Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Особенности биологии аэробных метанотрофов 9
1.1. Экология метанотрофных бактерий 9
1.2. Систематика метанотрофных бактерий 14
1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов 16
1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов , 23
1.5. Поверхностные структуры метанотрофов 29
Глава II. Биоразнообразие галоалкалофильных и термофильных бактерий 32
2.1. Содовые озера - источник галоалкалофильных микроорганизмов 32
2.2. Стратегии адаптации бактерий к высоким значениям солености и рН 34
2.3. Термотолерантные/термофильные бактерии 38
Экспериментальная часть 41
Глава III. Материалы и методы 41
3.1. Объекты исследования 41
3.2. Измерение потребления СН4 в пробах донных осадков 41
3.3. Определение активности нитрификации в пробах донных осадков 42
3.4. Культивирование метанотрофов 42
3.5. Выделение чистых культур (гало)алкалофильных метанотрофов I типа 43
3.6. Выделение галоалкалотолерантных метанотрофов II типа 44
3.7. Выделение чистых культур умеренно-термофильных метанотрофов 44
3.8. Изучение физиологических свойств галоалкалофильных метанотрофов I типа 45
3.9. Изучение физиологических свойств штамма БЗ 46
3.10. Изучение физиологических свойств умеренно-термофильных метанотрофов 47
3.11 Определение чувствительности к антибиотикам 48
3.12. Определение активности ферментов 48
3.14. Аналитические определения 51
3.15. Влияние ингибиторов на скорость роста Methylomicrobium buryatense 5Б 55
3.16. Выделение экзополисахарида Methylomicrobium buryatense 5Б и определение его мономерного состава 55
3.17. !Н ЛМР-анализ осмопротекторов и гликогена 55
3.18. ВЭЖХ метод определения содержания эктоина в биомассе 55
3.19. Световая и электронная микроскопия клеток метанотрофов 56
3.20. Молекулярно-генетические методы и филогенетический анализ 57
3.21. Экстракция белка S-слоев 'Methylomicrobium alcaliphilum' 20Z 61
3.22. Самосборка структуры S-слоев in vitro 61
3.23. Дансилирование поверхностных белков 61
3.24. Гель-фильтрация белка S-слоев 61
3.25. ДСН-ПААГ белка S-слоев 62
2.20. Иммуноблотинг белка S-слоев 62
3.20. Трипсинолиз белка S-слоев в ПААГ и масс-спектроскопическая фрагментация пептидов 63
Результаты и обсуждение 64
Глава IV. Потребление метана и окисление аммония в пробах содовых озер 64
Глава V. Выделение и характеристика (гало)алкалофильных/толерантных метанотрофов 68
5.1. Выделение и характеристика (гало)алкалофильных метанотрофов I типа 68
5.2. Выделение и характеристика галоалкалотолерантного метанотрофа II типа 70
5.3. Пути метаболизма галоалкалофильных/толерантных метанотрофов 72
5.4. Осмоадаптация новых метанотрофных изолятов 74
5.5. Филогенетическое и таксономическое положение 75
Глава VI. Физиолого-биохимические и цитологические особенности Methylomicrobium buryatense 5Б при росте на метаноле 82
6.1. Физиолого-биохимические особенности 82
6.2. Цитологические особенности 86
6.3. Этимологический анализ 86
Глава VII. Выделение и характеристика белка поверхностных гликопротеиновых структур 'Methylomicrobium alcaliphilum'20Z 90
Глава VIII. Выделение, характеристика и определение таксономического положения
новых умеренно термофильных метанотрофов 94
8.1.1. Выделение и характеристика штаммов Н-11 и 0-12 94
8.1.2. Особенности метаболизма 100
8.1.3. Филогенетическое и таксономическое положение штаммов Н-11 и 0-12 102
8.2.1. Выделение и характеристика штамма MYHT 109
8.2.2. Филогенетическое и таксономическое положение штамма MYHT 112
Заключение 115
Выводы 117
Литература 118
- Экология метанотрофных бактерий
- Содовые озера - источник галоалкалофильных микроорганизмов
- Определение активности нитрификации в пробах донных осадков
- Выделение и характеристика (гало)алкалофильных метанотрофов I типа
Введение к работе
Актуальность темы. Метанотрофы - физиологически и биохимически специализированная подгруппа аэробных метилотрофных бактерий, использующих метан и метанол в качестве источников углерода и энергии. Метанотрофы активно участвуют в круговороте углерода, азота и других макроэлементов в биосфере, составляя основу бактериальных фильтров, снижающих эмиссию метана и других парниковых газов в атмосферу. В последние полвека весьма основательно исследованы процессы метанокисления и биология метанотрофных бактерий пресноводных, почвенных и морских экосистем (Малашенко с соавт., 1978; 1993; Гальченко с соавт., 1986; Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Гораздо менее изучены метанотрофы биотопов с высокими значениями рН, солености и температуры, включая содовые, соленые и термальные водоемы (Троценко, Хмеленина, 2002; Trotsenko, Khmelenina, 2002).
Системное изучение соленых и содовых озер (рН 9.0 - 10.5, минерализация до 300 г/л) на наличие метанотрофов и их роли в галоалкалофильных микробных сообществах было начато 10 лет назад. Первые изоляты галоалкалофильных метанотрофов из озер Тувы и Крыма были условно идентифицированы как 'Methylobacter alcaliphilus' (Khmelenina et al., 1997). Позднее был вьщелен и описан нейтрофильный галофил 'Methylobacter modestohalophilus' (Калюжная с соавт., 1998), а также галоалкалофильный метанотроф Methylomicrobium sp. AMOl (Sorokin et al., 2000). Вполне очевидно, что эти изоляты не могут охватить потенциальное экофизиологическое и таксономическое многообразие галоалкалофильных метанотрофов.
Спектр коллекционных термофильных и термотолерантных метанотрофов долгое время ограничивался видами рода Methylococcus (Foster and Davis, 1966; Малашенко с соавт., 1975). Интенсивные исследования термальных источников Венгрии и Японии с применением классических и молекулярных методов, а также ревизия рода Methylococcus привели к выделению умеренно термофильных метанотрофов в новый род Methylocaldum, растущий в диапазоне 37-62С (Bodrossy et al., 1995; 1997). Однако большинство этих изолятов, включая ''Methylothermus1 НВ, способный к росту при температуре до 72С, были утеряны (Bodrossy et al., 1999).
Успехи в исследовании таксономического разнообразия галоалкало- и термофильных метанотрофов открывают новую увлекательную страницу в расшифровке их структурно-функциональных особенностей. В то же время крайне ограниченная информация о механизмах осмо- и термоадаптации метанотрофов создает широкое поле деятельности для специалистов, использующих методы классической и молекулярной микробиологии.
Цель и задачи исследования. Цель работы - выделение, характеристика и изучение особенностей биологии новых галоалкалофильных и термофильных/толерантных метанотрофов. Для достижения этой цели в работе решались следующие основные задачи:
Определение потенциальных скоростей потребления метана и окисления аммония в содовых водоемах Юго-Восточной Сибири, Монголии, Египта и Северной Америки.
Вьщеление и таксономическая характеристика новых штаммов галоалкалофильных метанотрофов и изучение их физиолого-биохимических и цитологических свойств.
Выделение и таксономическая характеристика новых штаммов термофильных метанотрофов, изучение их физиолого-биохимических и цитологических свойств.
Научная новизна работы. Методами полифазной таксономии охарактеризованы новые изоляты умеренно галоалкалофильных и термофильных метанотрофов. Штамм 5Б описан как новый вид (гало)алкалофильных метанотрофов Methylomicrobium buryatense. Штаммы ФМЗ, МЛ1 и ЕЗ отнесены к ''Methylomicrobium alcaliphilum'. Из проб содовых озер впервые выделен метанотроф II типа, классифицированный как Methylocystis echinoides. Обнаруженные умеренно-термофильные метанотрофы 0-12 и Н-11 отнесены к известному виду Methylocaldum szegediense, а штамм MYHT описан в качестве нового рода и вида Methylothermus thermalis. Показана, способность новых галоалкалофильных метанотрофов I типа к накоплению осмопротекторов: эктоина, глутамата и сахарозы в ответ на повышение солености среды. Впервые исследованы механизмы адаптации Methylomicrobium buryatense 5Б к высокой концентрации метанола (до 1.75М). Адаптация к метанолу сопровождалась редукцией внутрицитоплазматических мембран, появлением гранул гликогена в клетках, а также накоплением в среде формальдегида, формиата и гетерополисахарида. Выделен и изучен белок Sip поверхностных гликопротеиновых структур у 'Methylomicrobium alcaliphilum' 20Z, формирующий S-слои. Выявлены существенные изменения морфологии клеток, а также состава фосфолипидов и жирных кислот у Methylocaldum szegediense 0-12 и Н-11 в зависимости от температуры культивирования. Полученные результаты углубляют представления о распространении, таксономическом, структурно-функциональном разнообразии и экофизиологической роли метанотрофов.
Практическое значение. Значительно расширен спектр коллекционных культур метанотрофов устойчивых к высоким значениям рН, солености и температуры, перспективных для биоремедиации окружающей среды. Способность новых изолятов к накоплению экзополисахарида и осмопротекторов, используемых для стабилизации
биомолекул и клеток, позволяет считать их потенциальными продуцентами этих соединений. Разработан метод определения осмопротектора эктоина в биомассе нормально-фазовой ВЭЖХ. Способность галоалкалофильных и термофильных метанотрофов образовывать поверхностные S-слои может найти применение в нанотехнологии и биомедицине.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных конференциях молодых ученых г. Пущино (2001-2005), Всероссийской школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), Съезде миробиологического общества Германии VAAM'2002 (Геттинген, Германия, 2002), на 8ой Международной конференции по соленым озерам (Хакасия, 2002), Гордоновских научных конференциях (США) «Молекулярные основы микробного Сі метаболизма» (Нью Хевен, США, 2000; Коннектикут колледж, США, 2002; Маунт Холиок колледж, США, 2004), 1-ом Конгрессе европейских микробиологов (Любляна, Словения, 2003), на Всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2003), на молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (1999-2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей и 10 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 335 ссылок, содержит 23 таблицы и 24 рисунка.
Автор искренне признателен всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов способствовавшим выполнению данной диссертационной работы, а также д.б.н., проф Намсараеву Б.Б. (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г.Улан-Удэ), д.б.н., проф. Горленко В.М., д.б.н. Сорокину Д.Ю (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г.Москва), д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа ак. Исакова Ю.Ф., РАМН, г.Москва), к.б.н. Калиману А.В. (Институт Белка РАН), Серебряковой М.В. (Институт биомедицинской химии, г.Москва), к.б.н. Сузиной Н.Е., к.х.н. Сахаровскому В.Г., к.х.н. Шляпникову М.Г, к.х.н. Аданину В.М., Ильченко В.Я.
Особую благодарность автор выражает своим учителям д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и к.б.н. Хмелениной В.Н.
Экология метанотрофных бактерий
Метан - второй по значимости парниковый газ после СОг, но обладает в 26 раз большим парниковым эффектом (Hanson, Hanson, 1996). Ежегодный прирост метана в атмосфере Земли составляет примерно 1% (около 40 Тг/год), причем за последние 300 лет его количество возросло с 0.75 ppmv до 1.7 ppmv (Lelieveld et al., 1993). Около 80-90% атмосферного метана имеет биогенное происхождение и главной причиной возрастания уровня СН4 является активная хозяйственная деятельность человечества (Henckel et al., 1999). Выход метана в атмосферу обусловлен дисбалансом между процессами его образования и потребления. Несомненно, метанокисление, осуществляемое в основном метанотрофами ("бактериальным газовым фильтром") - ключевой биохимический процесс, регулирующий поток метана. Значительным событием последнего времени стало открытие у растений способности выделять метан. С использованием стабильных изотопов было показано, что растения выделяют метан in situ в присутствии кислорода неизвестным способом. Согласно расчетам, растительность Земли ежегодно может выделять в атмосферу от 62 до 236 Тг метана (Keppler et al., 2006). С учетом этих данных могут быть внесены существенные корректировки в оценку потоков метана в атмосферу из возможных источников.
Метанотрофные популяции в пресноводных и почвенных экосистемах образуют мощный биофильтр на пути метана в атмосферу, благодаря чему окисляется до 90% метана вблизи мест его образования (Малашенко с соавт., 1975; Нестеров, Иванов, 1983; Holmes et al., 1999). Около 20-60 Тг/год атмосферного метана окисляется в аэробных почвах и примерно 450 Тг/год, благодаря фотохимическим реакциям (Reeburgh et al., 1993). Окисление СН4 в почвах - важный процесс, сопоставимый с эмиссией метана в атмосферу. Соответственно, изменения ландшафтов человеком отрицательно сказываются на балансе метана (Henckel et al., 2000).
При изучении распространения аэробных метанотрофов в природных экосистемах используют радиоизотопные, иммунологические, биохимические и молекулярно-биологические методы детекции и идентификации (Murrell et al., 1998; Dedysh et al., 2003). Эти комплексные подходы, позволяющие обнаружить метанотрофов различных таксономических групп, основаны на наличии универсальных маркеров, таких как специфичные профили жирных кислот, рибосомные и группоспецифичные функциональные гены. Наиболее часто используемым генетическим маркером является ген ртоА, кодирующий сс-субъединицу мММО, которая присутствует практически у всех известных аэробных метанотрофов, за исключением представителей рода Methylocella.
Данные филогенетического анализа последовательности генов ртоА и 16S рРНК, как правило, коррелируют, что позволяет определить родовую и даже видовую принадлежность метанотрофов. Лишь у ряда метанотрофных изолятов КЗ-16 и К1-8, близких к Methylocystis и Methylosinus по последовательности 16S рДНК, выявлены существенные различия в последовательности гена ртоА (Pacheco-Oliver et al., 2002). С применением молекулярно-биологических методов показано присутствие известных метанотрофов почти во всех экосистемах: болотах, луговых, альпийских, лесных и арктических почвах, сточных водах, иле пресных водоемов и донных морских отложениях, почвах нефтегазоносных районов и т.д. (Малашенко с соавт., 1978; 1993; King, 1990; Murrell et al., 1998; Holmes et al., 1999; McDonald et al., 1999; Гальченко, 2001; Pacheco-Oliver et al., 2002). Использование молекулярно-биологических методов позволило выявить новые, как правило, некультивируемые группы метанотрофов, активные in situ и способные потреблять метан в очень низких концентрациях, соответствующих его содержанию в атмосфере (Holmes et al., 1999; Horz et al., 2005; Knief et al., 2003, 2005).
Исследованию разнообразия и активности метанотрофов различных почв уделяется много внимания, поскольку они вносят существенный вклад в потребление атмосферного метана. Долгое время агенты, ответственные за потребление атмосферного метана в почвах, оставались неизвестными. Недавно показано, что атмосферный метан потребляется метанотрофами, обладающими ММО с большим сродством к СН4. Км для почвенных метанотрофов к метану варьирует от 0.8 до 280 нМ, что на 2-3 порядка ниже, чем у культивируемых метанотрофов (Bender, Conrad, 1992; Benstead, King, 1997; Gulledge, Schimmel, 1998; Dunfield et al., 1999). Из нейтральных почв, богатых органикой, выделен метанотроф II типа Methylocystis sp. LR1 с Км к метану 56-186 нМ при его концентрации 275 ppmv, причем значение Км повышалось с увеличением концентрации метана (Dunfield et al., 1999). Обнаружено, что атмосферный метан в количестве 1.7 ppmv окисляется в различных почвах неизвестными метанотрофами, близкими по профилю жирных кислот к метанотрофам II типа (Roslev, Iversen, 1999).
Исследования микробиоты этих почв на разнообразие гена ртоА выявили новую группу RA14, которая кластеризовалась с известными метанотрофами II типа, но имела существенные различия (Holmes et al., 1999; Henckel et al., 1999, 2000). После инкубации образцов почв с 14С-метаном в концентрации, близкой атмосферной, найдены жирные кислоты, нетипичные для известных метанотрофов. Это позволило предположить существование новой группы метанотрофных альфапротеобактерий, окисляющих атмосферный метан (Holmes et al., 1999), что подтвердили дальнейшие исследования (Bull et al., 2000; Roslev, Iversen, 1999).
Близкие к группе RA14 последовательности гена ртоА обнаружены в различных слабокислых почвах и сгруппированы в отдельный кластер «forest sequence cluster» или USCa (upland soil cluster) (Holmes et al., 1999; Henckel et al., 1999, 2000; Bourne et al., 2001; Jensen et al., 2000; Knief et al., 2003). Среди известных метанотрофов II типа наиболее близок по последовательности гена ртоА к кластеру USCa Methylocapsa acidiphila (Dedysh et al., 2002). Первые геномные данные для USCa метанотрофов, полученные из метагеномных библиотек, подтверждают их принадлежность к альфапротеобактериям и сходство с Ma. acidiphila, а также указывают на наличие типичного консервативного кластера генов ртоСАВ с характерными свойствами (Ricke et al., 2005). Доминирование USCa метанотрофов в слабокислых почвах показано методом ПЦР в реальном времени гена ртоА и матричной РНК (Kolb et al., 2005).
В нейтральных почвах обнаружены метанотрофы нового кластера USCy, группирующиеся по генам 16S рДНК и ртоА с метанотрофами I типа (Knief et al., 2003). Установлено, что численность данной группы бактерий достигает лишь 5% от общего числа метанотрофов в исследуемых почвах, а доминируют представители группы «Cluster I» (Kolb et al., 2005). Новая группа метанотрофов впервые была выделена из арктических почв (Pacheco-Oliver et al., 2002). Доминирование метанотрофов данной группы в нейтральных почвах показано анализом флуоресцентно меченных рестрикционных фрагментов гена ртоA (Ricke et al., 2005). Таким образом, стало ясно, что за потребление атмосферного метана в почвах с различными рН ответственны определенные доминирующие группы метанотрофов, которые пока не удается идентифицировать и культивировать.
Содовые озера - источник галоалкалофильных микроорганизмов
Галоалкалофильные микроорганизмы выработали в процессе эволюции несколько механизмов адаптации для успешного выживания в экстремальных условиях обитания. Во-первых, накопление внутри клеток неорганических ионов или низкомолекулярных органических веществ для компенсации внешнего давления (Galinski, 1995). Во-вторых, необходимость поддержания рН-гомеостаза и, следовательно, функционирование Na+/H+ антипорта (Скулачев, 1985). В-третьих, использование Na+ вместо протона в качестве сопрягающего иона для получения энергии (Скулачев, 1985). Кроме того, имеет место замена или модификация клеточных компонентов, в том числе изменение жирнокислотного и фосфолипидного состава мембран (Kates, 1986), а также формирование дополнительных поверхностных структур (Beveridge et al., 1997)
Осмопротекторы. Для поддержания тургора клеток в гиперосмотических условиях галоалкалофильные/толерантные микроорганизмы реализуют две стратегии. Первая стратегия, характерная для прокариот, заключается в аккумуляции в цитоплазме ионов К+ и СГ для уравновешивания осмолярности среды обитания (Roberts, 2004). Присутствие высоких внутриклеточных концентраций солей вызывает агрегацию и разрушение структуры белков, вследствие усиления гидрофобных взаимодействий внутри пептида, а также между белковыми молекулами, что требует специальной адаптации всего ферментативного аппарата клетки (Кашнер, 1981; Madigan, Oren, 1999; Hough, Danson, 1999).
Вторая стратегия является более гибкой и разнообразной и обусловлена биосинтезом de novo или транспортом из внешней среды микроорганизмами органических «совместимых» низкомолекулярных веществ - осмопротекторов (Galinski, 1995). Осмопротекторы могут накапливаться в значительных количествах без влияния на метаболизм клетки и поддерживают ее тургор в гиперосмотических условиях. Осмопротекторы принадлежат к разным классам соединений, включая сахара, полиолы, первичные и вторичные аминокислоты, эктоины, бетаины и другие соединения (Roberts, 2005). Основными свойствами осмопротекторов являются хорошая растворимость в воде и относительная метаболическая инертность. К настоящему времени довольно детально определены пути биосинтеза основных осмопротекторов (Peters et al, 1990; Galinski, 1995; Roberts, 2005). Многие бактерии накапливают одновременно несколько осмопротекторов, при этом преобладание того или иного осмолита во многом определяется энергетическим статусом клетки и доступностью источника азота. Теоретические расчеты показывают, что для бактерий наиболее энергетически выгоден биосинтез эктоина, нежели других органических осмопротекторов (Oren, 1999).
рН-гомеостаз. Главная проблема микроорганизмов, растущих при высоком рН, является рН-гомеостаз, т.е. поддержание внутриклеточного pHj в пределах, близких к нейтральному. Эта регуляция должна быть оперативной и эффективной во избежание ингибирования роста и даже гибели клеток. Для алкалофильных бактерий различных физиологических групп показано, что значение внутриклеточного рН не превышает 9.0 -9.5 при рН среды 10.5- 11.5 (Krulwich, 1995). Для поддержания pHj на определенном уровне клетки используют как пассивный, так и активный механизмы. К пассивным механизмам можно отнести снижение проницаемости мембран для ионов и забуферивание цитоплазмы аминокислотами белков, органическими осмолитами (Booth, 1985). Активные механизмы включают транспорт ионов натрия, калия и протонов.
В регуляции pHj у алкалофилов главную роль играют ионы натрия и калия, отсутствие которых подщелачивает цитоплазму клеток (Krulwich et al, 1996; Booth, 1999). Множество данных подтверждает гипотезу, что главную роль в рН гомеостазе и поддержании натриевого градиента играет Ма+/Н+-антипортер, осуществляющий электрогенный обмен цитоплазматического натрия на протон из среды, что приводит к подкислению цитоплазмы (Hicks, Krulwich, 1995). Мутация антипортер-кодирующих генов у алкалофилов вызывает полную или частичную потерю способности расти при щелочном значении рН (Hamamoto et al., 1994). Однако Booth (1999) считает, что это является следствием токсичности ионов натрия, а На+/Н+-антипортеры важны для поддержания Ыа+-гомеостаза и градиента ионов натрия, необходимых для осуществления транспорта веществ в клетку, но не для регуляции цитоплазматического рН (Padan and Schuldiner, 1994). Важную роль для рН-гомеостаза и поддержания внутриклеточного пула натрия играют Ыа+-связанные транспортеры органических веществ и Иа+-симпортеры (Krulwich et al., 1985b). В отсутствие органических веществ для симпортеров и транспортеров важную роль в поддержании градиента Na+ могут играть Na+-транслоцирующие каналы, связанные с двигательным аппаратом (Sugiyama, 1995).
Натриевая энергетика. Концепция Ма+-цикла (Скулачев, 1985), предполагает, что Na+ может использоваться вместо протона в качестве сопрягающего иона. Для некоторых видов бактерий показано, что повышение щелочности среды индуцирует работу основных Na+ насосов, например, Ма+-транспортирующих ферментов дыхательной цепи и Na+-АТФазы (Коуата, 1996; Kaieda et al., 1998; Prowe et al., 1996). Электрогенный выброс натрия через эти насосы создает электрохимическую разницу потенциалов (Ддыа+), состоящую из мембранного потенциала ДЧ и ионного градиента ApNa+. Дцма+ затем используется для совершения различных типов работы, например, у Vibrio alginolyticus -для транспорта растворенных веществ против градиента концентрации (Tokuda et al., 1982), вращения жгутика (Chernyak et al., 1983) и дыхательного фосфорилирования (Dibrov et al., 1986). При этом АЧ1, составляющая Ди№+, может поддерживать электрофоретическое поступление Н+ для предотвращения защелачивания цитоплазмы.
Определение активности нитрификации в пробах донных осадков
Влияние концентрации NaCl и рН среды на рост чистых культур.
Использовали среду "П" с добавлением различных концентраций NaCl (0-10 %) при оптимальном значении рН. Влияние рН среды на рост культур определяли, выращивая клетки на среде "П" при оптимальной солености в диапазоне рН от 6.5 до 11.0. Соответствующие значения рН устанавливали добавлением Na-карбонатного (рН 8.5-10.5), NaOH-фосфатного (рН 11) или фосфатного (рН 6.5-8.5) буферов до конечной концентрации 50 - 100 мМ. Удельную скорость роста бактерий в экспоненциальной фазе рассчитывали по известным формулам (Перт, 1978): _ ъ_2 ъ_о_ ч-1 где j е =о543429, хо и xt - начальная и конечная плотность клеточной суспензии в моменты to и t.
Способность метанотрофов использовать различные источники углерода проверяли на среде "П" при оптимальных для данной культуры значениях солености и рН с добавлением (в концентрации 0.01%): метанола, формальдегида, формиата, метиламина, триметиламина, тетраметиламмония, диметилформамида, цитрата, малата, сукцината, пирувата, ацетата, глюкозы, маннита, мальтозы, арабинозы, ксилозы, сахарозы, этанола или глицерина.
Способность изолятов к росту на различных источниках азота проверяли на безазотистой агаризованной среде "П" при оптимальных для данной культуры значениях солености и рН с добавлением (в концентрации 0.05%): KNO3, NaN02, (NH4)2S04, метиламина, мочевины, глицина, L-аланина, L-глутамата, L-пролина, L-аспартата, L триптофана, казаминовых кислот или дрожжевого экстракта.
Влияние концентрации карбонатов на рост чистых культур. Использовали среду «П» с различными концентрациями карбонатов, которые устанавливали смесью 1 М №НСОз и 1 М ЫагСОз. При этом рН поддерживали в диапазоне 9.0 - 9.5. Соленость среды варьировали от 0% до 3% NaCl. Влияние температуры на рост чистых культур определяли при периодическом перемешивании на средах «П» при оптимальных значениях рН и концентрации NaCl.
Влияние состава среды на рост и потребление метана изучали на основе среды «П», разбавленной в 4 раза, с добавлением ИаНСОз до 12.5 мМ. рН среды составлял примерно 9.5. В эксперименте количество фосфатов, СаСЬ, MgS04, KNO3 и микроэлементов увеличивали в четыре раза по сравнению с базовым уровнем. Контролями служили среды «П» и «П», разбавленная в 4 раза. За ростом изолята следили по изменению оптической плотности суспензии клеток в спектрофотометре Specol 221 при длине волны 600 нм.
Влияние рН среды на рост культур определяли, культивируя клетки на среде "П", разбавленной 4 раза, при оптимальной солености в диапазоне рН от 6.5 до 10.5. Соответствующие значения рН устанавливали добавлением Na-карбонатного (рН 8.0-10.5) или фосфатного (рН 6.5-8.0) буферов до конечной концентрации 20-50 мМ. Для выявления диапазона и оптимума солености в среду (при рН 9.0) вносили различные количества NaCl (0-2 %).
Способность культуры использовать различные источники углерода проверяли на среде "П", разбавленной в 4 раза, при оптимальных значениях солености и рН с добавлением (в концентрации 0.01%): метанола, формальдегида, формиата, метиламина, триметиламина, тетраметиламмония, диметилформамида, цитрата, малата, сукцината, пирувата, ацетата, глюкозы, маннита, мальтозы, арабинозы, ксилозы, сахарозы, этанола или глицерина.
Влияние температуры на рост чистых культур определяли при периодическом перемешивании на среде «П», разбавленной в 4 раза при оптимальных значениях концентрации NaCl и рН. ЗЛО. Изучение физиологических свойств умеренно-термофильных метанотрофов
Влияние концентрации соли, рН среды и температуры на рост чистых культур 0-12 и Н-11 изучали, выращивая бактерии на среде «2П». Влияние соли на рост определяли, добавляя в среду NaCl в концентрациях 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 и 4.0%. Соответствующие значения рН устанавливали добавлением фосфатного (рН 5.5 - 8.5) и Na-карбонатного (рН 9-10) буферов, до конечной концентрации 50 мМ. Диапазон и оптимум температур для роста определяли на термокачалке Clim-O-Shake (Швейцария) при 26 - 63 С и 100 об/мин.
Способность изолятов к росту на различных источниках углерода проверяли на агаризованной среде "2П" при оптимальных для данной культуры значениях солености и рН с добавлением (в концентрации 0.01%): метанола, формальдегида, формиата, глюкозы, ацетата, цитрата, малата, сукцината, пирувата или сахарозы.
Способность изолятов к росту на различных источниках азота тестировали на безазотистой агаризованной среде "2П" при оптимальных для каждой культуры значениях солености и рН с добавлением (в концентрации 0.1%): (NH SO NaN03, NaN02, формамида, лизина, глутамина, аспарагина, аспартата, казаминовых кислот, цистеина, триса, мочевины или дрожжевого экстракта.
Способность штаммов расти автотрофно в атмосфере Нг и СОг определяли по ранее описанному методу (Bodrossy et al., 1997).
Диапазон и оптимум температур для роста штамма MYHT изучали на модифицированной среде «НВ1» в термошейкере Clim-O-Shake при температурах 26 - 69 С и скорости перемешивания 100 об/мин.
Влияние рН среды на рост культуры определяли при температуре 57С. Соответствующие значения рН устанавливали добавлением фосфатного (рН 5.5 - 8.5) буфера до конечной концентрации 0.025 М.
Влияние соли на рост культуры определяли, добавляя в среду «НВ1» NaCl до конечной концентрации 0.25, 0.5, 1, 2 и 3% при рН 6.8. Влияние ионов меди на скорость потребления метана определяли радиоизотопным методом, добавляя в среду CuS04 5H20 в концентрации 0, 0.5,1,2 и 4 цМ на фоне 0.4 цМ CuSCv5H20 в среде «НВ1» при 57 С.
Выделение и характеристика (гало)алкалофильных метанотрофов I типа
Для выделения метанотрофов I типа образцы ила исследуемых озер культивировали на полной среде "П" в присутствии карбонатного буфера. Из всех образцов были получены накопительные культуры, представлявшие собой трудноразделимые ассоциации метанотрофов и их гетеротрофных спутников. В накопительных культурах преобладали клетки овальной и вибриоидной формы, характерные для метанотрофов I типа. В большинстве случаев клетки были подвижными. С использованием нескольких приемов очистки метанотрофов от гетеротрофных спутников, основанных на различиях в плотности и размерах клеток (дифференциальное центрифугирование и фильтрование через мембранные фильтры), в чистые культуры были выделены четыре штамма, близкие по морфологии метанотрофам I типа: 5Б (Горбунка, Юго-Восточное Забайкалье), ФМЗ (Хотонтын, Монголия), ЕЗ (Фазда, Египет) и МЛ1 (Моно Лэйк, США).
Штаммы 5Б, ФМЗ, МЛ1 и ЕЗ при росте на твердых средах при 26 С в течение 4-7 дней образуют округлые, выпуклые кремовые колонии размером 2-3 мм с ровными краями и гладкой поверхностью. В жидкой среде клетки способны агрегировать. Специализированные покоящиеся формы не выявлены. Клетки представлены грамотрицательными палочками размером 1.2-3.0 х 0.7-1.3 мкм с одним полярным жгутиком и ВЦМI типа (Рис 4). На поверхности клеток штаммов 5Б обнаружен монослой чашеобразных структур, расположенных регулярно в /?6-симметрии. В отличие от штамма 5Б, у штаммов ФМЗ и МЛ1 найдены глобулярные поверхностные S-слои с р2-симметрией, а у ЕЗ - конусовидные, но также с рб-симметрией
Изоляты 5Б, ФМЗ, ЕЗ и МЛ1 росли в широком диапазоне рН (6.8 - 10.5) и имели близкие рН-оптимумы в щелочной области (8.6 - 9.3). Все изоляты облигатно зависели от присутствия ионов натрия в ростовой среде. Рост на среде с калием вместо натрия в карбонатном буфере и фосфатах отсутствовал. Штаммы не росли на агаризованной среде при нейтральном рН. Изоляты имели различные диапазоны NaCl для роста. Штамм 5Б способен расти в присутствии до 5% NaCl, оптимально при 0.75% NaCl. Штаммы ФМЗ и МЛ1 росли при 6%NaCl, оптимально при 1-1.3% NaCl. Для штамма ЕЗ предельная концентрация NaCl - 9%, оптимум при 0.75% NaCl. У штаммов ЕЗ и 5Б оптимум карбонатов составлял 0.1 М, в присутствии оптимальных концентраций NaCl (0.75 и 1.3%
NaCl, соответственно). У штаммов ФМЗ и МЛ1 оптимум концентрации карбонатов в среде составляет 0.2 М, а максимальная концентрация, поддерживающая рост, составляла 0.8 М. Из полученных данных следовало, что штаммы 5Б, ФМЗ, ЕЗ и МЛ1 являются алкалофильными галотолерантными метанотрофами.
Изоляты - мезофильные метанотрофы с оптимумом температуры 30С. Диапазон температуры от 8 до 37 С, при котором возможен рост, выявлен для штаммов ЕЗ, МЛ1 и 5Б. Диапазон температур роста у штамма ФМЗ составляет 16-37С.
Изоляты не растут на испытывавшихся полиуглеродных субстратах. Единственными источниками углерода и энергии являются метан и метанол. Причем интересной особенностью новых изолятов является способность расти при концентрации метанола до 7 об%. В качестве источников азота используют нитраты, нитриты, триптофан, глутамин, мочевину, казаминовые кислоты и дрожжевой экстракт. При нейтральном значении рН все штаммы используют аммоний в качестве источника азота. Не фиксируют атмосферный азот и; скорее всего, не обладают генами, кодирующими редуктазныи компонент нитрогепазы, т.к. с использованием специфичных праймеров на ген niflJ (Табл.3) не удалось амплифицировать соответствующий ПЦР-фрагмент.
В составе фосфолипидов клеток штамма 5Б преобладают фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерин, обнаружены также фосфатидилсерин и фосфатидная кислота. Количества фосфолипидов зависели от условий культивирования. При увеличении солености среды в клетках штамма 5Б возрастало содержание фосфатидилглицерина, напротив, при снижении солености среды повышался уровень фосфатидилэтаноламина.
В составе жирных кислот изолятов I типа преобладают ненасыщенные гексадеценовые жирные кислоты 16:1со5с, 16:1со7с и 16:1о)11 (15 - 50.98%) (Табл. 8). Выявлено также значительное содержание гексадекановых (Сіб:о) жирных кислот -11-20%. Аналогичное соотношение характерно для метанотрофов рода Methylobacter. У метанотрофов рода Methylomicrobium доминируют 16:lo)5t (20±10), 16:1со7с (17±3) и 16:1со8с (16±3) жирные кислоты (Bowman et al., 1995). Основной убихинон у всех штаммов I типа — Q-8.
Для выделения метанотрофов II типа использовали среду «П» без ионов меди. Данный подход основан на известном факте лимитирования роста метанотрофов I типа по этому катиону, а его отсутствие в среде культивирования может служить селективным фактором для отбора метанотрофов II типа (Graham et al., 1993). Из образцов ила озера Малое Гужирное удалось получить накопительную культуру с преобладанием метанотрофов II типа на разбавленной в 4 раза среде «П» без меди с пониженным содержанием NaHCC 3 (12.5 мМ). На концентрированных средах и при повышении уровня карбонатов в среде рост накопительной культуры значительно ухудшался. В результате серийных разведений в жидких средах был выделен в чистую культуру штамм БЗ.
Накопительная культура, из которой был выделен штамм БЗ, не росла на полной среде «П», в то время как хороший рост наблюдался на разбавленной среде при рН 9.5. Исследование влияния состава среды на потребление метана и рост штамма БЗ показало, что в полной среде «П» ингибирующее влияние оказывали соли СаСІ2 и KNO3. Напротив, MgS04 стимулировал рост и потребление метана. Повышение количества карбонатов в среде также оказывало ингибирующее действие.