Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1 Формирование микробиоты 13
1.2 Состав микробиоты человека . 17
1.3 Функции микробиоты. 19
1.4 Взаимосвязь аллергических заболеваний с состоянием микробиоты кишечника. 20
1.5 Взаимосвязь ожирения с микробиотой кишечника 30
1.6 Механизмы, связывающие кишечную микробиоту иожирение 33
Глава 2 Материалы и методы. 50
2.1 Общая характеристикадетей, включенных в исследование. 50
2.2. Биологический материал. 50
2.3 Методы исследования 51
2.3.1 Общеклинические методы 51
2.3.2. Лабораторные методы исследования 51
Глава 3 Результаты собственных исследований 58
3.1 Общая характеристика детей 58
3.1.2 Клиническая характеристика детей с аллергическими заболеваниями. 61
3.1.2 Клиническая характеристика условно здоровых детей .63
3.2 Определение лептина и маркеров воспаления у детей с различной массой тела . 65
3.3 Исследование микробиоты кишечника у детей с различной массой тела. 66
3.3.1 Исследование облигатной микробиоты кишечника 66
3.3.1 Исследование факультативной итранзиторной микробиоты кишечника. 73
3.4 Изучение соотношения firmicutes/ bacteroidetes у детей с различной массой тела. 80
Глава 4 Заключение 84
Выводы 93
Список литературы
- Состав микробиоты человека
- Взаимосвязь ожирения с микробиотой кишечника
- Методы исследования
- Определение лептина и маркеров воспаления у детей с различной массой тела
Состав микробиоты человека
Традиционно считалось, что кишечник новорожденных стерилен при рождении. За последние годы появились доказательства того, что бактерии присутствуют в амниотической жидкости in utero даже у здоровых новорожденных за счет «феномена бактериальной транслокации», но число и разнообразие микроорганизмов достаточно низкое [25]. Дети подвергаются воздействию множества микробов из разных источников сразу же после рождения и колонизируются микроорганизмами, с которыми они впервые сталкиваются либо при прохождении через родовые пути матери, либо с кожи, в зависимости от условий родоразрешения ребенка [16; 60].
Заселение желудочно-кишечного тракта ребенка микробиотой начинается в интранатальном периоде, и эта стадия называется «условно асептической». Вторая стадия наступает через 10–12 часов после рождения – стадия «нарастающего инфицирования» или «нарастающей колонизации». В этот период колонизация осуществляется гетерогенными микроорганизмами, в основном, микроорганизмами матери (при раннем прикладывании к груди) или «микроорганизмами родильного дома». Поскольку ткани кишечника новорожденного богаты кислородом, то в первую очередь в нем идет активный рост аэробных и факультативно – анаэробных бактерий, таких как стафилококки, энтерококки и кишечная палочка [64]. Они быстро размножаются, поглощая кислород, и создают при этом необходимые условия для роста микроаэрофилов и строго анаэробных бактерий. С 3–5-го дня наступает третья стадия трансформации микробиоты, в результате которой происходит вытеснение молочнокислыми бактериями (бифидобактерии, лактобациллы, молочнокислые и фекальные стрептококки) других микроорганизмов. В это время молочнокислые бактерии становятся основной резидентной микробиотой кишечника [13].
В мире выполняется ряд крупных исследовательских проектов, включающих метагеномные и геномные исследования микробиоты, которые позволили установить ее состав, индивидуальные особенности и взаимосвязь с различными факторами: возрастом, полом, заболеваниями и т.д. [162].
Так, метагеномный анализ показал, что микроорганизмы у ребенка в начале жизни обогащаются генами, которые облегчают использование лактата, при питании младенца грудным молоком или искусственной молочной смесью [96]. Интересно, что функциональные возможности усвоения гликанов растительного происхождения проявляются до введения в рацион твердой пищи. Это говорит о том, что кишечник ребенка готов перейти на другую, не только молочную пищу еще до окончательных изменений в диете. К концу первого года жизни бактериальный состав детей приближается к микробиоте взрослого человека [126] и полностью соответствует таковой к 2,5 годам [96].
Широкое использование оперативного родоразрешения может стать одной из причин нарушения микробной колонизации кишечника младенца. Доказательством является серия исследований, сравнивающих состав кишечной микробиоты у детей, рожденных путем кесарева сечения и вагинальным способом. Было обнаружено, что у детей, рожденных с помощью кесарева сечения, в кишечнике обитает меньше полезных микроорганизмов-бактероидов и намного меньше распространены полезные штаммы кишечной палочки по сравнению с детьми, рожденными естественным путем [36]. Помимо этого, у детей-искусственников значительно выше количество представителей семейств
Verrucomicrobiaceae и Peptostreptococcaceae, относящихся к Firmicutes. Нарушение микробиоты кишечника, которая оказывает неоценимую помощь организму в формировании иммунной системы, связано с возрастающим количеством хронических заболеваний. У детей, рожденных путем кесарева сечения, повышен риск заболевания астмой, ожирением, диабетом 1-го типа. Однако грудное вскармливание защищает от этих и других болезней, хоть и не со 100%-ной определенностью [36]. Кроме того, у детей, рожденных с помощью кесарева сечения, достоверно выше вероятность развития диарей и сенсибилизации к пищевым аллергенам по сравнению с детьми, родившимися вагинальным путем [102]. Ученые из Швеции проанализировали кишечную микробиоту 24 младенцев: 9 из этих детей родились с помощью кесарева сечения, 15 – вагинальным способом [82]. Для определения микробного состава кишечника секвенировали ДНК бактерий из образцов фекалий младенцев через неделю после рождения, а затем через 1, 3, 6, 12 и 24 месяца. Результаты исследования показали, что у детей, родившихся с помощью кесарева сечения, в кишечнике не хватало представителей одной из основных групп кишечных бактерий, Bacteroidetes, которые присутствовали у всех рожденных естественным путем. Кроме того, у некоторых из этих младенцев бактерии группы Bacteroidetes так и не заселяли кишечник вплоть до 12-месячного возраста. Кроме того, исследователи изучили уровеньTh1- и Th2-ассоциированных хемокинов в образцах крови младенцев через 6, 12 и 24 месяца после рождения. Хемокины — это низкомолекулярные белки, контролирующие миграцию клеток иммунной системы в организме. Высокий уровень Th2 -ассоциированных хемокинов способствует развитию аллергии, а Th1-хемокинов, наоборот, ликвидацию этих последствий. В крови детей, родившихся путем кесарева сечения, отмечался дисбаланс Th1- и Th2 ассоциированных хемокинов, и поэтому такие дети могли быть более чувствительными к аллергенам [82].
Кроме того, микроорганизмы матери является одним из главных факторов, определяющих состав кишечной микробиоты младенца, и может влиять на вес ребенка в будущем. Ученые изучили микробиоту беременных женщин с нормальным и избыточным весом. У пациенток с избыточным весом отмечался высокий уровень Bacteroides,Clostridium и Staphylococcus aureus в период между 1-ым и 3-им триместрами беременности. Кроме того, численность Bifidobacterium была выше у тех женщин, которые показали относительно низкую прибавку в весе во время беременности. Женщины с избыточной массой тела, как правило, рожали более тяжелых младенцев [51]. Так как ожирение может быть связано с осложнениями во время беременности и с повышением риска для здоровья новорожденных, исследователи изучили фекальную микробиоту 50 беременных женщин с избыточным и нормальным весом, в зависимости от их ИМТ, а также проанализировали биохимические показатели крови. Оказалось, что у женщин с избыточным весом снижена численность Bifidobacterium и Bacteroides, и наоборот повышена численность Staphylococcus, Enterobacteriaceae и E. coli, по сравнению с пациентками с нормальным весом. Кроме того, численность кишечной палочки была выше у женщин с чрезмерной прибавкой веса во время беременности, а у пациенток с нормальным весом численность Akkermansia muciniphila была выше. У всех пациенток, увеличение общего числа бактерий и доли Staphylococcus связано с повышением уровня общего холестерина в плазме крови. Рост числа Bacteroides связан с повышением уровня ЛПВП и фолиевой кислоты и понижением уровня триацилглицеринов. Повышение численности Bifidobacterium spp. приводило к повышению уровня фолиевой кислоты.
Взаимосвязь ожирения с микробиотой кишечника
Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили по общепринятым методикам на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств (Никитин В.М., 1986; Коршунов В.М., 1997), а интерпретацию полученных результатов проводили на основе «Протокола ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003). Из полученной взвеси фекалий готовили десятикратные серийные разведения от 10-3 до 10-8. Затем по 0,1 мл из соответствующих разведений исследуемого материала засевали на селективные питательные среды.
Для выделения бифидобактерий и анаэробных кокков использовали полужидкую бифидум-среду (г.Оболенск, Россия). Среду разливали в пробирки высоким столбиком по 10 мл, после чего стерилизовали при 0,5 Мпа в течение 30 мин. Перед посевом пробирки со средой прогревали на водяной бане при 80С в течение 20 мин и охлаждали до 37С. Затем производили посев из 10-7 и 10-8 разведений. Метод определения бифидобактерий основан на способности бифидобактерий расти в питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках при температуре 37C и образовывать в них через 48-72 ч гвоздикообразные характерные колонии. Анаэробные кокки росли в толще среды, образуя белый осадок на дне пробирки. Из изолированных колоний делали препараты, окрашивали по Граму и микроскопировали. Для идентификации бифидобактерий и анаэробных кокков использовали тест – систему API 20A (bio Mrieux, Франция) согласно инструкции. Для выделения лактобактерий использовали среду лактобакагар (г.Оболенск, Россия). Посев производили из 10-3 и 10-5 разведений. Чашки Петри помещали в микроаэрофильные и анаэробные условия с использованием микроанаэростата и газогенераторных пакетов Compact/W-ZIP (БиоВитрум) инкубировали в термостате течение 48 ч. при температуре 37C. На этой среде лактобактерии обычно образуют мелкие нежные колонии с гладкими или изрезанными краями («паучкообразные»). Из всех типов колоний делали мазки и окрашивали по Граму. Подтверждением принадлежности микроорганизмов к роду лактобацилл являлись их морфологические свойства, отсутствие спор, каталазной и оксидазной активности. Кроме того, проводили биохимическую идентификацию с помощью тест – системы API 50 CH согласно инструкции (bio Mrieux, Франция). Бактероиды выделяли на кровяном анаэробном бактоагар с канамицином и желчью. Чашки инкубировали в анаэробные условия с использованием микроанаэростата и газогенераторных пакетов Compact/W-ZIP (БиоВитрум) в течение 2-х суток в термостате при температуре 37 C в. Колонии на кровяном агаре круглые, гладкие, мелкие. Рост сопровождался характерным специфическим запахом. Подсчет колоний проводили с учетом морфологии и каталазного теста (как правило, бактероиды каталазоположительны). При учете чашек с посевами делали мазки из всех типов колоний, изучая морфологию микроорганизмов, окрашивали по Граму. Для идентификации бактероидов использовали тест – систему API 20A (bio Mrieux, Франция) согласно инструкции. Клостридии выделяли путем посева на среду Вильсона — Блера. Готовую к применению среду разливали в стерильные пробирки по 7 мл. Исследуемый материал перемешивали со средой по всему объёму пробирки. Пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками, инкубировали при 37 С в течение 18 - 24 часов. Клостридии растут в виде чёрных колоний, часто давая почернение всего столбика среды. Газообразование, особенно при росте C.perfringens, приводило к разрывам столбика среды. Для идентификации использовали тест – систему API 20A (bio Mrieux, Франция) согласно инструкции.
Бактерии из семейства Enterobacteriaceae выделяли на среде Эндо агар (г.Оболенск, Россия) и среде Левина (г.Оболенск, Россия). Посев производили из 10-5 и 10-7 разведений и инкубировали в термостате при 37 C в течение 48ч. На среде Эндо E.coli образовывали крупные темно-красные колонии с металлическим отливом, на среде Левина – черные колонии, также с металлическим отливом. Лактозо-отрицательные энтеробактерии образовывали светлые колонии, от светло-розовых до прозрачных, бесцветных. Нетипичные для кишечных палочек колонии отсевали на среду Клиглера (г.Оболенск, Россия), для изучения по их способности ферментировать лактозу, глюкозу, образовывать газ и сероводород, а затем на среду Симмонса (г.Оболенск, Россия), на которой растут (энтеробактер, клебсиеллы) способные утилизировать дигидрофосфат аммония и цитрат натрия в качестве единственных источников азота и углерода и изменяется цвет среды с зеленого на синий. Кроме того идентификацию проводили с помощью биохимических тест – систем API 20 E (bio Mrieux, Франция) согласно инструкции.
Стафилококки выделяли на Питательной среде №10 ГРМ (г.Оболенск, Россия) из 10-1 и 10-4 разведений. Чашки Петри инкубировали в термостате при 37 C в течение 48 ч. S. aureus образовывает на этой среде большие, круглые, золотисто-желтые колонии. Морфологические свойства микроорганизмов изучали в мазках, окрашивали по Граму. Определение видовой принадлежности проводили с помощью тестов на плазмокоагулазу, хлопьеобразование, способности сбраживать маннит, наличия гемолизирующих свойств, выявляемых при росте на кровяном агаре, а также с помощью биохимических тест – систем API 20 Staph (bio Mrieux, Франция) согласно инструкции.
Энтерококки выделяли на кровяном агаре. Посев производили из 10-3 и 10-5 разведений. Чашки инкубировали в термостате при 37 C в течение 48 ч. Энтерококки чаще вырастали в виде мелких, выпуклых, гладких, полупрозрачных серовато-белых колоний. Морфологические свойства микроорганизмов изучали в мазках, окрашенных по Граму, проводили тесты на наличие каталазы и оксидазы (отсутствие активности), отсевали выделенные колонии на селективную среду – энтерококкагар.
Методы исследования
Проанализировав в нашем исследовании анамнестические данные детей, мы установили, что дети с ожирением чаще находились на искусственном и смешенном вскармливании, причем у детей с аллергическими заболеваниями эта тенденция увеличивается в 1,7 раза. На сегодняшний день существует целый ряд работ, согласующихся с нашими данными [33; 71; 160].
Нужно отметить, что вскармливание влияет на формирование микробиоты кишечника ребенка. Изменение в первоначальной колонизации кишечника, может неблагоприятно отразиться на последующем развитии ожирения, а также аллергических заболеваний. В последние годы уделяется особое внимание иммуномодулирующей активности естественной микрофлоры кишечника на формирование оральной толерантности, а также влияние микробиоты на метаболические процессы. Так, результаты исследования датских ученых доказали, что длительное грудное вскармливание (не менее 18 месяцев) стимулирует рост лактобактерий в кишечнике ребенка, улучшая его микрофлору и иммунитет. Было также показано, что растущие на грудном вскармливании дети в будущем реже страдают ожирением, сахарным диабетом 2-го типа, воспалительными заболеваниями кишечника и аллергией, по сравнению со своими сверстниками, которых кормили питательными смесями. Исследователи предположили, что на формирование микрофлоры кишечника может влиять не только способ вскармливания, но и его продолжительность [94].
В нашем исследовании мы не обнаружили взаимосвязи между способом рождения и набором веса, что расходится данными зарубежных авторов [87]. Среди многих факторов, влияющих на ожирение, в последнее десятилетие большое внимание уделяют изменениям кишечной микробиоты [112;137;149;150]. Так, было показано, что микробиота кишечника участвует в поддержании контроля массы тела, влияет на потребление и накопление энергии, а также способствует формированию хронического воспалительного состояния [17; 20]. Мы исследовали микробиоту кишечника у детей с различной массой тела с наличием аллергии и без нее (группы сравнения) и обратили внимание, что облигатная микробиота кишечника условно-здоровых детей отличается от нормативных показателей отраслевого протокола 2003г. В частности, у детей из группы сравнения с нормальным весом численность бифидобактерий и лактобактерий была ниже норм на 2 порядка, что возможно отражает общую тенденцию снижения полезной флоры у детей в популяции. Согласно последним данным, у диких племен индейцев Яномами практически не контактирующих с внешним миром и не использующих благ современной цивилизации (например, терапию антибиотиками) в 2 раза выше разнообразие полезной микробиоты кишечника, в отличие от микрофлоры современных европейцев и американцев [125].
Анализируя микробиоту кишечника в зависимости от массы тела и наличия аллергической патологии, мы выявили различия численного состава микроорганизмов. Так, у детей с аллергическими заболеваниями численность высеваемых бактероидов была снижена во всех группах и наиболее низких значений достигала у детей с избыточным весом (p= 0,0216), в то время как у детей без аллергии выявлено достоверное снижение численности бактероидов с увеличением массы тела (p=0,0217). Кроме того, численность бактероидов у детей с аллергией и избыточным весом была ниже, чем у детей без аллергической патологии той же весовой категории (p=0,0038). Помимо этого, у детей без аллергии с избыточной массой тела численность бактероидов коррелировала с осложненными родами и рождением с помощью кесарева сечения (R = 0,87; p= 0,0255). Как известно из литературы, бактероиды включают наибольшее число видов и играют основную роль в формировании нормальной микрофлоры и в патологии человека. Большая часть Bacteroides относится к Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron. Капсульный полисахарид А B. fragilis имеет цвиттер-йонную структуру и является уникальным Т-зависимым антигеном, который обеспечивает опосредованно пролиферацию CD4+ Т-клеток in vitro [43; 152]. В исследовании на мышах-гнотобионтах было показано, что колонизация мышей B. fragilis приводит к восстановлению баланса Th1/Th2 клеток и играет важную роль в защите от аллергических заболеваний [111]. Отличительной чертой B. thetaiotaomicron является его способность использовать в качестве источников энергии и углерода широкий диапазон полисахаридов. В целом, этот микроорганизм способен утилизировать более 20 различных видов субстратов как растительного, так и животного происхождения [108]. Для расщепления полисахаридов используются различные ферменты, гидролазы и липазы, экспортируемые как в периплазму, так и во внеклеточное пространство. B. thetaiotaomicron способен регулировать ангиогенез через клетки Панета, которые являются ключевым компонентом иммунной системы в кишечнике, формирует барьер слизистых, который помогает в борьбе против патогенных бактерий, путем регулирования экспрессии специфических эндогенных бактериальных белков (Ang4), обеспечивая тем самым контроль над составом микрофлоры [83; 145]. Кроме того, в исследовании на мышах линии C57BL-6, было показано, что пероральное введение B. uniformis CECT 7771 приводило к снижению массы тела, уменьшению жирового гепатоза печени, снижению концентрации холестерина и триглицеридов печени и увеличению числа малых адипоцитов, даже при кормлении богатой жирами пищи. Штамм CECT 7771 способствовал снижению уровней сывороточного холестерина, триглицеридов, глюкозы, инсулина, лептина, уменьшению абсорбции жиров, а также улучшал оральную толерантность к глюкозе. Помимо улучшения биохимических показателей, прием B. uniformis CECT 7771 увеличивает продукцию ФНО-, с помощью дендритных клеток в ответ на стимуляцию ЛПС и улучшает фагоцитоз [75]. Поэтому численность бактероидов может играть ключевую роль в борьбе с аллергическими заболеваниями и ожирением.
Определение лептина и маркеров воспаления у детей с различной массой тела
В нашей работе мы обнаружили, что у детей с аллергией отмечалась тенденция к снижению числа высеваемых энтерококков с увеличением массы тела, при этом у детей с аллергией и избыточной массой тела численность энтерококков обратно коррелировала с осложнением родов и рождением с помощью кесарева сечения (R= 0,74; p= 0,035). Помимо отличий в облигатной микробиоте кишечника, мы обнаружили, что факультативная микробиота детей также изменялась с увеличением массы тела. В частности, независимо от наличия аллергии, нами выявлено достоверное увеличение численности высеваемых клостридий (p= 0,0014) с увеличением массы тела. Численность высеваемых стафилококков была сравнима как у детей с аллергическими заболеваниями, так и без них, однако, видовой состав у них различался. У детей с аллергическими заболеваниями с нормальным и избыточным весом около 20% всех стафилококков составляли S.aureus, а у детей с ожирением численность их снижалась до 5%. При этом у детей с аллергией и нормальной массой тела численность золотистого стафилококка коррелировала с искусственным и смешанным вскармливанием (R = 0,62; p= 0,0003). Так, в нескольких проспективных исследованиях было показано, что у детей с аллергическими заболеваниями снижена численность энтерококков, бифидобактерий, бактероидов, в то время как число клостридий и стафилококков наоборот повышено [90;139], что согласуется с данными нашего исследования. В противоположность этому, в последней работе, проведенной у детей с аллергическими заболеваниями в возрасте 5 и 12 лет было показано, что численность Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria в микробиоте кишечника детей с аллергией и здоровых пациентов была схожей, отличия были только в группе Verrucomicrobia, которые были снижены у детей с аллергией [61]. Поэтому данные относительно влияния аллергической патологии на численность разных микроорганизмов микробиоты кишечника достаточно противоречивы. Кроме того, следует отметить, что в предыдущих работах не учитывалось, как вес ребенка влияет на микробиоту кишечника у детей с аллергической патологией.
Стоит отметить, что при различных аллергических заболеваниях выявлены разные ассоциации с численностью облигатной и факультативной микробиоты в зависимости от массы тела. Так, у детей с атопическим дерматитом численность анаэробных кокков обратно коррелировала с ИМТ (R= -0,40, p= 0,025). У детей с бронхиальной астмой обратную связь с ИМТ имела численность бактероидов (R= -0,41, p= 0,035), анаэробных кокков (R= -0,39, p=0,042) и энтерококков (R= -0,43, p= 0,026), а численность клостридий прямо коррелировала с увеличением массы тела (R= 0,47, p= 0,013).
Впервые в нашей работе мы показали, что у детей с аллергическими заболеваниями характерно наличие в микробиоте кишечника микроорганизмов рода Bacillus, численность которых при избыточной массе тела коррелировала со смешанным и искусственным вскармливанием (R = 0,62; p= 0,013). Возможно, это связано с характером питания этих детей. На сегодняшний день споры относительно соотношения Firmicutes/Bacteroidetes у людей с избыточным весом и ожирением продолжаются. Так, мы выявили, что у детей с аллергическими заболеваниями соотношение Firmicutes/Bacteroidetes было повышено только в группе детей с избыточным весом, по сравнению с детьми с нормальной массой тела. В то же время у условно здоровых детей по мере увеличения массы тела соотношение Firmicutes/Bacteroidetes увеличивалось, за счет увеличения численности фирмикут и пропорционального уменьшения числа бактероидов. Более того, у детей с аллергическими заболеваниями численность Bacteroidetes была изначально ниже, по сравнению с детьми без аллергии, у которых бактероиды были снижены только при ожирении. Кроме того, у условно здоровых детей с ожирением численность фирмикут коррелировала с численностью бактероидов (R=0,45, p=0,0081). При этом следует отметить, что увеличение численности Firmicutes по мере нарастания массы тела происходило за счет повышения Clostridium spp. и не зависело от аллергической патологии.
В последнее время активно изучается роль Clostridium в патологии желудочно-кишечного тракта. Так, в экспериментальной работе было показано, что Clostridium кластера XIV способствуют развитию ожирения, поддерживая неспецефическое воспаление в жировой ткани за счет белка жгутиков – флагеллина, который связывается с TLR-5, экспрессированных на поверхности клеток [124]. Однако клинические данные пока противоречивы и требуют дальнейшего изучения.
Таким образом, знания о закономерностях изменения облигатной и факультативной микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями и различной массой тела смогут послужить основой для оценки микробиоты как патогенетического маркёра развития патологических процессов неинфекционного генеза. Обнаруженные отличия в составе облигатной микробиоты у детей условно здоровых с нормальной массой тела отличаются от используемых в практике стандартов. Полученные нами данные могут отражать общую тенденцию в изменении численности полезной флоры (бифидобактерии, лактобактерии) в популяции. Выявленные нами качественные и количественные изменения в составе облигатной и факультативной микробиоты кишечника у детей с аллергопатологией и различной массой тела могут быть использованы в качестве критерия при оценке различных нарушений микробиоциноза желудочно-кишечного тракта, а также для подбора оптимальных видов микроорганизмов, включенных в состав пробиотических препаратов с целью коррекции и профилактики аллергических заболеваний и ожирения.