Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы серьёзной проблемой становится широкое, распространение труднодиагносцируемых инфекций урогенитального тракта, вызываемых хламидиями и трихомонадами. Эти заболевания являются, по данным ВОЗ (1984, 1995), основной причиной бесплодия, а также фактором, приводящим к таким осложнениям, как внематочная беременность, неснагальная смертность.
Диагностика хламидисза, даже в хорошо оснащенных лабораториях, затруднительна, вследствие того, что при бактериоскопии хла-мидии (тельца Провачека) выявляются не более чем у 15-20Z неле-чившихся больных. Бактериологические методы, основанные на выделении культуры длительны и трудоёмки, могут быть выполнены лишь в единичных научных центрах и при этом не обеспечивают 100% вы-являемость хламидий (Ильин И.И. 1991; Rasmussen S. et al.l„91). Способы, основанные на иммунофлуоресценгном анализе, не отличаются хорошей специфичностью вследствие нестандартности выпускаемых наборов, хотя и могут достигать чувствительности до 90% по сравнению с посевами на культуру клеток (Скрипкин Ю.К. с соавт., 1996). Методы серологической диагностики не рекомендуют к широкому применению в связи с низкой иммуногенностью хламидий, высокой частотой ложнополохительных результатов (Овчиннучов Н.М., Делекторский В.В., 1985). Лабораторная диагностика трихомонадной инфекции обычно строится на бактериологическом анализе, который позволяет выявить возбудителя не более, чем в 60% случаев заболевания (Riley D.E.et al.1992).
Таким образом, практическое отсутствие доступных и достоверных методов детекции хламидий и трихомонад, позволяющих осуществлять своевременный диагноз и необходимый контроль за распространенностью этих инфекции,. делает актуальным создание и внедрение в практику новых диагностических тест-систем, основанных на современных достижениях медицинской науки. .
В конце 80-х годов разработан ноеьй способ детекции микроорганизмов - полимеразная цепная реакция (ЩР), которая в настоящее время стада основой нового направления в диагностике инфекционных заболеваний. Метод основан на обнаружении специфичного участка ДНК искомого микроорганизма. Главными преимуществами ЩР являются высокая специфичность и разрешающая способность, позволяющая обнаруживать 100 и менее микробных клеток в 1 мл без этапа культивирования.
В настоящее время за рубежом разработаны параметры ЩР для детекции возбудителей ряда заболеваний, передающихся половых путем (ЭШШ). Dutilh В. с соавт.(1939) и позднее Sayada С. с со-авт.(1991) сообщили о разработке ЩР для специфичной амплификации ДНК-матриц хламидий. В 1992 году Riley D. с соавт. применили ЩР для амплификации фрагмента ДНК трихомонад. Данные литературы по ПЦР-диагностике урогенитального хламидиоза и трихомониаза разноречивы и не позволяют сделать однозначный вывод о преимуществе какого-либо метода предварительной обработки проб. Не решён вопрос о выборе оптимальных праймероь (ДНК-мишени). Работ по применению ЩР для исследования различных клинических образцов при диагностике трихомониаза в доступной литературе вообще нет. До сих пор нет ясности в вопросе о возможности использования ЩР в качестве критерия излеченности больных. Поэтому вполне актуальной представляется разработка и клиническая апробация, основанных на ЩР, методических подходов, для обнаружения трихомонад и хламидий в материале от больных, а также сравнение этого генодиагностического метода с традиционными способами лабораторной диагностики данных инфекций.
Цель работы ,
Определение наиболее , эффективных методических подходов для лабораторной диагностики трихомониаза' и урогенитального хламидиоза с помощью ЩР.
Основные задачи исследования
-
Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ГЩР для специфичной амплификации ДНК-матриц трихомонад и хламидий.
-
Оценить эффективность различных способов предварительной обработки исследуемого методом ПНР материала от больных урогени-тальными ЗППП: соскобов со слизистых уретры и цервикального канала, осадка мочи.
-
Сравнить чувствительность и специфичность ПЦР и других методов лабораторной диагностики трихомониаза и урогенигального хламвдиоэа.
-
Определить оптимальные сроки обследования методом ПЦР больных трихомониазом и урогенитальным хламидиозом; оценить возможность использования метода для контроля эффективности лечения.
Научная новизна
Разработаны параметры ПЦР для детекции Trichoironas vaginalis с праймерами на основе повторяющейся последовательности ДНК трихомонад. Продемонстрирована возможность эффективного использования праймеров на основе плазмиды хламидий для выявления возбудителя хламидиоза методом ЩР.
Установлено, что наиболее универсальным методом подготовки исследуемого с помодаю ЩР клинического материала: соскобов со слизистых оболочек уретры и цервикального канала, осадка мочи -от больных трихомониазом и урогенитальным хламидиозом является лизис клеток гуанидгагиоцианатом с нуклеосорбцией ДНК на силика-геле с размером частиц 0,5-10,0 мкм. -,
Показано преимущество диагностической точности ПЦР по сравнению с традиционными методами лабораторной диагностики трихомониаза (бактериоскопия и кудьтуральный метод) и урогенитального хламгдиоза: прямым иммунофлуоресцентным анализом (ПИФ) и иммуно-ферментным анализом (ИФА). Отмечено 100% совпадение результатов, полученных с использованием ШР и культурального метода при детекции С. trachomatis.
Получены данные, свидетельствующие о возможности применения
- б -
ЩР для контроля эффективности проводимой терапии и в качестве критерия излеченности трихомониаза и урогенитального хламидиоза. Показано, что.больных следует обследовать с применением метода ЩР не ранее, чем через 14 дней после окончания курса лечения.
Практическая значимость
Разработанные методические подходы для детекции трихомонад и хламидий при помощи ЩР в клиническом материале изложены в учебно-методических рекомендациях "Диагностика и лечение инфекционных заболеваний моче-половой сферы негонококковой этиологии", изданных типографским способом департаментом здравоохранения Саратовской области и Саратовским Государственным медицинским университетом. Предложенные оригинальные методики подтверждены пятью удостоверениями на рационализаторские предложения выданными Саратовским медицинским университетом: N2022 "Устройство для промывания уретры", N2024 "Устройство для лечения уретритов", N2043 "Устройство для комбинированного эндовагинального и эндоцервикального электрофореза", N2051 "Способ обнаружения уро-генитального хламидиоза", N2081 "Способ лечения урогенитадьного хламидиоза у мужчин". На разработанное устройство для промывания уретры получено свидетельство на полезную модель ВНИИ Государственной патентной экспертизы (N96113993/20 от 10.07.96 г.)
Основные положения, выносимые на защиту
-
Предложенные олигонуклеотидные праймеры на основе повторяющейся последовательности ДНК Т.vaginal is и фрагмента плазмиды С.trachomatis обеспечивают специфичную амплификацию соответствующих "V нукдеогидных последовательностей и могут быть использованы в ЩР для детекции трихомонад и хламидий в клиническом материале.
-
Способ выделения ДНК-мишеней 'с помощью лизиса гуанидин-тиоцианатом с нуклеосорбцией на силикагеле эффективен при детекции методом ЩР Т. vaginalis и С. trachomatis в соскобах со слизистых оболочек уретры и цервикального канала, а также в осадке
- ? -
первой порции мочи.
-
Основанный на ПНР способ обнаружения трихомонад превосходит по своей разрешающей способности бактериоскопию и культу-ральный метод, ПЦР позволяет осуществлять лабораторную диагностику уроге.читального хламидиоза с большей точностью по сравнению с иммунофлуоресцентным (детекция антигена) и иммуноферментньм (выявление антител) методами и сопоставим с культуральным методов обнаружения С. trachomatis.
-
ПЦР может быть использована для контроля эффективности лечения и в качестве критерия излеченности трихомониааа и уроге-нитального хламидиоза.
Апробация работы и кублккацш
Материалы диссертации были представлены на 1 Международной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины" (Бишкек, 1994); на I Международной региональной конференции по СПИД и СІВД-ассоциированным инфекциям (Санкт-Петербург, 1994); на научной конференции "Проблемы новаторской деятельности учёных, изобретателей и других творческих работников в условиях реформирования экономики" (Саратов, 1996); на VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996); на итоговых заседаниях Ассоциации дерматовенерологов Саратовской области (1994, 1995 г.), Ассоциации медицинской лабораторной диагностгот Саратовской области (1994), итоговой научной конференции РосНИП-ЧИ "Микроб" (1995)
Основные результаты диссертации изложены в б опубликованных работах. Список публикаций приводится в конце автореферата.
Структура и ойъби диссертации
Диссертация состоит из введения и пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, реаультаты собственных исследований, а также общего заключения и выводов. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 рисунками и 11 таблицами. Список литературы содержит НО цитируемые работы, из них 94 - статьи зарубежных автороц.