Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема ферментативной конверсии целлюлозы, несмотря на интенсивное изучение в течение последних 30 лет, продолжает оставаться в центре внимания специалистов различного профиля - микробиологов, биохимиков, бг.отех-нологов. Особый интерес вьзызает природа явлений, протегаюших при глубоком гидролизе наиболее труднодоступной, высокоупсря' доченной целлвлозы в составе растительной клеточной стенки, где она образует сложную надмолекулярную структуру, с другими биополимерами, в первую очередь, с леткином.
Именно поэтому в последнее время внимание привлекают вопросы, связанвкз с биосинтезом целлкшаз на средах, содержащих лкгноцеллвлозные растительные субстраты с низким содержанием це^лолозы. На этом направлении многие отечественные и зарубежные авторы' видят перспективу оптимизации ферментного комплекса для утилизации-наиболее труднодоступной, экранированной лигнином углеводной части субстрата.
Несмотря на наличие отдельных публикаций, -в настоящее время механизм синтеза целлшлаз на таких трудкометаболизируе-шх нерастворимых субстратах изучен кедос-гаточшх Известно лишь, что такие субстраты могут вызывать как активацию, такті репрессии синтеза целлюлаз. Имеющиеся в литературе-'сведения показывают, что значительные резервы в повышении^ уровня биосинтеза целлюлаз у грибов могут заключаться в "использовании труднометаболгаируемых соединений углерода наряду с-легкомета-болизкруемыни. не вызывающими катаболитной репрессии.
В этой связи особый интерес представллет создание новых штаммов, адаптированных к синтезу цедлшолитическнх -феркентов на средах..с труднодоступной целлюлозой, а такте изучение ферментных комплексов,-участвущих в деградации таких трудномета-болизируекых субстратов. Как известно, до настоящего времени нет единой точки зрения на механизм ферментативного разложения наиболее труднодоступной части природной целлюлозы и роль отдельных ферментов в этом процессе.
Дель к задачи исследований. Цель касгокпгей работы заключалась в изучении закономерностей и повышении уровня синтеза целлплаз при культивировании гриба Trichoderma reesei на средах, содержащих, в качестве соединений углерода трудно'метаболи-
- 2 -зируемые лигноцеллюлоэные субстраты, создании мутаятных .штаммов-продуцентов ферментов, адаптированных к: подобным.субстратам, изучении-их ферментного комплекса и его огличий-.ої.-коіш^"-' . лекса. известных штампов-продуцентов.
Научная вовизна работа Исследованы основные заазнамарг.
ности синтеза целлшолктических ферментов ...грибом. TTlchodenaa
reese і на средах- с проаыдьдеяным: лигноделлппозньтеу!острагаа-.яг.:
его юдификациями, при этом не обнаружено: \щзашй-'.:корре2яций v
мевду соотношением - целлюлозы и лигнина в субстрате? туровнем..?
биосинтеза цеялюлаз. - ...
Получен «утант T.-reesei- 6/16, секретирущкй:в.:>ку.цы.'урадь-:~ ную жидкость - целлюлазы с более высоким - -уровнем активяостичю сравнению с- промышленным-штаммоы -при- культивированш-на средах с труднометаболкзируемыми соединениями углерода,- -иеанедована его морфология. Шказано, что повышение целлшазной активности мутанта 6/1-6—не-связано с -изменением чувствительности к-ката-болитной репрессии.
Установлено, сто ферментный комплекс -мутанта-6/16 -харак
теризуется более -высокими- у-дельньш-экгивностяги-целлобиогид-
ролазы I, высокомолекулярной эндоглюканазы и в-гаюкозидазы,
чем комплекс-промышленного штампа. Одновременно-показано-,-/что
мутант-6/16 на средах с лигноцеллшозным-субстратом.щюдуцируі
ет-более специфичный к деградации труднодветупкой-гцешюлозы
комплекс-фермептов,--чем-промьшшенный-штамм.-
Практическая-значимость --работы. -Предложена циклическая-схема превращения лигноцеллкшозного сырья- -путем -двухстадийной обработки. -На-первой стадии проводится -ферментативный-гидролиз сырья культуральной жидкостью гриба-продуцента целлилазс образованием глюкозного сиропа С 20%). На-второй - лигнифициро-ванный -остаток утилизируется грибом-продуцентом целдюллаз с образованием высокоактивных ферментов -для стадии ферментативного гидролиза.
Разработал состав новой ферментационной среды, на которой удалось повысить целлюлазную активность Т. reesei в 2,0-3,3 раза по сравнению с традиционно используемыми средами.
Полученный в результате многоступенчатой селекции мутант 6/16 обладал в 1,5 раза более высоким уровнем синтеза целлилаз по сравнений с родительским штаммом и в 1,2 раза - по сравнению с лучшим промышленным штаммом.
Апробация работы. Результаты диссертации представлялись на Л Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), 7 Европейской конференции по использованию биомассы в знергетинз. сельском хозяйстве, экологии, промышленности (Флоренция, 1932), II Международной іганференции "Грибные целлюлозы и родственные, фзр-т менты - Trxcel 93" (Шйвик, Финляндия, 1993).
Публикации. По результатам диссертации опубликованы. 4 :пе-чатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация . состоит .на введения, обзора литературы, описания объектов- п методов. исследования, изложения результатов-и их обсукдениг..- выводов л списка цитируемой литература Работа изложена за 120 страга-цах, содержит 14 рисунков и 15 таблиц. Список циткруемой.литературы включает 143 источников.