [79]. Полная аннотация проводилась с использованием GeneMarks [80], Infernal [81] и баз Rfam [82], Pfam [83], UniProt [84]. Аннотация генома зарегистрированная в NCBI, была проведена NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (выпуск 2013 г.). Геном доступен в NCBI под номером СР007628. Сиквенс гена, кодирующего 16S рРНК, доступен в NCBI, под номером KF780584.
В геноме бактерий штамма VT 162 выявлено: 1,935 белок кодирующих последовательностей со средней длинной 909 п.о., 34 тРНК, 3 рРНК, 1 нкРНК. Геном содержит гены компетентности сотЕ, сотВ, coiA, cglB, cglA, comF, celA, comGF, cglD, comGC; рекомбиназы RarA, RmuC, RecA, RecF, RecO, RecN; гены биосинтеза капсулы CpsC и CpsI гены белков транспортеров, ассоциированных с полирезистентностью к противомикробным препаратам семейств ABC (АТР-binding cassette superfamily), MATE (Multi antimicrobial extrusion protein family), MFS (major facilitator superfamily), DMT (Drug/Metabolite Transporter), ген vanZ связанный с устойчивостью к тейкопланину (антибиотик, относящийся к группе гликопептидов), бета-лактамаза класса А (рис. 23), адгезины (рис. 24), фактор вирулентности MviN (рис 25.), и экзотоксин - гемолизин III (рис. 26).
Полученные результаты указывают, что в геноме бактерий штамма VT 162 содержатся гены, присущие патогенным и условно-патогенным бактериям: экзотоксин - гемолизин, адгезины и гены антибиотикоустойчивости, причём к широкому спектру препаратов, включая сравнительно редко применяемые пептидные препараты, типа тейкопланина. В данном исследовании при использовании стандартных методик, штамм VT 162 был чувствителен ко всем испытанным антибиотикам, что указывает на роль взаимодействия микроорганизмов между собой и с макроорганизмом в процессе кворум-сенсинга на экспрессию генов отвечающих за различные факторы патогенности, в том числе устойчивость к антибиотикам. Эти данные позволяют предполагать, что данный штамм персистирует и распространяется среди больных, скорее всего, находящихся на стационарном лечении
Границей вида при данной методике считается показатель 95-96%. При известном ярко выраженном сродстве данной группы стрептококков, результат средней нуклеотиднои идентичности следует рассматривать в комплексе с результатами остальных методов исследования. В таком случае результат до 95% можно считать показателем, указывающим на то, что исследуемый микроорганизм относится к новому виду стрептококков. Для идентификации стрептококков группы oralis/mitis до вида учитывая тесное сродство бактерий этого рода, помимо сиквенса гена кодирующего 16S рРНК, при филогенетическом анализе используют и другие гены, такие как: D-аланин-Б-аланин лигаза (ddl), (3 субъединица РНК полимеразы (гроВ), сигма фактор RpoD РНК полимеразы, groESIgroEL система, манганат-зависимая супероксиддисмутаза (sodA). На рисунках 27 (а,б) и 28 (а,б) представлены дендрограммы, отражающие положение Streptococcus VT 162, относительно стрептококков, представленных в базе NCBI Chromosome Sequences, при использовании при филогенетическом анализе генов, кодирующих О-аланин-О-аланин лигазу (ddl) и (3 субъединица РНК полимеразы (гроВ).