Введение к работе
Актуальность темы. Получение биологически активных веществ путем культивирования микроорганизмов является одной из фундаментальних проблем современной биотехнологии, поиск альтернативных способов биосинтеза биотехнологической продукции путем скрининга, селекции и оптимизации условий на основе изучения метаболизма у потенциально активных продуцентов обеспечивает непрерывный прогресс в этой области.
Сказанное в полной мере относится и к биотехнологическому получению коФермента А (СоА) - метаболита, имеющего исключительное значение в метаболизме любой-живой клетки /Нойсеенок и др. 1989/. Среди изученных микроорганизмов, способных к сверхсинтезу СоА. наиболее активными оказались представители . рода Brevibacterium,' способные осуществлять трансформацию предшественников (АТР, пантотената, цистеина) в соа /stiimizu, Yamada, 1986/. Однако, в мировой практике нередко используют дешевые источники с низким содержанием СоА (например, биомассу дрожжей), что указывает на выгоду использования дешевых источников, несмотря на относительно низкий выход коФермента.
О стрептомицетах как потенциальных источниках получения СоА уже имеется некоторая информация - биомасса их использована для его выделения /ое vnes et а і., 1951/, кроме того, известны противоречивые данные, с одной стороны, не исключавшие возможность секреции коФермента при глубинном культивировании, с другой - .отрицающие выделение СоА из клеток. Прояснение спорных здесь вопросов представляет интерес не только с точки зрения биотехнологической практики. Исследование возможности секреции Соа также важно для более подробного выяснения роли стрептомипетов в естественных условиях при Формировании биоценоза и. в частности, их потенциальных способностей в стимулировании роста растений /Павловича, 19те/. Кроме того, учитывая новейшую информацию об альтернативных путях регуляции метаболизма СоА /vat >агі, JacKowsKi, 19вб/ у микроорганизмов, стреп-томицеты, секретируюшие СоА, могут быть использованы в качестве объектов для изучения зтоії проблемы.
В этой связи целью данной работы был поиск среди актинони-
нетов рода streptomyces активных представителей, способных секретировать СоА из клеток при глубинной выращивании, и исследование процесса образования и секреции кофермента у штамма, накапливагаего кофермент в среде культивирования.
Достижение поставленной пели требовало решения следующих экспериментальных задач:
скрининг представителей рода streptomyces по способности накапливать СоА в среде культивирования,
выявление условий культивирования, способствующих накопление кофермента,
исследование взаимосвязи внутриклеточного пула СоА с его секрецией, '
контроль стабильности секретированного СоА,
исследование активности СоА-синтезирушего ферментного комплекса, с применением предшественников биосинтеза.
- изучение возможностей изотахофоретического метода анализа СоА применительно к контролю биосинтеза кофермента.
научная новизна лі..пржтагащ)е„,.зшше„,ра,ботн-
Впервые показано, что микроорганизмы рода sxreptomyce» накапливают вне клеток кофермент А, найден оригинальный продуцент, активно выделяющий СоА в среду культивирования - strep-tomycfes lavenduiae, что подтверждено авторским свидетельством
No. 1117316.
выделение СоА из клеток стимулируют глицерин и нитрат-, секреция связана с активным ростом s. lavenduiae, Выязлена существенная роль Фосфата в накоплении кофермента - лимитирование по Фосфору в среде культивирования существенно повышает активность внеклеточной щелочной ФосФатаэы, которая является одним из агентов, участвующих в деградации секретированного СоА. Количество СоА, обнаруживаемое вне клеток, отражает разницу между активностями секреции и внеклеточной'деградации; Фактические количества секретированного СоА у s. lavenduiae существенно выае.
Показана возможность биосинтеза СоА из предшественников (АТР, пантотената, цнстеина) у streptomyces lavenduiae при использовании- высушенных клеток в качестве Ферментного препарата, синтезирующего кофермент.
Разработан новый метод определения СоА, основанный на принципах изотахоФоретического анализа.
Совокупность' полученных данных указывает на возможность дальнейшей селекции стрептомииетов - продуцентов СоА путем снижения деградативных активностей и стимуляции биосинтеза-
Апробация работы. Результаты исследований доложены на iv Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки"
(ТбИЛИСИ. 1985), III (КОбУЛеТИ, 1986) и IV (Ташкент, 1988)
Всесоюзных конференциях "Биосинтез Ферментов микроорганизмами", XIV КеЖДУНаРОДНОМ Съезде ИИКРОбИОЛОГОВ "Microbe '86"
(Манчестер, Англия, 1966), и семинаре микробиологов Геттин-гена и Риги (Геттинген, ФРГ, 1989), а-также на нескольких конференциях молодых ученых (Рига, 1984, 1985, 1987).
публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в в печатных работах, из которых і авторское свидетельство, з журнальные статьи и і тезиса докладов конференций-
Структура и объем диссертации, диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава D, материалов и методов (Глава г), результатов исследований (Глава з>, обсуждения результатов (Глава 4), выводов, списка использованной литературы и приложения- Работа содержит 125 страниц машинописного текста, " включая 17 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает' 179 источников.